洛伐他汀的提取工藝

洛伐他汀的提取工藝研究提取方法簡(jiǎn)介水提法熱水提取法可以有效地提取易溶于水的物質(zhì)，該法的優(yōu)點(diǎn)是設(shè)備要求低、投資少、環(huán)境友好，但是因?yàn)樵摲ㄊ褂么髽O性的水作為提取劑，所以蛋白質(zhì)和糖類等物質(zhì)容易被提取提取出來(lái)，為后面分離純化步驟帶來(lái)不便有機(jī)溶劑提取法根據(jù)各種藥材中有效成分在有機(jī)溶劑中的溶解度不同，可以選擇不同的有機(jī)溶劑進(jìn)行提取，在溶劑選擇方面，溶解度、安全性、回收率、價(jià)格等因素必須考慮。。超聲提取法超聲波是一種頻率大于20KHz的聲波，超聲波可以產(chǎn)生和傳遞能量，使得提取媒介震動(dòng)，促使提取媒介快速滲透到待提取物組織中。超聲波提取法的特點(diǎn)主要有：①提取溫度低，一般的提取溫度均在40~50℃。②提取壓力低，提取壓力一般均在常壓下進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便。③萃取效率較高，使用超聲波法萃取時(shí)，一般在較短時(shí)間內(nèi)則可達(dá)到較好的提取效果。④處理量較大，相比于其他方法在一次實(shí)驗(yàn)中可以處理較多的原材料。⑤產(chǎn)品不易變質(zhì)，由于超聲波具有一定的殺菌作用，所以得到的產(chǎn)品可以較長(zhǎng)時(shí)間保留。微波輔助提取法微波是一種頻率在300MHz與300GHz之間的電磁波，該法是利用微波能來(lái)提高提取率的一種方法，提取過(guò)程中，微波輻射到提取劑然后作用于細(xì)胞內(nèi)部，由于提取劑和細(xì)胞均吸收了能量，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)部壓力和溫度上升，最后的結(jié)果是細(xì)胞破裂，然后待提取物質(zhì)隨著提取劑流出。超臨界流體萃取法隨著超臨界流體萃取技術(shù)日益成熟，該法在天然植物提取中的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，該法具有效率高、無(wú)溶劑殘留的特點(diǎn)，但是由于該法成本較高，所以工業(yè)上應(yīng)用較少。洛伐他汀的國(guó)際工藝研究現(xiàn)狀國(guó)際上對(duì)洛伐他汀的首次報(bào)道來(lái)自A.Endo等。

1976年,東京大學(xué)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室的AkiraEndo從泰國(guó)食品中分離出來(lái)Monascus菌株(Monascus-rubberNo.1005),經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)生洛伐他汀.其培養(yǎng)基組成為:6%葡萄糖、2.5%蛋白胨、0.5%玉米油、0.5%氯化氨.經(jīng)28℃需氧培養(yǎng)10d,所得發(fā)酵液經(jīng)處理可得到無(wú)色的洛伐他汀晶體.其提取工藝見圖。該工藝多次采取溶媒萃取法,并大量使用苯和丙酮等有毒有害的有機(jī)溶媒,對(duì)勞動(dòng)者及環(huán)境都會(huì)造成極大危害.Merk公司對(duì)洛伐他汀菌種及發(fā)酵配方，分離純化也進(jìn)行了報(bào)道，具體工藝如圖：Merk公司還報(bào)道了110加侖發(fā)酵液規(guī)模的中試提取精制工藝，如圖：Merk公司作為世界上首家將洛伐他汀推上市場(chǎng)的公司,其工藝具有很大的先進(jìn)性,最終產(chǎn)物的純度高.但其工藝路線比較復(fù)雜,多次使用硅膠層析、凝膠層析,操作復(fù)雜,生產(chǎn)成本高.而且,反復(fù)使用了二氯甲烷、乙腈等有毒有害溶媒,對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)極為不利.EP0033536A2中特別強(qiáng)調(diào)報(bào)道了洛伐他汀提取過(guò)程中開環(huán)物內(nèi)酯化的方法.菌絲中內(nèi)酯型的洛伐他汀和菌液中開環(huán)酸式的洛伐他汀,分別用乙酸乙酯浸提和萃取.浸提液與萃取液合并,真空蒸餾后,于106e在甲苯中回餾2h,可使酸式的洛伐他汀轉(zhuǎn)為內(nèi)酯型.這是由于只有內(nèi)酯型的洛伐他汀才有商業(yè)價(jià)值.內(nèi)酯化后,料液體積已經(jīng)很小,經(jīng)硅膠柱層析分離,活性組分濃縮后即可結(jié)晶出來(lái).這種方法的弊端在于,需經(jīng)多步復(fù)雜操作,而且某些步驟操作條件過(guò)于強(qiáng)烈,洛伐他汀的收率很低,工藝過(guò)程中有害溶媒的使用也會(huì)帶來(lái)諸多環(huán)境和安全問(wèn)題。另有文獻(xiàn)報(bào)道了更簡(jiǎn)便易行的閉環(huán)方法,并且可以避免苯和甲苯等有害溶媒的使用.文獻(xiàn)中提到,發(fā)酵液可不經(jīng)菌絲和菌液分離,直接用乙酸丁酯提取,菌絲和菌液中分別存在開環(huán)和閉環(huán)形式的洛伐他汀能夠被同時(shí)提取到丁酯相中.由于乙酸丁酯的沸點(diǎn)高,在濃縮蒸發(fā)時(shí)可以將水分子帶出,且在給定條件下,丁酯不與水形成恒沸混合物,基本上可將洛伐他汀閉環(huán)生成的水全部帶走,很方便地解決了閉環(huán)問(wèn)題.其工藝見圖。文中報(bào)道其精粉純度大于90%.這一工藝最大的特點(diǎn)是盡管菌絲菌液中都存在洛伐他汀,但并不將其分開處理.發(fā)酵液酸化后直接加入乙酸丁酯提取,將開環(huán)物和閉環(huán)物全部轉(zhuǎn)入丁酯相后,在減壓濃縮的過(guò)程中同時(shí)發(fā)生開環(huán)物的閉環(huán)化.這一方法不僅縮短了提取時(shí)間,簡(jiǎn)化了純化操作,而且避免了提取過(guò)程中劇毒溶媒的使用,對(duì)勞動(dòng)者和環(huán)境均有益處.文章還預(yù)計(jì)了這一方法可被工業(yè)放大,據(jù)估計(jì),其放大時(shí)收率可達(dá)60%.洛伐他汀的國(guó)內(nèi)研究現(xiàn)狀

國(guó)內(nèi)從20世紀(jì)90年代初期開始對(duì)汀類物質(zhì)的研究，可能是由于技術(shù)保密的緣故,國(guó)內(nèi)的生產(chǎn)工藝研究未見報(bào)道.四川抗生素研究所在1996年得到洛伐他汀生產(chǎn)工藝，并在1997年生產(chǎn)出洛伐他汀膠囊，但始終未見生產(chǎn)工藝報(bào)道，另外，黑龍江肇東華富藥業(yè)、沈陽(yáng)科瑞斯德醫(yī)藥有限公司均有關(guān)于洛伐他汀的研究報(bào)道。北大維信生物有限公司自主研發(fā)工藝，采用新技術(shù)從紅曲米中提取精煉而成的降血脂藥物血脂康，具有療效顯著、質(zhì)量穩(wěn)定、制劑工藝先進(jìn)等優(yōu)點(diǎn)，目前已通過(guò)FDA認(rèn)證，進(jìn)入美國(guó)市場(chǎng)。無(wú)錫輕工大學(xué)生物工程學(xué)院曾報(bào)道其洛伐他汀發(fā)酵產(chǎn)量≥10g/L±1g/L;發(fā)酵周期322h;提取收率>70%,但未報(bào)道其工藝.他汀藥物除降低膽固醇、甘油三酯,預(yù)防中風(fēng)發(fā)作,降低缺血性心臟病病人做冠脈搭橋手術(shù)風(fēng)險(xiǎn)以外,還具有抗增殖作用,因此可能用于治療腎小球腎炎和癌癥等多種疾病;并具有免疫抑制性,因而可能成為器官移植后排斥療法的常規(guī)藥物。工藝流程：取洛伐他汀發(fā)酵液過(guò)濾得濕菌絲，濕菌絲加一定量的乙醇浸提，浸提液加醋酸乙酯萃取，萃取液用醋酸洗后濃縮閉環(huán)，冷卻結(jié)晶，得粗粉；粗粉用甲醇溶解（加熱）配成10%左右的濃度，活性炭脫色，降溫結(jié)晶,得洛伐他汀成品。中間過(guò)程的檢測(cè)及成品含量的測(cè)定均用HPLC檢測(cè)。

色譜條件色譜柱：HypersilC18（4.0mm×150mm，10μm）；柱溫：室溫；流動(dòng)相：甲醇－0.1%磷酸水(80∶20=v/v)，流速1.0mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238nm，進(jìn)樣量：10μL；洛伐他汀保留時(shí)間：7.1min，理論塔板數(shù)大于1500。浸提過(guò)程中提的是濕菌絲，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中就排除了那些脂溶性的溶劑，直接選用了毒性較小，易回收的乙醇做浸提溶劑；單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)論：乙醇作為提取溶劑時(shí)，最佳工藝條件:物料比為5∶1，浸提溫度為45℃，浸提時(shí)間為4h，閉環(huán)溫度為80℃，閉環(huán)時(shí)間為5h。工藝洛伐他汀成品的各項(xiàng)指標(biāo)均符合USP標(biāo)準(zhǔn)，工藝簡(jiǎn)便、收率高，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。目前，洛伐他汀一般通過(guò)乙酸丁酯萃取、大孔樹脂吸附、解吸附分離純化、結(jié)晶、重結(jié)晶精制而得。但此種方法下，洛伐他汀萃取率較低，且工藝煩瑣、成本高、利潤(rùn)低，且乙酸丁酯的大量使用也對(duì)操作人員的健康有害并污染環(huán)境。本工藝采用超臨界CO2流體萃取，95％乙醇超聲洗滌純化，可得到純度＞98％的洛伐他汀產(chǎn)品。其優(yōu)勢(shì)在于摒棄了大量有機(jī)溶媒，僅使用乙醇一種溶劑，不會(huì)對(duì)人體及環(huán)境造成危害；工藝簡(jiǎn)便，省去了結(jié)晶與重結(jié)晶步驟；降低了成本，適合工業(yè)化生產(chǎn)的需求。萃取工藝優(yōu)化超臨界CO2萃取洛伐他汀選擇無(wú)水乙醇為夾帶劑，參考文及預(yù)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)萃取壓力（A）、萃取溫度（B）、夾帶劑用量（C，以mL·g－1（原料，即紅曲霉菌渣的重量）計(jì)）、萃取時(shí)間（D）是影響洛伐他汀萃取率的主要因素。由表2可知，各萃取因素產(chǎn)生影響的程度依次為萃取壓力＞萃取溫度＞萃取時(shí)間＞夾帶劑用量。由表3可知，因素A即萃取壓力對(duì)試驗(yàn)結(jié)果有顯著影響。確定最佳萃取工藝條件為A2B3C2D2，即萃取壓力25MPa、萃取溫度55℃、夾帶劑用量2.0mL·g－1、萃取時(shí)間100min。純化工藝優(yōu)化洗滌溶劑選擇：取洛伐他汀粗品，分別用無(wú)水乙醇、95％乙醇、85％乙醇、75％乙醇、65％乙醇（用量均為1mL·g－1（粗品））進(jìn)行洗滌，每次超聲15min，過(guò)濾，重復(fù)4次，50℃烘干至恒重，測(cè)定其純度，結(jié)果分別為99.01％、98.71％、94.51％、91.15％、79.30％?？梢姛o(wú)水乙醇洗滌效果最好，95％乙醇次之，但95％乙醇的價(jià)格比無(wú)水乙醇低，而且可通過(guò)回收得到，綜合考慮采用95％乙醇作為洗滌溶劑。洗滌次數(shù)選擇：取洛伐他汀粗品，加入95％乙醇（用量為1mL·g－1（粗品）），超聲15min，選擇洗滌次數(shù)分別為1、2、3、4、5、6次，過(guò)濾，置于50℃烘干至恒重，測(cè)定其純度，結(jié)果分別為85.94％、92.07％、96.35％、98.87％、99.03％、99.08％?？梢姡S著洗滌次數(shù)的增加，洛伐他汀的純度增大，而洗滌4次以后洛伐他汀的純度變化不明顯，考慮工藝的操作簡(jiǎn)便和降低成本，選擇洗滌次數(shù)為4次。洗滌溶劑用量選擇。取洛伐他汀粗品，采用95％乙醇，選擇其不同的用量（1、2、3mL·g－1（粗品））進(jìn)行洗滌，超聲15min，過(guò)濾，重復(fù)4次，50℃烘干至恒重測(cè)定其純度，結(jié)果分別為98.94％、99.07％、99.35％?？梢姡礈烊軇┯昧吭?mL·g－1（粗品）的情況下，洛伐他汀的純度已達(dá)98％，符合要求，故選擇洗滌溶劑用量為1mL·g－1。通過(guò)單因素試驗(yàn)優(yōu)化，得最佳純化工藝條件為采用95％乙醇進(jìn)行超聲洗滌，每次用量為1mL·g－1（粗品），超聲15min，過(guò)濾，共洗滌4次，產(chǎn)品純度達(dá)98％以上。洛伐他汀成品為白色粉末或針狀晶體