(22)-6.3 基因工程菌的發(fā)酵

第三視頻：基因工程菌的發(fā)酵近年來，基因工程已開始由實驗室走向工業(yè)生產，走向實用。它不僅為我們提供了一種極為有效的菌種改良技術和手段和科研手段，也為醫(yī)學疾病的深入研究和最后的治愈提供了可能?，F(xiàn)在由基因工程菌產生的藥物已先后面市，基因工程不僅保證了這些藥物的來源，而且可使成本大大下降。但是從許多研究中發(fā)現(xiàn)，工程菌在保存過程中及發(fā)酵生產過程中表現(xiàn)出不穩(wěn)定性，工程菌不穩(wěn)定性的解決已日益受到重視并成為基因工程這一高技術成就轉化為生產力的關鍵之一。下面我們來了解下基因工程菌的培養(yǎng)。第一、基因工程菌的不穩(wěn)定性：實踐表明，基因工程細胞工業(yè)化培養(yǎng)中，產物的產率往往比實驗室培養(yǎng)規(guī)模為低。其原因主要重組DNA的穩(wěn)定性尤為重要，重組DNA在宿主內表達方式有兩種，一是游離表達方式、二是結合表達方式。因此，基因工程細胞培養(yǎng)過程，重組DNA的丟失方式亦有兩種，其一是細胞培養(yǎng)過程，由于回復突變或分配作用致使DNA丟失．稱為脫落性不穩(wěn)定，其二是重組DNA中編碼的結構基因在宿主內發(fā)生再重組過程產生突變，不再表達目的產物，稱為結構性不穩(wěn)定。影響基因工程菌不穩(wěn)定性的因素有：1、受體細胞中的限制修飾系統(tǒng)對外源重組DNA分子的降解；2、受體細胞中內源性的轉座元件促進重組分子的缺失重排；3、重組質粒在受體細胞分裂時的不均勻分配；4、外源基因的高效表達嚴重干擾受體細胞正常的生長代謝；5、能量、物質的匱乏和外源基因表達產物的毒性。為提高基因工程細胞表達效率，需采取適當措施，提高重組DNA在宿主細胞內的拷貝數(shù)及促進表達產物自細胞內向細胞外分泌?？捎每剐赃x擇法、抗生素依賴型變異法、營養(yǎng)互補法、為控制控制基因的過量表達可用誘導型質粒、溫度敏感型質粒法等。此外，基因工程細胞的原宿主通常是某些培養(yǎng)物質(如某種氨基酸或維生素等)的缺陷型，有些基因工程細胞生產過程亦產生某些抑制細胞生長的代謝物。由此，在培養(yǎng)工程中應考慮控制培養(yǎng)液營養(yǎng)成分及其濃度，同時采取措施，消除抑制細胞生長的代謝物，以保證細胞正常生長。由此可見，在基因工程細胞培養(yǎng)過程，除—般培養(yǎng)條件外，必需考慮基因工程細胞的自身特點，確定最佳培養(yǎng)條件。第二、基因工程細胞的培養(yǎng)基因工程細胞的培養(yǎng)過程與一般需氧細胞培養(yǎng)基本一致，同時培養(yǎng)方式亦無差異，可采用各種分批培養(yǎng)方式，亦可采用連續(xù)培養(yǎng)、半連續(xù)培養(yǎng)及透析培養(yǎng)等方式。至于影響基因工程細胞培養(yǎng)的細胞生物量得率與產物量的因素及有關參數(shù)，也是可以參照普通細胞相應培養(yǎng)方式求得。目前關于動植物基因工程細胞培養(yǎng)工程的研究剛剛起步，有待進—步發(fā)展。這里僅對基因工程菌的營養(yǎng)控制、質粒穩(wěn)定性、重組質?？截悢?shù)的控制及表達效率作簡單討論。1、底物濃度的控制在基因工程茵培養(yǎng)過程，至少要遵循P1級物理防護的規(guī)定，并進行菌體的高密度培養(yǎng)。高密度培養(yǎng)是指應用一定的培養(yǎng)技術和裝置提高菌體的發(fā)酵密度，使菌體密度比普通發(fā)酵培養(yǎng)有顯著的提高，最終提高特定產物的比生產率。細胞密度比較高，以至接近其理論值的培養(yǎng)，液體培養(yǎng)中細胞含量一般超過常規(guī)培養(yǎng)10倍以上。用以描述的單位是干細胞重量/升。上限值為160～200g干細胞重量/升，下限值為20～30g干細胞重量/升。從生物安全性考慮，培養(yǎng)的基因工程菌通常是維生素或氨基酸的營養(yǎng)缺陷型突變株。培養(yǎng)過程細胞對維生素需求量甚微，在培養(yǎng)開始即加入必需量對細胞生長并無影響，但培養(yǎng)一開始即加入足夠量氨基酸則可能因氨基酸濃度過大而抑制細胞生長。在此情況下，可采取培養(yǎng)過程中，在調節(jié)pH值同時補加氨基酸混合物和葡萄糖的方法，以便培養(yǎng)過程葡萄糖及氨基酸濃度的基本恒定，從而實現(xiàn)高密度培養(yǎng)，如E．coliC600株培養(yǎng)時可獲得6％干菌體。但菌體對葡萄糖及氨基酸的收率因培養(yǎng)條件而異，如以葡萄糖及分別用蘇氨酸、亮氨酸、組氨酸及色氨酸為底物時，按每克干菌體成本計，應用蘇氨酸成本最高，故應避免應用蘇氨酸缺陷型菌株為宿主，最好選用維生素缺陷型菌株為宿主。2、質粒穩(wěn)定性重組質粒上通常載有氨芐霉素抗性基因，獲得該類重組質粒的基因工程菌在含氨芐青霉素培養(yǎng)液中可以生長，而非基因工程菌不能生長。但在基因工程菌高密度培養(yǎng)時，外加的氨芐青霉素易于失活，影響培養(yǎng)。為此考慮采用抗生素依賴性變異法替代抗生素添加法。其方法是通過誘變使宿主成為某抗生素依賴性突變株(如鏈霉素依賴性)。只有在鏈霉素存在下宿主才能生長，但重組質粒上含有鏈霉素非依賴性基因，將重組質粒導入宿主細胞后，所獲克隆菌可在不含抗生素培養(yǎng)基中生長，而丟失質粒菌株卻不能生長。此法很有實用價值，但缺點是宿主細胞易產生回復突變，造成培養(yǎng)工程復雜化，產物產率下降。為考察質粒穩(wěn)定性，在此引入質粒保持率Fn的概念，F(xiàn)n表示分批培養(yǎng)中細胞分裂n次后，培養(yǎng)液中基因工程細胞數(shù)與總細胞數(shù)的比值。理論上基因工程菌載荷外源性基因，培養(yǎng)過程細胞大量合成外源性產物，其負荷大于質粒丟失菌株，故基因工程菌株比生長速率μ通常較質粒丟失菌株小，當然亦有變化不大者。采用天然培養(yǎng)基培產時質粒穩(wěn)定件較用合成培養(yǎng)基為高，在天然培養(yǎng)基中即使無選擇壓力亦可保持質粒的穩(wěn)定性，因此，用天然培養(yǎng)基進行連續(xù)培養(yǎng)是獲得質粒穩(wěn)定性的良好方法。3、表達效率及質?？截悢?shù)控制在基因工程細胞培養(yǎng)工程中，表達效率與質粒拷貝數(shù)有關。在質粒穩(wěn)定基礎上，應盡可能提高細胞內質?？截悢?shù)。在工業(yè)生產中易于操作的方法是在培養(yǎng)的不同階段，采用不同培養(yǎng)溫度達到提高拷貝數(shù)目的，在前培養(yǎng)階段采用低溫，以減少細胞負荷，此時拷貝數(shù)較低，而比生長速率升高，在主培養(yǎng)中途升高溫度，質粒拷貝數(shù)增加，目的基因產量提高。例如在25℃下，培養(yǎng)含有穿梭質粒pCP3的E．coliC600/pCI857至濁度為5。再將培養(yǎng)溫度提高至37℃，則質?？截悢?shù)增加，基因產物β-內酰胺酶活性增加37倍左右，但Fn急劇下降。此外，利用λ噬菌體PL啟動子的溫度敏感性，采用二級連續(xù)培養(yǎng)方式，第1罐于低溫下培養(yǎng)以降低表達效率，第2罐高溫培養(yǎng)，對提高表達效率亦是有效的。此外，當質粒拷貝數(shù)與某些化合物有關時，亦可