微生物學-武漢輕工大學虛擬仿真教學中心課件

微生物學實驗武漢工業(yè)學院生物與制藥工程學院課程組人員:繆禮鴻胡申才代江紅周幗萍曾馳制作人員:胡申才一、課程簡介

微生物學實驗課是微生物學課程教學中的一個重要環(huán)節(jié)。本課程總計48學時，使用教材是沈萍主編的《微生物學實驗》（第三版）。通過本課程的學習，使學生了解微生物學的基本知識；鞏固和加深所學理論知識；掌握微生物學最基本的操作技能。同時，通過實驗，培養(yǎng)學生培養(yǎng)學生獨立思考和理論聯(lián)系實際能力；養(yǎng)成實事求是、嚴肅認真的科學態(tài)度，以及敢于創(chuàng)新的開拓精神；并在實驗中進一步提高學生的科學素質(zhì)修養(yǎng)。二、微生物與實際應用微生物與發(fā)酵工程微生物與環(huán)境工程微生物與農(nóng)業(yè)微生物與醫(yī)學領(lǐng)域微生物與食品工業(yè)三、微生物學與Nobel獎

到目前為止，幾十項Nobel生理學和醫(yī)學獎，化學獎都與微生物學有關(guān)參考：沈萍教授《微生物學》緒論部分

Nobel獲獎者全書四、如何進行微生物學實驗

嚴肅認真科學態(tài)度分析問題搞清原理五、微生物實驗安排與考核基礎(chǔ)實驗：80%，12次，一次考試自主設(shè)計實驗：20%

設(shè)計實驗方案實驗操作總結(jié)匯報課堂紀律嚴格遵守實驗室規(guī)章制度嚴肅課堂紀律不允許無故曠課、早退（1次）遲到（3次）工作服實驗室安全和衛(wèi)生安全實驗室嚴禁吸煙。注意用水、防電和防火正確使用化學試劑和儀器衛(wèi)生每次實驗需留下6位同學值日，協(xié)助保持實驗室清潔實驗一顯微鏡使用及簡單染色實驗二細菌革蘭氏染色實驗三莢膜與芽孢染色實驗四放線菌和藍細菌的形態(tài)觀察實驗五霉菌形態(tài)特征實驗六酵母菌形態(tài)觀察、死活細胞鑒別及細胞大小測定實驗七微生物的數(shù)量測定實驗八玻璃器皿的洗滌、包扎、滅菌及無菌操作臺的使用實驗內(nèi)容實驗九培養(yǎng)基的配制和滅菌實驗十芽孢桿菌的分離純化及觀察實驗十一抗稻瘟霉的芽孢桿菌的分離及篩選實驗十二食品或水中大腸菌群的檢測實驗十三微生物生長曲線的測定實驗十四細菌質(zhì)粒的接合轉(zhuǎn)移與檢測實驗十五微生物菌種保藏技術(shù)顯微鏡概述微生物的個體微小，必須借助顯微鏡才能觀察到。因此，顯微鏡就成為微生物學研究工作者不可缺少的基本工具。所以，了解顯微鏡的種類、結(jié)構(gòu)、功能和正確地掌握不同顯微鏡的使用方法是很有必要的。

顯微鏡可分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。光學顯微鏡有普通光學顯微鏡、相差顯微鏡、微分干涉差顯微鏡、暗視野顯微鏡、紫外光顯微鏡、偏光顯微鏡和熒光顯微鏡。下面主要介紹普通光學顯微鏡。實驗一顯微鏡使用及

微生物形態(tài)觀察一、目的要求1.學習顯微鏡的結(jié)構(gòu)、功能和使用方法。2.學習并掌握油鏡的原理和使用方法?；A(chǔ)知識尼康E-600顯微鏡

二、顯微鏡的基本結(jié)構(gòu)及油鏡的工作原理1.普通生物顯微鏡由3部分構(gòu)成：①照明系統(tǒng)：包括光源和聚光器。②光學放大系統(tǒng)：由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體。③機械裝置：用于固定材料和觀察方便，包括鏡臺(載物臺)、調(diào)節(jié)器和、物鏡轉(zhuǎn)換器(旋轉(zhuǎn)器)。與其他物鏡不同，油鏡需在載玻片與鏡頭之間加滴鏡油，原因有二：增加照明亮度油鏡的放大倍數(shù)可達100x，教具很短，直徑很小，但所需要的光照強度卻最大。為了不使通過的光線有所損失，必須造又精于加入與玻璃的折射率（n=1.55）相仿的鏡油。通常用香柏油（n=1.52）.2.增加顯微鏡的分辨率油鏡的分辨率可達到0.2μm左右。2.顯微操作技術(shù)

尼康NT-88NE顯微操作/注射儀

顯微鏡的分辨率:也稱為分辨力，它是指能把兩個物點辨清的最小距離，分辨距離越大，則分辨率越低。所以，分辨率是以分辨距離來表示的。其計算公式為:D=0.61入/N·AN·A·=n·sina/2

式中D為分辨率，A為光波波長，N·A·為物鏡的數(shù)值孔徑(鏡口率)。

在物鏡上，有鏡口率(N.A.)的標志，它反應該鏡頭分辨力的大小，其數(shù)字越大，表示分辨率越高，各物鏡的鏡口率如下表：物鏡鏡口率(N.A.)工作距離(mm)10×0.255.4040×0.650.39100×1.300.11顯微鏡的總放大倍數(shù)等于目鏡和物鏡放大倍數(shù)的乘積，公式為:M=K1xK2

焦點深度:顯微鏡調(diào)焦到看清標本某一點時，不僅是這一物點，而且它的上下兩側(cè)也能看清楚兩側(cè)的厚度叫做焦點深度?？吹綐吮镜娜穸龋仨氄{(diào)節(jié)螺旋仔細地從上到下進行觀察。三、實驗步驟

(一)顯微鏡的使用1.觀察前的準備工作

(1)觀察者要養(yǎng)成顯微鏡鏡檢的工作習慣，觀察時要雙眼同時睜開，一邊觀察一邊進行記錄或描繪。

(2)觀察時所用的材料、藥品和各種器具要預先準備好。

(3)顯微鏡在使用之前應檢查一下它的各個部件是否完整和正常，并對載物臺、目鏡、物鏡以及聚光器上端透鏡進行必要的清潔工作。然后進行合軸調(diào)節(jié)。瞳距調(diào)節(jié)2.顯微鏡的調(diào)節(jié)屈光度調(diào)節(jié)調(diào)節(jié)粗調(diào)松緊調(diào)節(jié)旋鈕聚光鏡中心調(diào)節(jié)⑤光軸中心調(diào)節(jié)螺釘③視場光欄③孔徑光欄②10X物鏡①標本④聚光鏡升降旋鈕孔徑光欄調(diào)節(jié)N.A聚=(0.6-0.8)N.A物操作步驟如下:(1）可變光欄的中心對準聚光鏡的中心。如果可變光欄的水平是固定的，則裝配時已保證它與聚光鏡合軸，不必調(diào)整;如果可變光欄的水平位置可以移動，則應把可變光欄關(guān)到最小，使它的中心孔對準聚光鏡下方的透鏡中心。

(2)載物臺上放置觀察標本，把聚光器上升到它上端透鏡平面稍低于載物臺平面的高度，并將它的可變光欄開到最大，用低倍物鏡，進行調(diào)焦到能看見標本，可調(diào)反射鏡使視野得到最亮和最均勻的照明，或把光欄關(guān)小，最亮的照明區(qū)正處在視野的中央。

(3)轉(zhuǎn)到高倍鏡，并調(diào)焦到看清標本，然后去掉標本，拔出目鏡，眼睛直接向鏡筒觀察，并把可變光欄關(guān)小，看其亮點是否在視野中心，如果不是，就要轉(zhuǎn)動聚光器的調(diào)節(jié)螺旋，把亮點調(diào)到視野中央，再慢慢開啟可變光欄，使視野看到光欄邊緣和聚光鏡的邊緣相接為止。3.觀察操作(1)低、高倍鏡的使用:先把低倍的物鏡用粗調(diào)焦螺旋下降至離蓋玻片0.5cm處，然后一邊觀察視野一邊上升物鏡，直至看到圖像，再將標本移到視野中心，用細調(diào)焦螺旋把物鏡調(diào)至最清晰處，若要用高倍鏡觀察時，把所要進一步放大觀察的部位移至視野中央，直接順時針轉(zhuǎn)換成高倍物鏡，然后用細調(diào)焦螺旋調(diào)焦，至看清物像。

（1）不準擅自拆卸顯微鏡的任何部件,以免損壞。（2）鏡面只能用擦鏡紙擦，不能用手指或粗布，以保證光潔度（3）觀察標本時，必須依次用低、中、高倍鏡，最后用油鏡。當目視接目鏡時，特別在使用油鏡時，切不可使用粗調(diào)節(jié)器，以免壓碎玻片或損傷鏡面。（4）拿顯微鏡時，一定要右手拿鏡臂，左手托鏡座，不可單手拿，更不可傾斜拿。（5）顯微鏡應存放在陰涼干燥處，以免鏡片滋生霉菌而腐蝕鏡片。4、顯微鏡保養(yǎng)和使用中的注意事項（二）簡單染色1.定義

是只用一種染料使細菌著色以顯示其形態(tài)，不能辨別細菌細胞的構(gòu)造，通常采用堿性染料（如美藍、結(jié)晶紫、堿性復紅等）使其著色。Simplestains菌種：培養(yǎng)12-16h的枯草桿菌（Bacillussubtilis），培養(yǎng)24小時的大腸桿菌（Escherichiacoli）

染色液和試劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅染液、復紅、乙醚酒精溶液、香柏油、無菌水器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。2.實驗器材1、簡單染色3.實驗方法：制片→染色→水洗→干燥→鏡檢（1）制片：取菌種培養(yǎng)物常規(guī)涂片、自然干燥、加熱固定；注意無菌操作（2）染色：將固定過的涂片放在廢液缸上的擱架上，加復紅染色1-2min。（3）水洗：用水洗去涂片上的染色液。（4）干燥：將洗過的涂片放在空氣中晾干或用吸水紙吸干。（5）鏡檢：先低倍觀察，再高倍觀察，并找出適當?shù)囊曇昂?，將高倍鏡轉(zhuǎn)出，在涂片上加香柏油一滴，將油鏡頭浸入油滴中仔細調(diào)焦觀察細菌的形態(tài)。四、記錄實驗結(jié)果繪圖五、思考題1.使用油鏡時，為使么選用香柏油或液體石蠟作為物鏡與玻片間的介質(zhì)？其他液體行嗎？2.油鏡用畢后，為什么必須把鏡油擦凈？用過多的二甲苯或用酒精擦鏡有什么危害？3.什么是物鏡的同焦現(xiàn)象？他在顯微鏡觀察中有什么意義？4.觀察時為什么要用左眼，并且兩眼都應睜開？（一）實驗目的（二）實驗原理（三）實驗器材（四）實驗方法（五）注意事項（六）實驗作業(yè)實驗二細菌革蘭氏染色（一）實驗目的1、學習微生物涂片、染色的操作技術(shù)；2、掌握細菌單染色和革蘭氏染色的方法；3、初步掌握無菌操作技術(shù)；4、掌握革蘭氏染色反應原理、操作步驟和意義。1.革蘭氏染色法

是1884年由丹麥病理學家C.Gram所創(chuàng)立的。革蘭氏染色法是細菌學上最常用的鑒別染色法，因為通過此法染色，可將細菌鑒別為革蘭氏陽性菌（G+）和革蘭氏陰性菌（G-）兩大類。（二）實驗內(nèi)容及原理1234？結(jié)晶紫碘液酒精復紅革蘭氏染色的機理：

主要由于兩類細菌的細胞壁成分和結(jié)構(gòu)不同。1、菌種：培養(yǎng)12-16h的枯草桿菌（Bacillussubtilis），培養(yǎng)24小時的大腸桿菌（Escherichiacoli）

2、染色液和試劑：草酸銨結(jié)晶紫染液、盧哥氏碘液、95%酒精、蕃紅染液、復紅、乙醚酒精溶液、香柏油、無菌水3、器材：廢液缸、洗瓶、載玻片、接種杯、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。（三）實驗器材1、革蘭氏染色制片→初染（結(jié)晶紫1min）→水洗→媒染（碘液1min）→水洗→脫色（乙醇20-30s）→水洗→復染（番紅2min）→水洗→干燥→觀察(四）實驗方法：crystalvioletstainwashwithwater

Stainwithgram'siodinesolution

Decolorizebyadding95%alcohol

革蘭氏陰性桿菌革蘭氏陽性桿菌

CounterstainwithSafranin

①將浸過油的鏡頭按下述方法擦拭干凈：a.先用擦鏡紙將油鏡頭上的油擦去。b.用擦鏡紙沾少許乙醚-乙醇混合液將鏡頭擦2-3次。c.再用干凈的擦鏡紙將鏡頭擦2-3次。注意擦鏡頭時向一個方向擦拭。將顯微鏡小心輕拿，按號放入顯微鏡柜中。

②觀察后的染色玻片用廢紙將香柏油擦干凈，放入回收容器內(nèi)。（10）實驗完畢后的處理1、載玻片要潔凈無油跡。涂片時，滴水不要過多，挑菌量宜少，涂片要均勻，菌膜宜薄。2、革蘭氏染色成敗的關(guān)鍵是酒精脫色。？（五）注意事項3、染色過程中勿使染色液干涸。4、選用幼齡的細菌。（六）實驗作業(yè)

繪出枯草桿菌和大腸桿菌的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應性。1．你認為哪些環(huán)節(jié)會影響革蘭氏染色結(jié)果的正確性？其中最關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是什么？

2．當你對一株未知菌進行革蘭氏染色時，怎樣能確證你的染色技術(shù)操作正確，結(jié)果可靠？（一）實驗目的（二）實驗原理（三）實驗器材（四）實驗方法（五）注意事項（六）實驗作業(yè)實驗三細菌的芽孢和莢膜染色（一）實驗目的1、繼續(xù)學習微生物標本的制作方法；2、掌握芽孢、莢膜染色的基本原理及方法;3、鞏固無菌操作技術(shù)。（二）實驗原理

芽孢、莢膜染色法都是利用細菌各部位（分）的構(gòu)造不同，它們對染料的親和力也不同。因此，可以采用各種特殊染色方法，使細菌細胞的不同構(gòu)造能在顯微鏡下顯示出來，便于觀察和區(qū)別。

芽孢又稱內(nèi)生孢子（endospore），是某些細菌（革蘭氏染色陽性桿菌）生長到一定時間（對數(shù)期后期），在細胞內(nèi)形成一個圓形、橢圓形或圓柱形的結(jié)構(gòu)。

芽孢有的長在中央或近中央，圓形或橢圓形，芽孢的大小，位置，在分類鑒定上有一定的意義，它僅僅是芽孢細菌生活史的一個環(huán)節(jié)，它還是檢驗培養(yǎng)基滅菌徹底不徹底的依據(jù)。中央芽孢偏端芽孢游離芽孢末端芽孢芽孢染色原理

芽孢壁厚、透性低，著色和脫色均較困難，當用弱堿性染料（孔雀綠）在加熱的情況下進行染色時，使染料不僅進入菌體也可進入芽孢內(nèi)，進入菌體的染料經(jīng)水洗后被脫色，當用對比度大的復染色劑（蕃紅液）染色后，芽孢仍保留初染劑的顏色，是芽孢和菌體更易區(qū)分。菌體呈紅色而芽孢呈綠色。莢膜是包圍在細菌細胞外的一層粘液狀或膠狀物質(zhì)，其成分為多糖、糖蛋白或多肽。由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可以溶于水，易在用水沖洗時被除去。

莢膜雖不是細胞的主要結(jié)構(gòu)，但它是細胞外碳源和能源性貯藏物質(zhì)，并能保護細胞免受干燥的影響，同時能增加某些病原菌的致病能力，使之抵御宿主吞噬細胞的吞噬。莢膜染色原理

由于莢膜與染料的親和力弱、不易著色；而且可以溶于水，易在用水沖洗時被除去。通常用負染色法染色，使細菌和背景著色，背景與菌體之間形成一透明區(qū)即莢膜，便于觀察，由于莢膜很薄，容易變形，在制片是一般不用加熱固定。

1、菌種：蠟樣芽孢桿菌約2d營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物；褐球固氮菌(Azotobacterchroococcus)約2d無氮營養(yǎng)基瓊脂斜面培養(yǎng)物。2、染色液和試劑：5％孔雀綠水溶液、0.5％蕃紅溶液、碳素墨水、甲醇、生理鹽水等；3、器材：試管夾、酒精燈、接種針、載玻片、顯微鏡、香柏油、乙醚酒精、擦鏡紙等。（三）實驗器材制片→染色（孔雀綠5min）→水洗→復染（蕃紅花紅2-3min）→水洗→干燥→鏡檢1、芽孢染色(四）實驗方法：切勿煮干芽孢染色結(jié)果（芽孢呈綠色，營養(yǎng)體及芽孢囊呈紅色）2、莢膜染色（濕墨水法）（1）制備菌和墨水混合液：加一滴墨水于潔凈的載玻片上，然后挑取少量褐球固氮菌與之充分混合均勻；（2）加蓋玻片：將一潔凈蓋波片蓋在混合液上，然后在蓋波片上放一張濾紙，輕輕按壓以吸去多余的混合液；（3）鏡檢：用低倍鏡和高倍鏡觀察。莢膜染色結(jié)果背景灰色，菌體較暗，在其周圍呈現(xiàn)一明亮的透明圈即莢膜。1、供芽孢染色用的菌種應控制菌齡，使大部分芽孢仍保留在菌體上為宜。2、染色加熱過程要及時補充染液，切勿讓涂片干涸。3、莢膜染色涂片不要用加熱固定，以免莢膜皺縮變形。4、涂片不要用力過猛，不要滴加水，以防破壞其莢膜原形。（五）注意事項（六）實驗作業(yè)1．繪出表示芽孢桿菌的形態(tài)特征，注意芽孢的形狀、著生位置及芽孢囊的形態(tài)特征。

2．繪圖說明你所觀察到的細菌的菌體和莢膜的形態(tài)。1．若涂片中觀察到的只是大量游離芽孢，很少看到芽孢囊及營養(yǎng)細胞，你認為這是什么原因?2．組成莢膜的成分是什么?涂片一般用什么固定方法，為什么?實驗四放線菌和藍細菌形態(tài)的觀察目的要求實驗材料實驗程序思考題一、目的要求學習觀察放線菌的基本方法加深理解放線菌的形態(tài)特征二、實驗原理群體和個體形態(tài)形態(tài)觀察方法I放線菌形態(tài)的觀察FilamentousActinomycetesTypicalappearanceofastreptomycetegrowingonagarslantsThecolorsareduetotheproductionofpigmentsFilamentousActinomycetesAntibioticactionofsoilmicroorganismsonacrowdedplatestreptomycetesBacillusFilamentousActinomycetesStagesintheconversionofastreptomycete’s(鏈霉菌)aerialhyphaintospores(conidia)Varioustypesofspore-bearingstructuresinthestreptomycetesFilamentousActinomycetesSeveralspore-bearingstructuresofactinomycetes:Streptomyces.FilamentousActinomycetesAyoungcolonyofanactinomyceteofthegenusNocardia(奴卡(氏)(放線)菌屬)1、插片染色法28℃插片培養(yǎng)4-6d，輕輕取出蓋玻片，直接觀察鏡檢。觀察菌絲和孢子絲自然生長的性狀，其中包括氣生菌絲（較粗）、基內(nèi)菌絲（較細）和孢子絲的形狀，如分枝狀況及孢子絲的卷曲等，并繪圖說明。首先尋找插在培養(yǎng)基的界面分界線，觀察營養(yǎng)菌絲、氣生菌絲形態(tài)及分枝情況。調(diào)節(jié)亮度直接鏡檢

（二）觀察方法2.印片染色法微熱載玻片－印片－固定－石炭酸復紅染色1min－水洗－晾干－油鏡三、實驗材料放線菌培養(yǎng)物：天藍色鏈霉菌4天培養(yǎng)物。顯微鏡、載玻片、接種環(huán)、解剖針、解剖刀、酒精燈、鑷子等。酒精、蒸餾水等。四、實驗步驟1.印片法：（1）接種培養(yǎng)用高氏1號培養(yǎng)基平板，常規(guī)劃線接種，28℃下培養(yǎng)4-7天。（2）印片用滅菌的小刀(或刀片)挑取有單一菌落的培養(yǎng)基一小塊，放在潔凈的載玻片上。用鑷子取一潔凈載玻片，在火餡上稍微加熱，然后把玻片蓋放在帶菌落的培養(yǎng)基小塊上，再用小鑷子輕輕壓幾下，使菌落的部分菌絲體（氣生菌絲，孢子絲或孢子）壓在載玻片上。（3）固定：載玻片有印跡的一面向上，通過酒精燈火焰三次固定。（4）染色用石炭酸復紅覆蓋印跡，染色1-2min后水洗。（5）鏡檢干后用油鏡觀察。1.異形胞是由營養(yǎng)細胞組成的，一般比營養(yǎng)細胞大，在光學顯微鏡下觀察，細胞內(nèi)是空的。形成異形胞時，細胞內(nèi)的貯藏顆粒溶解，光合作用片層破碎，形成新的膜，同時分泌出新的細胞壁物質(zhì)于細胞壁外邊。與營養(yǎng)細胞的區(qū)別是：壁厚；細胞質(zhì)中的顆粒物質(zhì)溶解，呈均勻狀態(tài)；原來的類囊體膜解體，形成新膜；顏色呈淡黃色或透明狀。異形胞的功能：一是將藻絲細胞分隔成藻殖段進行營養(yǎng)繁殖；二是細胞內(nèi)含固氮酶，可直接固定大氣中的氮。II藍細菌形態(tài)的觀察異形胞厚壁孢子思考題在用插片法觀察氣生菌絲和孢子絲的形態(tài)時，要注意些什么？一、實驗目與基本要求：學習并掌握觀察霉菌形態(tài)的基本方法，了解常見霉菌的基本特征。二、實驗內(nèi)容：

1．觀察霉菌菌落形態(tài)。

2．用顯微鏡觀察霉菌裝片。

3．制作霉菌裝片并觀察其形態(tài)。實驗五霉菌形態(tài)特征三、實驗步驟（一）菌落特征的觀察用肉眼觀察生長在瓊脂平板上的各種霉菌菌落，并根據(jù)下列要求對每種霉菌的菌落特征加以描述。

1.菌落的大小：局限生長或蔓延生長，菌落的直徑和高度。

2.菌落的顏色：正面和背面的顏色，培養(yǎng)基的顏色變化。

3.菌落的形態(tài)：棉絮狀、網(wǎng)狀、疏松或緊密、同心輪紋、放線狀的皺褶等。霉菌菌落各種曲霉的菌落各種病原真菌的菌落青霉的菌落青霉的菌落霉菌菌絲A、無隔菌絲B有隔菌絲隔膜（二）個體形態(tài)特征的觀察1.乳酸石炭酸制片法觀察

（1）制片：在干凈的載玻片上加一滴乳酸石炭酸，用接種針從菌落邊緣處取小量帶有孢子的菌絲置于液體中，再小心地把菌絲放開，然后用蓋玻片蓋上，注意不要產(chǎn)生氣泡。（2）鏡檢：

1）毛霉和黑根霉的孢子的形狀、顏色、大小、孢子囊、中軸體的形狀，有無假根和葡萄菌絲。

2）黑曲霉的分生孢子的形狀、顏色、大小、頂囊的形狀、小梗排列隔膜。

3）青霉的分生孢子的形狀、顏色、大小、小梗的排列方式，菌絲的隔膜。

（3）將觀察結(jié)果繪圖，并注意各部分名稱。霉菌的靜孢子

左：毛霉的孢子囊；中：孢子囊壁破裂，露出靜孢子；右：囊軸

曲霉的分生孢子梗和頂囊上的分生孢子青霉的帚狀分生孢子梗和分生孢子曲霉的分生孢子頭彩圖霉菌的厚垣孢子2.插片培養(yǎng)觀察：

（1）插片培養(yǎng)：將已滅菌的蓋玻片斜插入培養(yǎng)基平板上，一半露在外面，然后沿蓋玻片與培養(yǎng)基交接處接種霉菌孢子懸液。24到26度恒溫培養(yǎng)2到4天。

（2）制片、鏡檢：以無菌操作取下蓋玻片，有菌面朝下，放在滴有一滴棉蘭染液的載玻片上。四、實驗報告繪制鏡檢形態(tài)圖

1．毛霉和根霉形態(tài)圖，示各部。

2．青霉和曲霉形態(tài)圖，示各部五、問題和思考

1．什么叫載玻片濕室培養(yǎng)?它適用于觀察怎樣的微生物，有何優(yōu)點?2．濕室培養(yǎng)時為何用20%甘油作保濕劑?

實驗六酵母菌的形態(tài)觀察、死活鑒別及大小測定I

酵母菌的形態(tài)觀察及死活鑒別（一）實驗目的（二）實驗原理（三）實驗器材（四）實驗方法（五）注意事項（六）實驗作業(yè)（一）實驗目的1、觀察酵母菌的細胞形態(tài)及出芽生殖方式；2、學習掌握區(qū)分酵母菌死、活細胞的染色方法；3、掌握酵母菌的一般形態(tài)特征及其與細菌的區(qū)別。（二）實驗原理

酵母菌是多形的、不運動的單細胞真核微生物。無性繁殖主要是出芽生殖。

本實驗通過用美藍染色浸片來觀察生活的酵母形態(tài)和出芽生殖方式。美藍（氧化型）藍色美藍（還原型）無色還原劑氧化劑

美藍是一種無毒性染料，它的氧化型是藍色的，而還原型是無色的，用它來對酵母的活細胞進行染色。死活細胞鑒別原理美藍（氧化型）藍色美藍（還原型）無色酵母活細胞新陳代謝還原能力1、菌種：釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）培養(yǎng)約2d的麥芽汁斜面培養(yǎng)物；2、染色液和試劑：0.05％和0.1%呂氏堿性美藍染液；3、器材：廢液缸、載玻片、蓋玻片、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡等。（三）實驗器材在載玻片中央加一滴0.1％呂氏堿性美藍染色液，用接種環(huán)挑取少量酵母菌苔放入上述液滴里，混合均勻；用鑷子取一塊蓋玻片，先將一邊與菌液接觸，然后慢慢將蓋玻片放下使其蓋在菌液上；(四）實驗方法（美藍浸片）染液不宜過多或過少蓋玻片不宜平著放下將制片放置約3min，先低倍鏡后高倍鏡觀察酵母形態(tài)和出芽情況，并根據(jù)顏色區(qū)別死活細胞。染色30min后再次觀察，注意死活細胞數(shù)量的變化；用0.05％的呂氏堿性美藍染色液重復上述操作。1、加染液不宜過多或過少，否則，在蓋上蓋玻片時，菌液會溢出或出現(xiàn)大量氣泡而影響觀察；2、蓋玻片不宜平著放下，以免產(chǎn)生氣泡影響觀察。（五）注意事項一、實驗目的1）學習用測微尺測量微生物細胞大小。2）掌握臺鏡測微尺和目鏡測微尺的使用方法。------顯微鏡測微技術(shù)

II酵母細胞大小測定二、材料與儀器1、釀酒酵母2、顯微鏡、物鏡測微尺、目鏡測微尺微生物細胞大小，是其形態(tài)特征重要標志之一。每一種微生物在一定條件下，有其相對固有的大小形態(tài)。它是分類鑒定的依據(jù)之一。其大小測定可用測微尺測量。測微尺分為目鏡測微尺和物鏡測微尺兩部分。三、基本原理

目鏡測微尺：是一塊可以放入接目鏡內(nèi)的特定圓形玻璃片。玻片中央是一個細長帶刻度的尺，等分成50或100小格，每個等分線間距為0.1mm。由于不同顯微鏡的放大倍數(shù)不同，故目鏡測微尺每格實際代表長度隨顯微鏡的不同而不同。因此在使用前必須用物鏡測微尺校正，以求得在一定接物鏡及目鏡等光學系統(tǒng)下，目鏡測微尺每格所代表的實際長度。

物鏡測微尺是一塊中央部分刻有精確等分線的載玻片。每一刻度間距為10um即把1mm等分為100格，是專門為校正目鏡測微尺實際數(shù)值用的。四、方法與步驟1、目鏡測微尺的校正1）將目鏡測微尺裝入目境內(nèi)，刻度朝下，并將物鏡測微尺朝上置載物臺上。2）用低倍鏡核對，至能清晰看到物鏡測微尺。3）改用高倍鏡或油鏡對焦后，轉(zhuǎn)動目鏡，使目鏡測微的刻度和物鏡測微尺刻度平行。4)兩尺吻合后，先使兩尺的一端某一刻度完全重合，然后再尋找另一端第二條重疊的刻度。5)計下兩吻合刻度間，目鏡測微尺與物鏡測微尺的格數(shù)。按下列公式算出目鏡測微尺每小格所代表長度。目鏡測微尺每格長度（微米）兩吻合刻度間物鏡測微尺格數(shù)×10μm=

兩吻和刻度間目鏡測微尺格數(shù)例如：目鏡測微尺的5格等于物鏡測微尺的2格，則目鏡測微尺1格=（2×10）/5=4微米目鏡測微尺安裝方法目鏡測微尺目鏡測微尺一鏡臺測微尺及其中央部分的放大鏡臺測微尺校準目鏡測微尺時的情況2、酵母細胞大小測定：1）制作酵母水浸片2)取下鏡臺測微尺，將“水浸片”標本置于載物臺上。3）先用低倍鏡觀察到目標后，轉(zhuǎn)換高倍鏡測量酵母的大小，測量10—20個菌體，求出其平均值。四、測量結(jié)果記錄：在高倍鏡下：目鏡測微尺——格=物鏡測微尺——格目鏡測微尺1格=微米酵母細胞長度=目鏡測微尺平均——格=——微米寬度=目鏡測微尺平均——格=——微米注：要求測量10個酵母細胞的平均值五、實驗作業(yè)

繪圖說明你所觀察到的酵母菌的細胞結(jié)構(gòu)及出芽生殖方式。1、呂氏堿性美藍染液濃度和作用時間的不同，對酵母菌死細胞數(shù)量有何影響？試分析其原因。

2、為何更換不同倍數(shù)目鏡和物鏡時，必須要重新標定？第七章微生物的數(shù)量測定I顯微鏡直接計數(shù)法II稀釋涂布法（一）實驗目的（二）實驗原理（三）實驗器材（四）實驗方法I顯微鏡直接計數(shù)法（一）實驗目的1、了解顯微鏡計數(shù)的原理；2、學習并掌握使用血球計數(shù)板進行微生物直接計數(shù)的方法。（二）實驗原理

利用血球計數(shù)板在顯微鏡下直接計數(shù)，是微生物實驗中一種十分重要的常用微生物計數(shù)方法。此法的優(yōu)點是直觀、快速，不論微生物的生理狀況如何，都可以在顯微鏡下一一計數(shù)。由于此法得到的是活菌和死菌的總和，故又稱為總菌計數(shù)法。

血球計數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上四條縱槽構(gòu)成了三個平臺，中間的平臺又被一短橫槽隔成兩半，每一邊的平臺上各刻有一個方格網(wǎng)，每個方格網(wǎng)共分成9個大方格，中央的大方格為計數(shù)室。計數(shù)室邊長1mm，共有400個小方格，加蓋玻片于突起部分上時，即形成一個體積為0.1mm3的計數(shù)室。計數(shù)室的規(guī)格有兩種：一種是25個中方格×16個小格，另一種是16個中方格×25個小格，所以小方格的總數(shù)是相同的，都為400個。在計數(shù)時，通常數(shù)五個中方格的總菌數(shù)，然后求得每個中方格的平均值，再乘上16或25，就得出一個大方格中的總菌數(shù)，然后再換算成1ml菌液中的總菌數(shù)。如果設(shè)五個中方格的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，那么，一個大方格中的總菌數(shù)即（0.1mm3中的總菌數(shù)）為A／5×16(或25)×B。所以1ml菌液中的總菌數(shù)=A／5×16（或25）×10×1000×B。（三）實驗器材1.菌種

釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae）菌懸液2.器具

顯微鏡、血球計數(shù)板、酒精燈、接種環(huán)、無菌水、吸管、蓋玻片、計數(shù)器。（四）實驗方法1.稀釋

將釀酒酵母菌懸液進行適當稀釋，菌液如不濃，可不必稀釋。2.鏡檢計數(shù)室

在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。若有污物，則需清洗后才能進行計數(shù)。

3．加樣品

將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的細口滴管將稀釋的釀酒酵母菌液由蓋玻片邊緣滴一小滴（不宜過多）讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自行進入計數(shù)室，一般計數(shù)室均能充滿菌液。注意不可有氣泡產(chǎn)生。4.顯微鏡計數(shù)

靜置幾分鐘，將計數(shù)板放在顯微鏡下，先用低倍鏡找到計數(shù)室，再換成高倍鏡進行計數(shù)；每個計數(shù)室選右上右下、左上左下和中間的五個中方格中的菌體進行計數(shù)，每個樣品重復計數(shù)兩次5.清洗血球計數(shù)板

計數(shù)完畢，將計數(shù)板在水龍頭下沖洗干凈后自行晾干或用吹風機吹干，鏡檢觀察每小格內(nèi)無殘留物為止。

注意事項1、加樣時先搖勻菌液，計數(shù)室中不可有氣泡產(chǎn)生；2、計數(shù)時，格線上的菌體只數(shù)上方和右邊線上的；3、如遇酵母出芽，芽體大小達到母細胞的一半時，作為兩個菌體計算；4、清洗計數(shù)板時切勿用手或硬物刷洗。II稀釋涂布法（一）實驗原理（二）實驗方法實驗方法1、倒平板：每皿約15ml，2、編號：對平板和稀釋用試管分別編號。3、稀釋：放菌液時吸管尖不要碰到液面，即每一支吸管只能接觸一個稀釋度的菌懸液，否則稀釋不精確，結(jié)果誤差較大。4、取樣：選擇合適的三個稀釋度，用三支無菌吸管分別吸取三個稀釋度的菌懸液，對號放入編好號的無菌平皿中。不要用1ml吸管每次只靠吸管尖部吸0.2ml稀釋菌液放入平皿中，這樣容易加大同一稀釋度幾個重復平板間的操作誤差。5、涂布：用滅過菌的涂布棒將菌懸液均勻涂布在平皿表面。涂完后，旋轉(zhuǎn)90度再涂布。以上倒平板、稀釋、涂布均要進行無菌操作6、計數(shù)：培養(yǎng)48小時后，取出培養(yǎng)平板，一般選擇每個平板上有30—300個菌落的稀釋度計數(shù)。算出同一稀釋度三個平板上的菌落平均數(shù)，并按下列公式計算：每毫升中菌落形成單位（cfu）=同一稀釋度三次重復的平均菌落數(shù)×稀釋倍數(shù)×5

計數(shù)室各格中菌數(shù)

總菌數(shù)

稀釋度菌數(shù)/ml平均值12345第一室第二室顯微直接計數(shù)結(jié)果(五)作業(yè)一、實驗目的

1.掌握玻璃器皿的洗滌和包扎方法；2.了解玻璃器皿的滅菌方法和原理；3.了解無菌操作臺的使用。實驗八玻璃器皿的洗滌、包扎、滅菌及無菌操作臺的使用二、實驗原理微生物學實驗所用的器皿，大多要進行消毒、滅菌和用來培養(yǎng)微生物，因此對其質(zhì)量、洗滌和包裝方法均有一定的要求。清潔的玻璃器皿是實驗得到正確結(jié)果的先決條件，包扎方法要能保證防止污染雜菌?？盏牟Ａ髅笠话阌酶蔁釡缇?，若用濕熱滅菌，則要多用幾層報紙包扎。三、實驗器材

試管、培養(yǎng)皿、吸管、棉花、包扎繩、三角瓶、電熱烘箱等。四、操作步驟

（一）玻璃器皿的洗滌方法1、新玻璃器皿的洗滌在2%的鹽酸溶液中浸泡數(shù)小時，用自來水沖洗干凈。2、舊玻璃器皿的洗滌（1）試管、培養(yǎng)皿、三角瓶：洗衣粉和去污粉洗刷，自來水沖洗裝有固體培養(yǎng)基：刮掉，洗滌帶菌的器皿：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時或煮沸0.5小時，然后洗滌帶病原菌培養(yǎng)物的器皿：先高壓蒸汽滅菌，倒去培養(yǎng)物后在洗滌（2）玻璃吸管：吸管尖端與裝在水龍頭上的橡皮管連接，反復沖洗吸過血液、血清、糖溶液或染料溶液等的玻璃吸管：立即投入盛有自來水的容器中浸泡，實驗后集中沖洗。塞有棉花的吸管：用水將棉花沖出，然后沖洗吸過含有微生物培養(yǎng)物的吸管：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時然后洗滌吸管內(nèi)壁有油垢：洗滌液中浸泡數(shù)小時，再沖洗（3）載玻片與蓋玻片帶有香柏油：用皺紋紙擦或在二甲苯中搖晃幾次，然后在肥皂水中煮沸5-10分鐘，用軟布或脫脂棉擦拭，立即用自來水沖洗，然后在稀洗滌液中浸泡0.5-2小時，自來水沖洗，干后在95%乙醇中保存?zhèn)溆?。檢查過活菌的：2%來蘇爾或0.25%新潔爾滅消毒液中浸泡24小時然后按上述方法洗滌。（二）玻璃器皿的包扎1、培養(yǎng)皿的包扎：一般以5-8套培養(yǎng)皿做一包2、吸管的包扎：準備好干燥的吸管，在距其粗頭頂端約0.5cm處，塞一小段1.5cm長的棉花，然后將吸管尖端斜放在舊報紙條的近左端，與報紙成30度角，并將左端多余的一段紙覆折在吸管上，再將整根吸管卷入報紙，右端多余的報紙打一小結(jié)。3、試管和三角瓶等的包扎：試管口和三角瓶口用棉花塞或泡膜塑料塞，然后在棉花塞與管口和瓶口的外面用二層報紙與細線扎好。（三）滅菌

滅菌是指應用物理或化學的方法，殺滅物體表面和內(nèi)部一切微生物營養(yǎng)體、芽孢和孢子。滅菌方法很多，可分為加熱、過濾、照射和化學藥品法等。常用加熱滅菌法：1、干熱滅菌：用火焰燒灼或電熱干燥箱內(nèi)高溫熱空氣滅菌2、濕熱滅菌⑴高壓蒸汽滅菌法⑵間歇滅菌法⑶煮沸消毒法1、干熱滅菌法A、原理：利用干的熱空氣使微生物細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達到滅菌的目的。B、操作方法：裝入待滅菌物品→關(guān)門→升溫→恒溫→降溫→開箱取物。C、滅菌條件：160-170℃，1-2小時。

2.高壓蒸汽滅菌，1210C滅菌20分鐘。（四）無菌操作臺的使用垂直送風水平送風保持空間無菌操作紫外殺菌內(nèi)外壓力差五、結(jié)果記錄（略）六、思考題玻璃器皿干熱滅菌時應該注意哪些問題，為什么？（一）實驗目的（二）實驗原理（三）實驗器材（四）實驗方法（五）實驗作業(yè)實驗九培養(yǎng)基的配制和滅菌（一）實驗目的1、明確培養(yǎng)基的配制原則；2、掌握配制培養(yǎng)基的一般方法和步驟；3、了解高壓蒸汽滅菌的基本原理及應用范圍；4、掌握高壓蒸汽滅菌技術(shù)，了解幾種常用滅菌方法。（二）實驗原理

培養(yǎng)基是按照微生物生長繁殖或積累代謝產(chǎn)物所需的各種營養(yǎng)物質(zhì)，用人工方法配制而成的一種基質(zhì)。它包括碳源、氮源、能源、生長因子、無機鹽和水六類營養(yǎng)要素。由于不同微生物細胞組成不同，因而所需營養(yǎng)基質(zhì)不同，為了分離、培養(yǎng)和鑒定不同的微生物，必須根據(jù)其需要，配制合適的培養(yǎng)基.

培養(yǎng)基的種類繁多，根據(jù)培養(yǎng)基的成分、物理性狀不同，可分為天然培養(yǎng)基、合成培養(yǎng)基、半合成培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基。（三）實驗器材1.藥品和試劑：牛肉膏、蛋白胨、NaCl、10％NaOH溶液、10％鹽酸溶液。2.器材：天平、藥匙、瓷缸、玻璃棒、電爐、PH試紙、試管、三角瓶、分裝漏斗、牛皮紙、棉花、線繩、干燥箱、高壓鍋。1.稱量

按照培養(yǎng)基配方，準確稱量各成份放于瓷缸中。配方：牛肉膏5.0g,蛋白胨10.0g，NaCl5.0g,瓊脂20.0g,蒸餾水1000ml,pH7.0。（四）實驗方法

培養(yǎng)基的制備過程

稱量---溶解----調(diào)節(jié)pH值----過濾----分裝及包扎----滅菌----滅菌后試管擺放斜面2.溶解向上述瓷缸中加入所需要的水量，攪拌，加熱使其溶解。如是配制固體培養(yǎng)基，在瓊脂的熔化過程中，需不斷攪拌，并控制火力不要使培養(yǎng)基溢出或燒焦。待完全熔化后，補足所失水分。3.調(diào)節(jié)pH值用玻璃棒沾少許液體，測量PH值。用氫氧化鈉和鹽酸調(diào)節(jié)PH。4.過濾

用濾紙或多層紗布過濾，一般無特殊要求可省去。5.分裝及包扎根據(jù)不同的需要，可將制好的培養(yǎng)基分裝入試管內(nèi)（用分裝漏斗）或三角瓶內(nèi)，管（瓶）口塞上棉塞。最后用牛皮紙將棉塞部分包好。6.滅菌后試管擺放斜面注意事項1、稱取藥品時嚴防藥品混雜，一把牛角匙稱一種藥品；2、蛋白胨極易吸濕，稱取時動作要迅速；2、配制固體培養(yǎng)基時，先將其他藥品加熱溶解到快沸時，再將稱好的瓊脂加入，繼續(xù)加熱至瓊脂完全熔化，此過程要不斷攪拌，以免瓊脂糊底，并控制火力，防止沸騰外溢；4、分裝量根據(jù)試管大小和實際需要而定，固體培養(yǎng)基裝量約為管高的1/5，液體培養(yǎng)基的裝量約為管高的1/4，三角瓶的裝量不超過瓶體的1/2；5、分裝過程中注意不要將培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上，以免沾污棉塞而引起污染。返回（五）實驗作業(yè)1.思考牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基屬于何種培養(yǎng)基？2.為什么濕熱滅菌比干熱滅菌法更有效？（一）實驗目的（二）實驗原理（三）實驗器材（四）實驗方法（五）實驗作業(yè)實驗十芽孢桿菌的分離純化及觀察（一）實驗目的1、了解微生物分離和純化的原理2、掌握倒平板的方法和幾種常用的分離純化接種培養(yǎng)的基本操作技術(shù)，掌握微生物的無菌操作技術(shù)。（二）實驗原理

在自然界中，不同種類的微生物絕大多數(shù)都是混雜生活在一起的，為了生產(chǎn)和科學研究的需要，當我們希望獲得某一種微生物時，就必須從混雜的微生物類群中分離出它，以得到只含有這一種微生物的純培養(yǎng)物，這種獲得純培養(yǎng)物的方法稱為微生物的分離與純化。

為了獲得純種的微生物，一般根據(jù)該微生物營養(yǎng)或培養(yǎng)特點，或?qū)δ撤N抑制劑的耐受性不同，或?qū)δ撤N環(huán)境條件要求不同，從而制作或設(shè)置一些選擇性培養(yǎng)基，或選擇性培養(yǎng)條件，再用稀釋涂布平板法或稀釋混合平板法或劃線法分離，純化該微生物，直至得到該純種菌株。（三）實驗器材1.樣品

土樣2.培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基。3.其它

盛9ml無菌水的試管、盛90ml無菌水并帶有玻璃珠的三角瓶、無菌玻璃涂棒、無菌吸管、接種環(huán)、無菌培養(yǎng)皿。（四）實驗方法圖14-1從土壤中分離微生物操作過程（一）稀釋涂布平板法（1）土壤稀釋液的制備

①稱取土樣10g，放入盛90ml無菌水三角瓶中，振蕩15～20分鐘，使微生物細胞分散，靜置約20～30秒，即成10-1的土壤懸液。再將土壤懸液置于80-90℃水浴中保溫10min。②另取裝有9ml無菌水的試管，編號為10-2、10-3、10-4、10-5、10-6及10-7，用無菌吸管吸取10-1土壤懸液lml，加入編號10-2的無菌試管中，吹吸三次，使之混合均勻，即成10-2的土壤稀釋液。再用另一支吸管吸取10-2試管中的土壤稀釋液1ml，加入編號10-3的無菌試管中，輕輕搖動，使之混合均勻，即成10-3的土壤稀釋液，一定要每次更換一支無菌吸管（連續(xù)稀釋）。同法依次分別稀釋成10-4、10-5和10-6等一系列稀釋度菌懸液（2）平板制作

將無菌培養(yǎng)皿編上10-4、10-5、10-6號碼，每一號碼設(shè)三個重復，用1ml無菌吸管按無菌操作要求吸10-6稀釋液各1ml，分別放入編號10-6的三個培養(yǎng)皿中。同法吸取10-5稀釋液各1ml，分別放入編號10-5的三個培養(yǎng)皿中。再吸取10-4稀釋液各1ml，分別放入編號10-4的三個培養(yǎng)皿中。然后在9個培養(yǎng)皿中分別倒入15ml已融化并且冷卻至45℃左右的牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基，加蓋后輕輕搖動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基均勻分布，平置于桌面上，待凝固后即成平板，整個操作過程應嚴格按照無菌操作（3）培養(yǎng)與移植

待平板完全冷凝后，將平板倒置37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48小時，檢查分離結(jié)果。將培養(yǎng)后長出的單個菌落分別挑取接種到牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的斜面上，然后置于37℃恒溫箱中培養(yǎng)，待菌苔長出后，檢查菌苔是否單純，也可用顯微鏡涂片染色檢查是否是單一的微生物，若有其它雜菌混雜，就可再一次進行分離、純化，直至獲得純培養(yǎng)。（二）平板劃線分離法交叉劃線法連續(xù)劃線法（三）培養(yǎng)及形態(tài)觀察

培養(yǎng)及觀察：平板置28～30℃培養(yǎng)2－3天，挑取菌落制片，用石碳酸復紅染色1-2min，鏡檢，觀察記錄菌體、芽孢的形態(tài)。并且觀察記錄單個菌落的培養(yǎng)特征。（五）實驗作業(yè)1．在你所實驗的三種培養(yǎng)基平板上長出的菌落屬于哪個類群？簡述它們的菌落形態(tài)特征。2．稀釋分離時，為什么要將已融化的瓊脂培養(yǎng)基冷卻到45～50℃左右才能傾入到裝有菌液的培養(yǎng)皿內(nèi)？3．劃線分離時，為什么每次都要將接種環(huán)上多余的菌體燒掉？劃線為何不能重疊？4．培養(yǎng)時為什么要將培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)？實驗十一抗稻瘟霉的芽孢桿菌的分離篩選一、目的要求了解病原菌拮抗菌的篩選方法了解芽孢桿菌具有作為拮抗菌開發(fā)的巨大潛力1、杯碟法采用抑菌圈法，亦稱平板擴散法。杯碟法方法培養(yǎng)菌液溶化的瓊脂48℃混合倒平板放檢樣杯碟培養(yǎng)無菌操作有抑菌圈為陽性反應二、實驗原理二、實驗原理2、對峙培養(yǎng)法可將病原菌和測試菌分別相對著劃線接種，相隔大概2cm左右，當測試菌對病原菌有拮抗作用，病原菌和測試菌之間就有一道“不可逾越的鴻溝”。此法簡單易行，故被選定為本實驗拮抗菌的篩選方法三、實驗方法步驟1、對峙培養(yǎng)法

采用對峙培養(yǎng)法篩選具有拮抗活性的菌株。接種灰霉病菌到PDA固體24℃培養(yǎng)一天后，①挑取拮抗菌的菌絲接種到距灰霉病菌落邊緣2cm左右處，24℃培養(yǎng)48-72h后觀察該菌株抑菌圈半徑的大??；②將分離純化的內(nèi)生細菌用接種環(huán)挑取少量在距灰霉病菌落邊緣2cm左右處，24℃培養(yǎng)48-72h后觀察該菌株抑菌圈半徑的大小。四、思考題1、為何本實驗采用對峙培養(yǎng)法而非杯碟法來篩選稻瘟霉的拮抗菌？食品或水中大腸菌群的檢測實驗十二一、目的要求了解食品衛(wèi)生微生物學的重要性及其原理2.學會水和食品中大腸菌群數(shù)的測定方法二、基本原理水和食品中的微生物數(shù)量主要考慮到的是細菌特別是病原菌的數(shù)量。這些細菌主要來源于土壤、垃圾、糞便等，尤其是后者。若飲用水、釀造水和食品中發(fā)現(xiàn)有大腸群細菌，就有可能存在腸道病原菌，可能會危害人們的健康，因此，進行食品衛(wèi)生的微生物學檢驗是十分重要的。一般情況下，主要是測定水和食品中細菌菌落總數(shù)和大腸菌群數(shù)。細菌菌落總數(shù)是指水中或食品檢樣經(jīng)處理后，在一定條件培養(yǎng)后，所得1g或1mL檢樣中所含細菌菌落的總數(shù)，其主要作為判定水和食品被污染程度的標志（采用稀釋涂布法測定，本實驗略）。大腸菌群是腸道最普遍存在和數(shù)量最多的一群細菌、常將其作為人畜糞便污染的標志。水和食品中大腸菌群數(shù)是以每100mL（g）檢樣中大腸菌群最可能數(shù)（MPN）表示的。不同微生物發(fā)酵產(chǎn)物的不同，也是細菌分類鑒定的重要依據(jù)。大腸桿菌：丙酮酸裂解生成乙酰CoA與甲酸，甲酸在酸性條件下可進一步裂解生成H2和CO2產(chǎn)酸產(chǎn)氣志賀氏菌：丙酮酸裂解生成乙酰CoA與甲酸，但不能使甲酸裂解產(chǎn)生H2和CO2產(chǎn)酸不產(chǎn)氣三、材料與器皿(—)培養(yǎng)基1、普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液蛋白胨10g牛肉膏3g乳糖5g氯化鈉5g1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL蒸餾水1000mLpH7.2~7.4將蛋白胨、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解于1000mL蒸餾水中，調(diào)節(jié)pH為7.2~7.4，再加入1.6％溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管10mL，115℃滅菌20min。

2、三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液按上述普通乳糖蛋白胨培養(yǎng)液濃縮三倍配制，分裝于有杜漢氏小管的試管中，每管5mL。

3、品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（供平板分離用）蛋白胨10g

乳糖10gK2HPO43.5g

瓊脂15～20g

蒸餾水1000mL

無水亞硫酸鈉5g左右

5％的堿性品紅乙醇溶液20mLpH7.2~7.44、伊紅美藍培養(yǎng)基（EMB培養(yǎng)基）（供發(fā)酵法平板分離用，3和4可任選一種）蛋白胨10g乳糖10gK2HPO42.0g瓊脂20g蒸餾水1000mL2％伊紅（曙紅）水溶液20mL5％美藍（亞甲藍）水溶液13mLpH7.2~7.4三、方法與步驟(一)水樣的采集供細菌學檢驗的水樣，必須按一般無菌操作的基本要求采集，并保證再運送、貯存過程中不受污染。水樣從采集到檢驗不應超過4小時，在0～4℃下保存不應超過24小時，如不能在4小時內(nèi)分析，應在檢驗報告上注明保存時間和條件。

（1）自來水取樣：應在水龍頭打開放水5分鐘，再用無菌容器接取水樣，待分析。如水樣內(nèi)含有余氯，則采樣瓶滅菌后按每500mL水樣加3％Na2S2O3.5H2O溶液1mL。江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應先滅菌。采樣后，瓶內(nèi)應留有空隙。如果與其他化驗項目聯(lián)合取樣，細菌學分析水樣應采在其他樣品之前。（二）初發(fā)酵試驗水樣稀釋：制備水樣10-1、10-2的稀釋液，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放于盛有90mL無菌水和若干玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻，并使其中的細菌盡量呈單個存在，即為10-1稀釋液；再從10-1制備10-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數(shù)。

（2）接種和培養(yǎng)：以無菌操作于5支三倍濃縮培養(yǎng)基（接種前一定應先檢查杜漢氏小管內(nèi)有無氣泡）中各加入水樣10mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入水樣1mL，5支普通培養(yǎng)基試管中加入10-1稀釋液1mL，小心混勻放入37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時。此即5管法。（3）結(jié)果觀察：37℃中培養(yǎng)24h后取出觀察，觀察有無氣體（杜漢氏小管內(nèi)有無氣體）和酸產(chǎn)生（培養(yǎng)基有無變色）。在48h之間，培養(yǎng)管內(nèi)倒置的杜漢氏小管內(nèi)有任何量的氣體積累，或培養(yǎng)基顏色從紫色變?yōu)辄S色，便可初步斷定為陽性反應。

(三)平板培養(yǎng)試驗

將初發(fā)酵實驗中產(chǎn)酸產(chǎn)氣的后只產(chǎn)酸或只產(chǎn)氣的試管中的培養(yǎng)物用接種環(huán)取少許，劃線接種在品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基或伊紅美藍培養(yǎng)基平板上，為了確保獲得分離的單菌落，須注意以下事項：注意事項（1）劃線間距至少相隔0.5厘米；（2）接種釘尖端要稍彎；（3）先對試管輕擊并使之傾斜，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣；（4）劃線時要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養(yǎng)基平面．以免刮傷或戳破培養(yǎng)基。劃線后培養(yǎng)皿倒置，于37℃培養(yǎng)18～24h。

24h后，觀察在平板上出現(xiàn)的單個菌落，其核心有深綠色金屬光澤者為較典型的大腸菌群菌落。盡可能挑取典型的或接近典型的大腸菌群菌落，在營養(yǎng)瓊脂斜面上劃線，置37℃培養(yǎng)24h。挑取斜面培養(yǎng)物制成涂片，進行革蘭氏染色，凡屬革蘭氏陰性桿菌，即確認了大腸菌群細菌的存在．

(四)復發(fā)酵驗證實驗經(jīng)上述經(jīng)染色為革蘭氏陰性的典型菌落，用接種環(huán)刮取部分接種于盛有乳糖培養(yǎng)基的試管中，在37℃培養(yǎng)24h，陽性反應者即確認為大腸菌群細菌。四、結(jié)果計算在初發(fā)酵試驗中，可能有極少數(shù)能發(fā)酵乳糖產(chǎn)氣的非大腸菌群細菌混在陽性可疑反應管中，通過對初發(fā)酵中的陽性可疑管進行平板和復發(fā)酵試驗，并進行革蘭氏染色和細菌形態(tài)的觀察，可將那些少量的非大腸菌群細菌(“假陽性管”)刪除去，故在記錄時只能把三步試驗都呈陽性的試管計入陽性反應管。如果初發(fā)酵接種水樣量為10mL、1mL、0.1mL，可直接查表4－2求出原水樣100mL中大腸菌群指數(shù)（MPN）。如果接種水樣量低于上述水樣量，則經(jīng)下面的換算式計算。目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報告值，即為MPN×10。目前我國系以1L水樣中的菌數(shù)為報告值，即為MPN×10。水樣的總大腸菌群檢索表出現(xiàn)陽性反應的試管數(shù)每100ml中的細菌的MPN出現(xiàn)陽性反應的試管數(shù)每100ml中的細菌的MPN10ml管中1ml管中0.1ml管中10ml管中1ml管中0.1ml管中000000000000012345024579000000222222012345467911130000001111110123452467911000000333333012345679111315000000444444012345891113151711111133333301234581012151719下略五、實驗報告1、簡述實驗過程。2、計算實驗結(jié)果。六、思考題

用傾注平板法和涂布平板法計數(shù)，其平板上長出的菌落有何不同？為什么要培養(yǎng)較長時間（48小時）后觀察結(jié)果？大腸菌群的定義是什么？大腸菌群中的細菌種類，一般并非是病原菌，為什么要選用大腸菌群作為食品被污染的指標？實驗十三微生物生長曲線的測定

一、實驗目的1.通過大腸桿菌數(shù)量的測量理解大腸桿菌的生物特征和規(guī)律，繪制生長曲線；2.學習使用光密度法測定菌數(shù)。二、實驗原理適宜的條件下，在一定體積的培養(yǎng)基中培養(yǎng)某一純種微生物，并定時取樣，測定細胞的數(shù)目。以時間為橫坐標、細胞數(shù)目的對數(shù)為縱坐標，可作出該種微生物的生長曲線。經(jīng)歷延遲期、對數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期四個階段。三、實驗器材分光光度計、大腸桿菌液體培養(yǎng)物、無菌水、1ml、2ml和5ml無菌吸管、試管架、恒溫搖床等。四、操作步驟

1、制備YEPD培養(yǎng)基2、活化菌種：活化三次。3、接種培養(yǎng)：接種2%的大腸桿菌菌于三角瓶液體LB培養(yǎng)基中，搖勻。取5ml放入滅菌的試管中（作為空白對照）。三角瓶于搖床中30℃培養(yǎng)。每隔2h取樣一次，均放入做好標簽的滅菌空試管中，并于冰箱中保存。4、生長曲線的測定

（1）總菌數(shù)的測定 將上述培養(yǎng)液逐次進行稀釋，然后選擇合適的稀釋度進行光密度值的測定。并作出大腸桿菌生長過程中總菌數(shù)的變化情況。（2）活菌數(shù)的測定將上述培養(yǎng)液逐次進