酶的分離純化

Chapter4

TheExtraction,SeparationandPurificationofEnzyme酶的分離純化Contentsofchapter4第一節(jié)、發(fā)酵醪液預(yù)處理第二節(jié)、酶的初步純化第四節(jié)、酶的濃縮與干燥第五節(jié)、酶純化方案的設(shè)計與評價第三節(jié)、酶的高度純化第一節(jié)、發(fā)酵醪液預(yù)處理一、酶在細胞中分布及發(fā)酵醪液預(yù)處理二、細胞破碎三、發(fā)酵液的固液分離第一節(jié)、發(fā)酵醪液預(yù)處理

一、酶在細胞中的分布及發(fā)酵醪預(yù)處理1、酶在細胞中分布胞外酶：水解酶類，易收集，不必破碎細胞，緩沖液或水浸泡細胞或發(fā)酵液離心得到上清液即為含酶液。胞內(nèi)酶：除水解酶類外的其它酶類，需破碎細胞，不同的酶分布部位不同，最好先將酶存在的細胞器分離后再破碎該細胞器，然后將酶用適當(dāng)?shù)木彌_溶液或水抽提。細胞結(jié)構(gòu)與酶分布2、酶分離原則：在增加酶得率和純度的同時，盡可能避免高溫、過酸、過堿、劇烈的震蕩及其它可能使酶喪失活力的一切操作過程。盡最大可能保存酶的活力。3、酶的提取、分離純化技術(shù)路線預(yù)處理酶初步分離純化酶濃縮、干燥酶產(chǎn)品發(fā)酵醪液沉淀分離、提取、離心酶高度分離純化細胞破碎、離心、過濾膜過濾、層析分離，電泳分離預(yù)處理（pretreatment）：包括固液分離和細胞破碎（分離胞內(nèi)產(chǎn)物）等。初步純化（roughfractionation）（提?。撼ヅc目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化（finefractionation）（精制）：除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥（concentrationanddesiccation）（成品加工）:使酶與溶劑分離的過程。二、細胞破碎許多酶存在于細胞內(nèi)。為了提取這些胞內(nèi)酶，首先需要對細胞進行破碎處理。1）機械破碎2）物理破碎3）化學(xué)破碎4）酶解破碎JY92-IID超聲波細胞粉碎機細胞破碎珠高壓細胞破碎機DY89-I型電動玻璃勻漿機機械破碎搗碎法研磨法勻漿法物理破碎溫度差破碎法壓力差破碎法超聲波破碎法化學(xué)破碎有機溶劑：甲苯、丙酮丁醇、氯仿表面活性劑：Triton、Tween酶促破碎自溶法外加酶制劑法通過機械運動產(chǎn)生的剪切力，使組織、細胞破碎。通過各種物理因素的作用，使組織、細胞的外層結(jié)構(gòu)破壞，而使細胞破碎。通過各種化學(xué)試劑對細胞膜的作用，而使細胞破碎通過細胞本身的酶系或外加酶制劑的催化作用，使細胞外層結(jié)構(gòu)受到破壞，而達到細胞破碎細胞破碎方法及其原理本章目錄三、發(fā)酵液的固液分離1.過濾：借助過濾介質(zhì)使不同大小、不同形狀組分分離。過濾介質(zhì)：濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等根據(jù)推動力產(chǎn)生條件不同過濾分為：

（1）常壓過濾：以液位差為推動力。如濾紙、吊籃或吊袋過濾（2）加壓過濾：以壓力泵或壓縮空氣產(chǎn)生的壓力為動力如板框壓濾

（3）減壓過濾：在通過過濾介質(zhì)下方抽真空，使產(chǎn)生壓力差。如轉(zhuǎn)鼓式真空吸濾機。在發(fā)酵醪液預(yù)處理中采用的是粗濾，即過濾懸浮液中直徑大于2μm的顆粒2、離心分離

離心分離是借助于離心機旋轉(zhuǎn)所產(chǎn)生的離心力，使不同大小、不同密度的物質(zhì)分離的技術(shù)過程。在離心分離時，要根據(jù)欲分離物質(zhì)以及雜質(zhì)的顆粒大小、密度和特性的不同，選擇適當(dāng)?shù)碾x心機、離心方法和離心條件。（一）離心機的選擇離心機的種類1、常速離心機最大轉(zhuǎn)速8000rpm(r/min),用于細胞、細胞碎片和培養(yǎng)基殘渣等分離；2、高速（冷凍）離心機

1×104-2.5×104rpm,用于沉淀、細胞器等分離；3、超速離心機轉(zhuǎn)速2.5-8×104rpm，用于DNA、RNA蛋白質(zhì)及細胞器病毒分離純化；檢測純度；沉降系數(shù)和相對分子量測定等。分制備用、分析用、制備及分析用三種。分析用超速離心機裝有光學(xué)檢測系統(tǒng)、自動記錄系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)；實驗室離心機溫度類型：常溫及冷凍超速離心機均為冷凍型。使用冷凍離心機時提前降溫，預(yù)冷離心頭。使用超速離心機時先抽真空。離心的形式外擺式一般為低速，角式由低速到超速均有。角式離心機和離心頭（轉(zhuǎn)子）角式離心頭要配套，低溫使用要預(yù)冷，操作注意穩(wěn)、蓋要旋緊。離心機的大?。郝涞厥郊芭_式小臺式離心機離心管材質(zhì)：玻璃，塑料強度：和離心速度相配大?。汉娃D(zhuǎn)子配套高速超速管要加蓋離心機操作平衡、定溫、定速、定時。（二）離心方法的選擇所分離的顆粒大小和密度相差較大:常速、高速離心;若從樣品液中分離2種以上大小和密度不同的顆粒：差速離心;超速離心:差速離心法和密度梯度離心法，后者又分速率區(qū)帶離心和等密度離心。離心分離示意圖（a）離心前的懸浮液（b）～（e）離心不同時間后顆粒的沉降情況

差速離心示意圖已破碎的細胞沉淀（細胞核）上清液沉淀（細胞膜碎片、線粒體、溶酶體）上清液沉淀（核糖核蛋白體）上清液（可溶性組分）500g,10’10000g,10’1．差速離心（differentialcentrifugation）

采用不同的離心速度和離心時間，使沉降速度不同的顆粒分批分離的方法。適用：分離大小和密度差異較大的顆粒。優(yōu)點：操作簡單。缺點：1）分離效果較差，不能一次得到純顆粒。

2）壁效應(yīng)嚴(yán)重。

3）沉降的顆粒受到擠壓2．密度梯度離心

(區(qū)帶離心)

（densitygradientcentrifugation）樣品在密度梯度介質(zhì)中進行離心，使沉降系數(shù)比較接近的組分得以分離的一種區(qū)帶分離方法。常用的密度梯度溶液是蔗糖、甘油溶液。（5%～60%）密度梯度介質(zhì)一般采用密度梯度混合器進行制備特點：區(qū)帶內(nèi)的液相介質(zhì)密度小于樣品物質(zhì)顆粒的密度。適宜分離密度相近而大小不同的固相物質(zhì)。密度升高3種梯度示意圖BABAABa.線性梯度b.凸型梯度c.凹型梯度Densitygradientultracentrifugation3.等密度梯度離心又稱沉降平衡離心（sedimentationequilibriumcentrifugation）根據(jù)顆粒的密度不同而進行分離。離心時，在離心介質(zhì)的密度梯度范圍內(nèi)，不同密度的物質(zhì)顆粒或向下沉降，或向上漂浮，達到與其相同的密度時不再移動，形成區(qū)帶。常用氯化銫（CsCl）作為梯度介質(zhì)。特點：

介質(zhì)的密度梯度范圍包括所有待分離物質(zhì)的密度。適于分離沉降系數(shù)相近，但密度不同的物質(zhì)。本節(jié)目錄梯度回收1、穿刺法采用針穿刺離心管底部，使梯度靠重力自由滴出，然后依次作分布收集，此法適用于薄壁塑料管，流出液部分收集于小試管中，經(jīng)分析決定取舍或合并。此法對梯度擾動小，但離心管不能再用，不適合回收管底有沉淀的梯度，也不使用于不銹鋼或厚壁塑料管。2、取代法濃取代液收集稀濃通入空氣、輕液體收集濃稀優(yōu)點：是不破壞離心管，能用于較粘梯度，可借光學(xué)（放射性）系統(tǒng)進行流出液跟蹤，簡化分析化驗工作。缺點：開始取代操作時易引起擾亂，操作需特別小心，梯度粘度太大時也不合適。

向上取代向下取代3、虹吸法用一根聚乙烯小管插到管底部，用虹吸法吸出梯度，它也不損傷離心管，尤其適用于不銹鋼管中物質(zhì)的分級分離，但虹吸時易引起分離區(qū)帶擾亂，最好使用專門的裝置。除取代法和虹吸法外，有時從管上部直接仔細地用注射器或吸管定量移出梯度液，效果也較好。4、切割法適用于極粘梯度，就是用離心管切割器將凍結(jié)的塑料管子切成薄片，從而將梯度分部收集，此法僅適用于賽璐璐或硝酸纖維素管。（三）離心條件選擇1.離心力

Fc=mac

＝mrω2

＝mr(2

N/60)2

N為離心機每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)（r/min）；

Fc通常以相對離心力RCF（relativecentrifugalforce）表示，即離心力F的大小相當(dāng)于地球引力（重力常數(shù)g）的多少倍。一般用g（或數(shù)字

g）表示。

RCF=mr(2

N/60)2/mg=1.12

10-5N2r

此公式描述了相對離心力與轉(zhuǎn)速之間的關(guān)系，

旋轉(zhuǎn)半徑用r平均代替

r平均=1/2（r大+r小）cm通常：低速離心以每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)表示，如：4000r/min。高速離心（超速），常以相對離心力（RCF）表示，如：65000g。兩者可換算或查測算圖。2、離心時間不同離心方法，離心時間的概念不同。對常速離心、高速離心、差速離心,指顆粒完全沉降到離心管底的時間,沉降時間或澄清時間;等密度梯度離心,指顆粒完全到達等密度點時平衡時間，平衡時間;對密度梯度離心,指形成界限分明區(qū)帶的時間，區(qū)帶形成時間;沉降時間指顆粒從樣品液面完全沉降到離心管底所需的時間;決定于沉降速度和沉降距離。沉降系數(shù)已知顆粒S：沉降系數(shù)；ω:角速度；r1，r2:轉(zhuǎn)軸中心到液面與管底距離。效率因子KK與轉(zhuǎn)子半徑和轉(zhuǎn)速有關(guān)；實際操作中：1、某一顆粒S定值，故K小，t也小，效率高（轉(zhuǎn)子的選擇）；2、轉(zhuǎn)子與離心機確定，具體顆粒的ω2t是常數(shù)，故可調(diào)整ω與t得相同效果。3、溫度和pH值一般為4℃。穩(wěn)定性好的酶，可取室溫；超高速離心需冷凍。pH值應(yīng)處于酶穩(wěn)定的pH范圍。第二節(jié)、酶的初步分離純化一、酶的提取二、酶的沉淀分離三、膜過濾酶的提?。菏侵冈谝欢ǖ臈l件下，用適當(dāng)?shù)娜軇┗蛉芤禾幚砗冈希姑赋浞秩芙獾饺軇┗蛉芤褐械倪^程。也稱為酶的抽提。一、酶的提取(extraction)

提取目標(biāo)：

a.將目的酶最大限度地溶解出來。

b.保持生物活性。注意：溫度升高，溶解度加大。但為防止酶失活，一般采用低溫下（0-10℃）操作。提取原則

a.相似相溶。

b.遠離等電點的pH值，溶解度增加酶的主要提取方法提取方法使用的溶劑或溶液提取對象鹽溶液提取0.02～0.5mol/L的鹽溶液用于提取在低濃度鹽溶液中溶解度較大的酶酸溶液提取pH2～6的水溶液用于提取在稀酸溶液中溶解度大，且穩(wěn)定性較好的酶堿溶液提取pH8～12的水溶液用于提取在稀堿溶液中溶解度大且穩(wěn)定性較好的酶有機溶劑提取可與水混溶的有機溶劑用于提取那些與脂質(zhì)結(jié)合牢固或含有較多非極性基團的酶本章目錄酶的提取主要影響因素是酶在所使用溶劑中的溶解度，以及酶向溶劑相中的擴散速度。此外還受到溫度、pH值和提取液體積等提取條件的影響。大多數(shù)蛋白類酶都溶于水，而且在低濃度的鹽存在的條件下，酶的溶解度隨鹽濃度的升高而增加，這稱為鹽溶現(xiàn)象。

二、沉淀分離沉淀分離是通過改變某些條件或添加某種物質(zhì)，使酶的溶解度降低，而從溶液中沉淀析出，與其它溶質(zhì)分離的技術(shù)過程。在生物大分子制備中最常用的幾種沉淀方法：

⑴中性鹽沉淀（鹽析法）⑵有機溶劑沉淀⑶選擇性沉淀（熱變性和酸堿變性）⑷等電點沉淀⑸有機聚合物沉淀1、鹽析沉淀法（改變離子強度）（1）.基本原理（鹽溶和鹽析）向蛋白質(zhì)或酶的水溶液中加入中性鹽，可產(chǎn)生兩種現(xiàn)象：

1)鹽溶（saltingin）：低濃度的中性鹽增加蛋白質(zhì)的溶解度。

2)鹽析（saltingout）：高濃度的中性鹽降低蛋白質(zhì)的溶解度。在某一濃度的鹽溶液中，不同的蛋白質(zhì)溶解度不同，由此可達到分離的目的。蛋白質(zhì)的鹽析原因：高鹽濃度下鹽離子與蛋白質(zhì)分子爭奪水分子，除去蛋白質(zhì)的水合外殼，降低溶解度而沉淀。不同蛋白質(zhì)分子量、表面電荷不同，在不同鹽濃度下沉淀，逐漸增大鹽濃度，不同蛋白質(zhì)先后析出，稱分段鹽析。（2）

鹽析用鹽

1）中性鹽的選擇常用(NH4)2SO4，其突出優(yōu)點：

a.溶解度大

b.分離效果好

c.不易引起變性

d.價格便宜2）鹽濃度的表示

用飽和（溶解）度表示:

溶液中飽和硫酸銨的體積飽和度＝溶液的總體積3)調(diào)整鹽濃度的方式

a.飽和溶液法（添加飽和硫酸銨溶液）適于：蛋白質(zhì)溶液體積不太大，而達到的鹽濃度又不太高時。配制飽和硫酸銨溶液所需添加飽和硫酸銨的體積可按下式計算：

V=V0

式中V,V0——為所需加入的飽和硫酸銨體積及原溶液體積

S2,S1——為所需達到的硫酸銨飽和度和原來溶液的硫酸銨飽和度S2-S11-S2b.添加固體硫酸銨適用于：蛋白質(zhì)溶液原來體積已經(jīng)很大，而要達到的鹽濃度又很高時。按下式計算，得表中數(shù)據(jù)

W=

A,B——常數(shù)，與溫度有關(guān)。實際使用時，可直接查表（各種飽和度下需加固體硫酸銨的量）。B(S2-S1)1-AS2（3）鹽析操作低飽和度：飽和溶液滴加法。易于迅速混合均勻，一般終飽和度不超過40％。高飽和度：固體鹽添加法。不會大量增加溶液體積。操作步驟：

1）固體硫酸銨充分研細，溫和攪拌中緩慢加入。

2）冰箱中（4℃）放置過夜，待沉淀完全后高速離心。

3）沉淀再溶解后可用超濾（ultrafiltration）、透析（dialysis）或?qū)游觯╟hromatography）方法脫鹽。硫酸銨濃度（%）枯草桿菌

-淀粉酶發(fā)酵液的鹽析曲線

（4）鹽析的影響因素1)離子強度和種類（介紹鹽析常數(shù)）蛋白質(zhì)溶解度與鹽濃度之間的關(guān)系：

I：離子強度，I=∑MZ2；

M：離子濃度（mol/L）；

Z：離子價數(shù)

S：離子強度為I時的蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）

S0：離子強度為0時蛋白質(zhì)的溶解度（g/L）

Ks：鹽析常數(shù)，

Ks代表鹽析效率，其含義是隨著鹽濃度的增加，蛋白質(zhì)溶解度降低的速度，Ks越大鹽析效果越好。當(dāng)溫度和pH一定時，S0對于某一溶質(zhì)是常數(shù)，用β表示，鹽析方程式可改寫為：

logS=β-KsI兩種鹽析法：Ks分級鹽析法：在一定的pH和溫度條件下，利用不同蛋白質(zhì)Ks的不同，通過改變離子強度或鹽濃度（即改變I值）的沉淀方法。β分級鹽析法：在一定離子強度下，通過改變?nèi)芤旱膒H及溫度的沉淀方法。2)蛋白質(zhì)濃度：過稀回收沉淀困難，過濃易共沉淀，2.5%-3%最好。3)pH值：等電點處最易沉淀。4)溫度的影響：稀鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度提高。濃鹽溶液中，溫度升高蛋白質(zhì)溶解度下降。一般可在室溫下進行。某些對溫度敏感的酶，可在0℃～4℃下操作。

2、有機溶劑沉淀（降低介電常數(shù)）利用酶等蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度不同而使之分離的方法。

（1）沉淀機理

降低溶液的介電常數(shù)破壞蛋白質(zhì)表面水膜

（2）常用有機溶劑丙酮

乙醇

甲醇，用量一般為酶液體積的2倍左右，終濃度為70%。

有機溶劑之所以能使酶沉淀析出。主要是由于有機溶劑的存在會使溶液的介電常數(shù)降低。例如，20℃時水的介電常數(shù)為80，而82％乙醇水溶液的介電常數(shù)為40。

溶液的介電常數(shù)降低，就使溶質(zhì)分子間的靜電引力增大，互相吸引而易于凝集，同時，對于具有水膜的分子來說，有機溶劑與水互相作用，使溶質(zhì)分子表面的水膜破壞，也使其溶解度降低而沉淀析出。本節(jié)目錄（3）優(yōu)缺點：優(yōu)點：1）分辨率比鹽析法高

2）沉淀不需脫鹽

3）溶劑易蒸發(fā)，沉淀易離心缺點：1）容易引起蛋白質(zhì)變性失活

2)有機溶劑易燃、易爆，對安全要求較高。（4）影響有機溶劑沉淀的因素

1）溫度：低溫（0℃）操作。

2）pH值：盡可能靠近其等電點。

3）離子強度：采用<0.05mol/L的稀鹽溶液增加蛋白質(zhì)在有機溶劑中的溶解度，目的防止蛋白質(zhì)變性

4）蛋白質(zhì)濃度：適當(dāng)，一般為5?20mg/ml3、等電點沉淀(isoelectricprecipitation)（1）原理蛋白質(zhì)在等電點時溶解度最低不同的蛋白質(zhì)具有不同的等電點

（2）使用方法單獨使用較少（用于從粗酶液中除去某些等電點相距較大的雜蛋白），多與其它方法聯(lián)合使用（如鹽析法、有機溶劑法），因蛋白質(zhì)在等電點時仍有一定的溶解度。（3）優(yōu)點：大多數(shù)蛋白質(zhì)的pI都在偏酸性范圍內(nèi)無機酸（如磷酸、鹽酸、硫酸）價格較低無需除掉多余酸即可進行下一步純化（4）缺點：

酸化時，容易引起蛋白質(zhì)失活4、有機聚合物沉淀法

（1）作用機理：與有機溶劑類似，是發(fā)展較快的一種新方法。（2）沉淀劑：常用聚乙二醇（Polyethyeneglycol，簡寫PEG）多用分子量為6000～20000的PEG。（3）優(yōu)點：操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。沉淀效能高，使用少量的PEG即可沉淀相當(dāng)多的生物大分子。沉淀后有機聚合物容易去除。5、選擇性變性沉淀法

選擇一定的條件使溶液中存在的某些雜蛋白質(zhì)變性沉淀而不影響所需蛋白質(zhì)的方法。

⑴熱變性幾乎所有的蛋白質(zhì)都因加熱變性而凝固，加熱升高溫度使雜蛋白變性沉淀而保留目的物在溶液中。

⑵pH變性等電點沉淀法是pH變性法中的一種變體。⑶有機溶劑變性使那些對有機溶劑敏感的雜蛋白變性沉淀三、過濾與膜分離過濾是借助于過濾介質(zhì)將不同大小、不同形狀的物

質(zhì)分離的技術(shù)過程。過濾介質(zhì)多種多樣，常用的有：濾紙、濾布、纖維、多孔陶瓷、燒結(jié)金屬和各種高分子膜等，可以根據(jù)需要選用。過濾非膜過濾：采用高分子膜以外的物質(zhì)作為過濾介質(zhì)

膜過濾：采用各種高分子膜為過濾介質(zhì)

過濾的分類及其特性(根據(jù)過濾介質(zhì)截留的物質(zhì)顆粒大小不同

)

類別截留顆粒大小截留的主要物質(zhì)過濾介質(zhì)粗濾>2μm酵母、霉菌、動物細胞、植物細胞、固形物等濾紙、濾布、纖維多孔陶瓷、燒結(jié)金屬等微濾0.2～2μm細菌、灰塵等微濾膜、微孔陶瓷超濾20?～0.2μm病毒、生物大分子等超濾膜反滲透<20?生物小分子、鹽、離子反滲透膜膜過濾借助于一定孔徑的高分子薄膜，將不同大小、不同形狀和不同特性的物質(zhì)顆?；蚍肿舆M行分離的技術(shù)稱為膜分離技術(shù)。膜分離所使用的薄膜主要是由丙烯腈、醋酸纖維素、賽璐玢以及尼龍等高分子聚合物制成的高分子膜。有時也可以采用動物膜等。膜分離過程中，薄膜的作用是選擇性地讓小于其孔徑的物質(zhì)顆?；蚍肿油ㄟ^，而把大于其孔徑的顆粒截留。膜的孔徑有多種規(guī)格可供使用時選擇。根據(jù)顆?；蚍肿油ㄟ^薄膜的原理和推動力不同分三類。1、加壓膜分離以薄膜兩邊的流體靜壓差為推動力；根據(jù)截留的顆粒大小可分為3種；

微濾截留的物質(zhì)顆粒直徑為0.2～2um，操作壓力0.1MPa以下。MEF微濾器超濾Millipore小型切向流超濾系統(tǒng)截留的物質(zhì)顆粒直徑為20～2000?（0.2um）；可同時截留菌絲體和可溶性蛋白。

操作壓力50～700KPa；特別適于液體酶制劑的生產(chǎn)；對需要輔酶的酶的生產(chǎn)不適用；一種動態(tài)過程，由泵提供推動力，在膜表面產(chǎn)生兩個分力：一個是垂直于膜面的法向分力，使水分子透過膜面，另一個是于膜面平行的切向力，把膜面截流物沖掉。

超濾原理的示意圖

常規(guī)過濾(A)和超濾(B)的示意圖

AB不同形式超濾系統(tǒng)超濾特點超乎尋常的膜通量，且維持恒定適合處理高粘度、高含固量料液濃縮倍數(shù)極高，可使?jié)饪s液呈糊狀消除濃差極化，不易堵塞，易清洗系統(tǒng)可逐級拓展，中試結(jié)果完全適用于生產(chǎn)規(guī)模反滲透（RO

）膜孔徑小于20?，操作壓力為0.7～13MPa。利用反滲透膜選擇性地只能透過溶劑(通常是水)的性質(zhì)，對溶液施加壓力，使溶劑通過反滲透膜而從溶液中分離出來的過程。常用于去離子水的制備及海水淡化。根據(jù)膜材料和不同進料液的特性，商品應(yīng)用的膜產(chǎn)品通常采取如下幾種結(jié)構(gòu)形式：管式；中空纖維；卷式；平板式。膜材料形式：膜技術(shù)

截留物尺寸nm（分子量）

推動力

分離機理

微濾MF>20(>40,000)壓力差，>100kPa篩分

超濾UF1～20(10,000--40,000)壓力差，>100kPa篩分

納濾NF>1(100～1000)壓力差，<1000kPa優(yōu)先吸附、表面電位

反滲透RO(>100)壓力差，>1000kPa優(yōu)先吸附、溶解擴散

四種常用膜分離技術(shù)的基本特征四種常用膜分離過程的截留特性本節(jié)目錄ReverseOsmosis(RO)Ultrafiltration(UF)Nanofiltration(NF)Microfiltration(MF)2、電場膜分離在半透膜的兩側(cè)分別裝上正負(fù)極，電場作用下小分子帶電物或離子向與其本身電荷相反的電極移動，透過半透膜，達到分離目的。電滲析離子交換膜電滲析應(yīng)用：脫鹽，海水淡化，純水制備，從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。用離子交換膜代替一般的半透膜。樣品液緩沖液3、擴散膜分離透析膜商品透析膜大多制成管狀。材料：纖維素衍生物。1）透析膜的預(yù)處理：目的：除雜質(zhì)。2）透析袋的保存：防腐劑＋冷藏。第三節(jié)、酶的高度分離一、層析分離二、電泳分離二、層析分離

層析法也稱色譜法，是1903年俄國植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過裝有CaCO3

吸附劑的柱子，然后用石油醚淋洗，各種色素以不同的速率流動后形成不同的色帶而被分開。

色譜組分色素石油醚碳酸鈣顆粒色譜起源用色彩（chroma）和圖譜（graphs）組成色譜一詞，（Chromatography)。層析法的基本原理利用混合物中各組分的物理化學(xué)性質(zhì)(分子大小和形狀、分子極性、吸附力、分子親和力、分配系數(shù)等)的差別，使各組分在流動相和固定相中的分布程度不同，并以不同的速度移動而達到分離的目的。mobilephase：攜帶樣品流過整個系統(tǒng)的流體

stationaryphase：靜止不動的一相層析法的分類按兩相所處的狀態(tài)分類：

液相層析氣相層析液-液層析液-固層析氣-液層析氣-固層析按層析原理分類層析方法分離依據(jù)吸附層析利用吸附劑表面對不同組分吸附性能差異而使混合物中各組分分離分配層析利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離離子交換層析利用離子交換劑上的可解離基團（活性基團）對不同組分的親和力不同，而達到分離目的凝膠層析以各種多孔凝膠為固定相，利用凝膠對相對分子質(zhì)量不同各種組分的阻滯作用不同，而達到物質(zhì)分離親和層析利用生物分子與配基之間所具有的專一而又可逆的親和力，使生物分子分離純化層析聚焦將酶等兩性物質(zhì)的等電點特性與離子交換層析的特性結(jié)合在一起，實現(xiàn)組分分離按操作形式不同分類：柱層析：將固定相裝于柱內(nèi)，使樣品沿一個方向移動而達到分離。紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣后，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。薄層層析：將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質(zhì)的分離和鑒定。（一）吸附層析（adsorptionchromatography）原理利用固定相的固體吸附劑表面對不同組分吸附力的大小及洗脫液對它的溶解作用（解吸作用）的差異進行分離。吸附作用的強弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。常采用柱型裝置，將吸附劑裝在吸附柱中，裝置成吸附層析柱。層析時，欲分離的混合溶液自柱頂加入，當(dāng)樣品液全部進入吸附層析柱后，再加入洗脫劑解吸洗脫。在洗脫時，層析柱內(nèi)不斷發(fā)生解吸、吸附、再解吸、再吸附的過程。

溶劑洗脫法置換洗脫法前緣洗脫法吸附層析操作：2.吸附劑吸附劑通過范德華力、靜電引力、疏水作用等與待分離物質(zhì)的極性官能團作用。1）吸附劑的選擇：根據(jù)吸附能力強弱分為：弱吸附劑：蔗糖、淀粉中等吸附劑：碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等強吸附劑：氧化鋁、活性炭吸附劑的選擇根據(jù)相似相溶原則：極性強的吸附劑易吸附極性強的物質(zhì)非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。但為了便于解吸附，對于極性強的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進行吸附2）吸附劑的性質(zhì)：活性炭：常用的吸附介質(zhì)。硅膠：常用的極性吸附介質(zhì)。羥基磷灰石（HA）

[Ca10(PO4)6.(OH)2]:

微晶型的磷酸鈣制品，表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團；酸性和中性蛋白質(zhì)可與Ca2+結(jié)合；堿性蛋白質(zhì)可與PO43-結(jié)合。吸附原理是HA的Ca2+與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團作用。3.洗脫劑要求：

粘度小，純度高，穩(wěn)定性好，完全洗脫下所要分離的成分,易與目標(biāo)分子分離。選擇：具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動相。生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。常用洗脫劑種類：飽和烴、醇、酮、酚、醚、鹵代烷、水等（二）分配層析分配層析是利用各組分在兩相中的分配系數(shù)不同，而使各組分分離的方法。分配系數(shù)：是指一種溶質(zhì)在兩種互不相溶的溶劑中溶解達到平衡時，該溶質(zhì)在兩項溶劑中的濃度的比值。在層析條件確定后，層析系數(shù)是一常數(shù)。K=固定相中溶質(zhì)的濃度流動相中溶質(zhì)的濃度由于不同溶質(zhì)有不同的分配系數(shù)，移動速度不同，從而達到分離在分配層析中，通常采用多孔性固體支持物（如濾紙、硅藻土、纖維素等）吸著一種溶劑為固定相，這種溶劑在層析過程中始終固定在多孔支持物上。另一種與固定相溶劑互不相溶的溶劑可沿著固定相流動，稱為流動相。當(dāng)某溶質(zhì)在流動相的帶動流經(jīng)固定相時，該溶質(zhì)在兩相之間進行連續(xù)的動態(tài)分配。紙上層析：濾紙為載體，紙上結(jié)合水為固定相，有機溶劑為流動相分配薄層層析：纖維素、硅藻土為支持物。（三）離子交換層析

（ionexchangechromatography，IEC）1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。1）離子交換劑：離子交換劑由載體、電荷基團和反離子構(gòu)成。

如羧甲基纖維素離子交換劑組成纖維素—O—CH2—COO-—Na+

載體電荷基團反離子是含有若干活性基團的不溶性高分子物質(zhì)。通過在不溶性高分子物質(zhì)（母體）上引入若干可解離基團（活性基團）而制成。

化學(xué)原料合成：樹脂類物質(zhì)（酚醛樹脂、苯乙烯樹脂）

載體

天然材料制成：cellulosesephadex

sepharose

陽離子交換劑:電荷基團（－）,反離子（＋）電荷基團陰離子交換劑:電荷基團（＋）,反離子（－）

如：DEAE-纖維素，CM-Sepharose離子交換劑--帶有電荷基團的不溶性載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3載體Cl-Diethylaminoethyl(DEAE)

陰離子交換劑(可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì))

陽離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))兩種離子交換劑陰離子交換劑：常用二乙氨基乙基，二乙氨基乙基2-羥丙基陽離子交換劑：常用羧甲基CM—CH2COO-

磺丙基SP—C3H6SO3-DEAE－C2H4N+(C2H5)2HQAE－C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3離子交換葡聚糖類型說明功能基反離子DEAE-Sephadex

A-25，A-50弱堿性陰離子交換劑二乙氨基己基氯QAE-Sephadex

A-25，A-50強堿性陰離子交換劑二乙氨基己基——2-羥丙基氯CM-Sephadex

C-25，C-50弱酸性陽離子交換劑羧甲基鈉SP-Sephadex

C-25，C-50強酸性陽離子交換劑磺丙基鈉Ion-exchangechromatography（四）凝膠過濾層析凝膠過濾（gelfiltration）又稱分子篩層析（molecularsievechromatography）、排阻層析（exclusionchromatography）,是以各種多孔凝膠為固定相，利用溶液中各組分的分子量不同而進行分離的技術(shù)。1.基本原理

大分子物質(zhì)不能進入凝膠孔內(nèi)，在凝膠顆粒之間的空隙向下移動，并最先被洗脫出來；小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔，流程長而后流出層析柱。凝膠層析柱中裝有多孔凝膠，當(dāng)含有各種組分的混合溶液流經(jīng)凝膠層析柱時，大分子物質(zhì)由于分子直徑大，不能進入凝膠的微孔，只能分布于凝膠顆粒的間隙中，以較快的速度流過凝膠柱。較小的分子能進入凝膠的微孔內(nèi)，不斷地進出于一個個顆粒的微孔內(nèi)外，這就使小分子物質(zhì)向下移動的速度比大分子的速度慢，從而使混合溶液中各組分按照相對分子質(zhì)量由大到小的順序先后流出層析柱，而達到分離的目的。Size-exclusionchromatography凝膠對溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示：

Ve-Vo

Kd=————ViVo——外水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積（ml）Vi——內(nèi)水體積，層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和（ml）Ve——某組分的洗脫體積，從加進層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時的洗脫液體積（ml）凝膠過濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Kd=0時,即Ve=Vo,說明該組分分子量足夠大，不進入微孔，最先流出。Ⅱ.Kd=1時,即Ve=Vo+Vi，說明該組分能進入凝膠的全部內(nèi)空隙，最后流出。Ⅲ.其它組分0<Kd<1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出，Kd大的后流出。分配系數(shù)Kd的意義：1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果，Kd差異大，分離效果好，

Kd差異小，分離效果差。2.凝膠的種類和性質(zhì)1)交聯(lián)葡聚糖凝膠（dextrangel)

商品名:Sephadex

型號

SephadexG－10至G-200G后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。數(shù)字越大，交聯(lián)度越小，孔徑越大，分離范圍越廣。葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù)凝膠型號

顆粒大小/μm

溶脹體積/(ml/g)

分離范圍（Mr）

SephadexG-10

SephadexG-15

SephadexG-25

SephadexG-50

SephadexG-75

SephadexG-100

SephadexG-150SephadexG-2004～120

4～120

50～150

50～150

40～120

40～120

40～120

40～120

2～3

2.5～3.5

4～6

9～11

12～15

15～20

20～30

20～30

小于7×102

小于1.5×103

1.0×103～5.0×103

1.5×103～3.0×1043.0×103～8.0×104

4.0×103～1.0×105

5.0×103～3.0×105

5.0×103～6.0×105

2）瓊脂糖凝膠（agarosegel)商品名:Sepharose

（瑞典）;Bio-GelA(美國）依靠糖鏈之間的次級鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，瓊脂糖密度越大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。Sepharose及Bio-gelA型號

型號

使用范圍（蛋白質(zhì)的分子量）含瓊脂糖（℅）

6BSepharose4B2B104～3×106105～3×107106～108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10～500×10310～150010～500040～15000100～500001000～150000

1086421

3）聚丙烯酰胺凝膠

（polyacrylamidegel）商品名為Bio-Gel,型號從Bio-GelP－2至P-300，P值越大，孔徑也越大。以丙烯酰胺為單體，以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。3.操作：1）凝膠的選擇和處理根據(jù)相對分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號的凝膠介質(zhì)。將干膠懸浮于5~10倍的蒸餾水中，充分溶脹，抽氣，裝柱。2）柱的選擇采用L/D比值高的柱子，可提高分辨率，但影響流速。3）加樣體積不能過多，不超過床體積的5％，脫鹽時可在10％左右。4）洗脫洗脫液與平衡時用的buffer一致。洗速不可過快，保持恒速。5）膠的保存洗脫完畢后，凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài)，不必再生處理。用0.02%NaN3防腐。4.應(yīng)用

1）脫鹽２)生物大分子物質(zhì)的分離純化

3）分子量的測定

4）溶液濃縮（五）親和層析

(AffinityChromatography)

由吸附層析發(fā)展起來的，是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。

1.原理

利用生物大分子間特異的親和力來純化生物大分子，如：抗原和抗體；酶和底物或輔酶或抑制劑；激素和受體；RNA和其互補的DNA等。都是具有專一而又可逆親和力的生物分子對。故此,親和層析在酶的分離純化中有重要應(yīng)用.將待純化物質(zhì)的特異配體通過適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價的連接到載體上，待純化的物質(zhì)可被配體吸附，雜質(zhì)則不被吸附，從層析柱流出，變換洗脫條件，即可將欲分離的物質(zhì)洗脫下來，實現(xiàn)分離提純。親和層析的四個要素親和層析根據(jù)欲分離組分與配基的結(jié)合特性,親和層析可以分為：

共價親和層析 疏水層析 金屬離子親和層析 免疫親和層析 染料親和層析 凝集素親和層析

2.基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求：①高度的親水性。②極低的非特異性吸附性（惰性）。③具有足夠的化學(xué)基團。④適當(dāng)?shù)亩嗫仔?。⑤較好的理化穩(wěn)定性?？杀粦?yīng)用的基質(zhì)（載體）：（按性能優(yōu)劣排序）瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。最常用的是瓊脂糖，Sepharose1B到10B3.配體的選擇一對可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。如抑制劑，底物，抗體，輔酶等。優(yōu)良配體須具備的條件：

1）與待純化的物質(zhì)有較強的親和力。

2）具有與基質(zhì)共價結(jié)合的基團。目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基

所要分離的目的產(chǎn)物

相應(yīng)的配基

酶抗體凝集素激素底物、抑制劑、輔酶（輔因子）抗原、病毒、細胞多糖、糖蛋白、細胞受體受體、載體蛋白4.偶聯(lián)（親和吸附劑的制備）配體一定，改造載體（基質(zhì)）

1）基質(zhì)活化：不同的載體活化需要不同的活化劑。常用：溴化氰（CNBr）、環(huán)氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。

如用CNBr

作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基2）引入連接臂（spacearm）又稱手臂（spacer）“接臂”的目的：

克服影響配基與生物大分子的結(jié)合的空間障礙。“接臂”的途徑：常用二胺化合物（丁二胺、乙二胺、己二胺）。目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應(yīng)。如：AH-Sepharose4B常用手臂5.操作：1）層析前：制備親和層析劑

根據(jù)欲分離物質(zhì)特性配基

根據(jù)配基分子大小及基團特性載體2）洗脫：能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。包括：非專一性洗脫和專一性洗脫選擇選擇親和層析劑非專一性洗脫：改變溫度改變pH值改變離子強度專一性洗脫：競爭性洗脫劑（半抗原、抑制劑、底物類似物）競爭性地與

配體結(jié)合被吸附物質(zhì)結(jié)合6.應(yīng)用1）純化大分子物質(zhì)如：純化糖蛋白用凝集素（能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)），Lectin-Sepharose4B2)研究酶的結(jié)構(gòu)與功能：分離有生物活性與失去生物活性的蛋白質(zhì)。(六)高效（壓）液相層析（HPLC）特點：①使用的固相支持劑顆粒很細，表面積很大,因而分辨率很高。②溶劑系統(tǒng)采用高壓，因此洗脫速度增大。固定相（柱填料）：常用堅硬、耐高壓，粒度小的硅膠。顆粒大小對分辨率的影響流速為240ml/hr流速對分辨率的影響顆粒大小為50－80目PrinciplesofOperationfor

ChromatographyTechniquesGelFiltrationIonExchangeHydrophobicInteractionAffinityReversedPhase許多類型的柱層析都可用HPLC來代替，如離子交換層析、吸附層析、凝膠過濾等。分類

按溶質(zhì)（樣品）在兩相分離過程的物理化學(xué)性質(zhì)分類：親和色譜：——親和力吸附色譜：——吸附力離子交換色譜：——離子交換能力凝膠色譜：——分子大小而引起的體積排阻分配色譜：——分配系數(shù)色譜儀組成

1）進樣系統(tǒng)

2）輸液系統(tǒng)

3）分離系統(tǒng)

4）檢測系統(tǒng)

5）數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)三、電泳分離電泳（electrophoresis,EP）：指帶電粒子在電場中向著與其所帶電荷性質(zhì)相反的電極方向移動的過程。電泳技術(shù)是根據(jù)各種帶電粒子在電場中遷移速度的不同而對物質(zhì)進行分離的實驗技術(shù)。原理:在一定pH條件下（用buffer），不同大小、形狀及帶電顆粒在電場中的移動速度不同（用遷移率表示），各自集中到特定的位置上而形成緊密的泳動帶。

遷移率與內(nèi)在特性和外界條件有關(guān)內(nèi)在特性：顆粒性質(zhì)（凈電荷量，顆粒大小、形狀）外界條件：電場強度、溶液性質(zhì)、支持體特性電泳的分類自由界面電泳：又稱移動界面電泳（movingboundaryelectrophoresis,MBEP），指在沒有支持介質(zhì)的溶液中進行的電泳。區(qū)帶電泳:（zoneelectrophoresis,ZEP）指有支持介質(zhì)的電泳，待分離物質(zhì)在支持介質(zhì)上分離成若干區(qū)帶。支持介質(zhì)的作用:防止電泳過程中的對流和擴散。區(qū)帶電泳分類：按支持介質(zhì)種類的不同，區(qū)帶電泳可分為：①紙電泳：用濾紙作為支持介質(zhì)，多用于核苷酸的定性定量分析。②薄層電泳：將支持物與緩沖液調(diào)制成適當(dāng)厚度的薄層進行電泳的技術(shù)。

常用的支持物有淀粉、纖維素、硅膠、瓊脂等③薄膜電泳：以醋酸纖維等高分子物質(zhì)制成的薄膜為支持物。醫(yī)學(xué)上，常用于分析血清蛋白、胎盤球蛋白，優(yōu)點是簡便迅速，便于保存照相，比紙電泳分辨率高。④凝膠電泳：以多孔凝膠作為支持物。同時具有電泳和分子篩的雙重作用。具有很高的分辨率。瓊脂糖凝膠電泳：一般用于核酸的分離分析。瓊脂糖凝膠孔徑度較大，對大部分蛋白質(zhì)只有很小的分子篩效應(yīng)。聚丙烯酰胺凝膠電泳：可用于核酸和蛋白質(zhì)的分離、純化及檢測。分辨率較高。電泳常用設(shè)備（1）電泳儀：為電泳提供穩(wěn)定直流電源的裝置。

常壓電泳儀（600V）

高壓電泳儀（3000V）

超高壓電泳儀（30000V～50000V）（2）電泳槽：

自由界面電泳槽管狀電泳槽板狀電泳槽（3）附屬設(shè)備：水平板式電泳槽垂直板式電泳槽（一）聚丙烯酰胺凝膠電泳

（polyacrylamidegelelectrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種電泳方法。聚丙烯酰胺凝膠是由丙烯酰胺單體（acrylamide，簡稱Acr）和交聯(lián)劑N，N’-甲叉雙丙烯酰胺（methylane

bisacrylamide，簡稱Bis）在催化劑和加速劑作用下聚合的。CH2=CHC=ONH2CH2=CH

C=ONHCH2NHC=OCH2=CH-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONH2NHCH2NHC=O-CH2-CH-[CH2-CH-]nCH2-CH-C=OC=ONHNH2丙烯酰胺N,N’-甲叉雙丙烯酰胺聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺凝膠聚合的催化體系有兩種：1）化學(xué)催化系統(tǒng)：AP-TEMED

催化劑：過硫酸銨（ammoniumpersulfate，AP）加速劑：TEMED（N，N，N’，N’-四甲基乙二胺）2）光催化系統(tǒng)：核黃素－光－（TEMED）催化劑:核黃素（維生素B2）

引發(fā)劑:光

TEMED的存在，可加速聚合。PAGE根據(jù)其有無濃縮效應(yīng)，分為：連續(xù)電泳（continuouselectrophoresis）采用相同孔徑的凝膠和相同的緩沖系統(tǒng)不連續(xù)電泳（discontinuouselectrophoresis）

采用不同孔徑的凝膠和不同緩沖體系電荷效應(yīng)不連續(xù)PAGE分子篩效應(yīng)濃縮效應(yīng)連續(xù)PAGEPAGE電泳分類濃縮膠、分離膠不連續(xù)電泳：

1.凝膠由上、下兩層凝膠組成，兩層凝膠的孔徑不同，上層為大孔徑的濃縮膠，下層為小孔徑的分離膠。

2.緩沖液離子組成及各層凝膠的pH不同。電極緩沖液為pH8.3的Tris-甘氨酸緩沖液，濃縮膠為pH6.7的Tris-HCl緩沖液，而分離膠為pH8.9的Tris-HCl緩沖液。

3.在電場中形成不連續(xù)的電位梯度。因此，在這樣一個不連續(xù)的系統(tǒng)里，存在三種物理效應(yīng)，即樣品的濃縮效應(yīng)，凝膠的分子篩效應(yīng)和電荷效應(yīng)，提高了分辨率。1）電荷效應(yīng):分離膠中，蛋白質(zhì)表面凈電荷不同，遷移率不同。2）分子篩效應(yīng)：大小和形狀不同的樣品分子通過一定孔徑的分離膠時，受阻滯的程度不同而表現(xiàn)出不同的遷移率。3）濃縮效應(yīng)：使樣品在濃縮膠中被濃縮成一條窄帶，然后再進入分離膠進行分離。SDS－聚丙烯酰胺凝膠電泳十二烷基硫酸鈉－聚丙烯酰胺凝膠電泳是目前測定蛋白質(zhì)亞基相對分子量（relativemolecularmass,Mr）的一種最好的辦法。

SDSseparatesproteinsbyMW原理：SDS帶有大量負(fù)電荷，與蛋白質(zhì)結(jié)合后消除或掩蓋了不同種類蛋白質(zhì)間原有電荷的差異。

SDS破壞蛋白質(zhì)構(gòu)象，使蛋白質(zhì)－SDS復(fù)合物形狀近似棒狀，短軸相同（1.8nm），長軸與蛋白質(zhì)分子量成正比。因此，蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物(SDS-denaturedprotein)在凝膠中的遷移率不受蛋白質(zhì)原有電荷和形狀的影響，只與蛋白質(zhì)分子量有關(guān)。兩者關(guān)系：蛋白質(zhì)的遷移率與分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系，符合下式：logMW=K-bXMW：分子量；X：遷移率；k、b均為常數(shù)將已知分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相同條件下進行電泳，根據(jù)其相對遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量。操作1）制膠:

（變性：buffer中加0.4%SDS）

a.分離膠：根據(jù)待分離樣品的分子大小選擇一定濃度的分離膠（查表），配制分離膠溶液：

Acr:Bis=29:1，分離膠buffer,TEMED,AP,水迅速倒膠，加水使液面平坦，室溫0.5h聚合完全。

b.濃縮膠：用濃縮膠buffer。插上梳子。2）樣品制備：

a.PAGE:樣品＋樣品緩沖液（蔗糖或甘油＋指示劑溴酚藍）

b.SDS:樣品＋樣品緩沖液（SDS，甘油，巰基乙醇，溴酚藍），煮沸2~5min，以除去亞穩(wěn)態(tài)聚合。3）加樣及電泳：

SDS:電極buffer中加0.1%SDS，溴酚藍距下端1cm時停止電泳。4）固定及染色

a.固定：將凝膠浸于7％乙酸或12.5％三氯乙酸中固定蛋白質(zhì)組分。

b.染色：

考馬斯亮藍染色法

銀染法（靈敏度比前者高100倍）其它的染色方法：氨基黑、阿爾辛藍，過碘酸－Schiff試劑（糖蛋白（二）、等電聚焦(isoelectricfocusing，IEF)利用蛋白質(zhì)具有不同等電點的特性，以聚丙烯酰胺為電泳支持物，在其中加入載體兩性電解質(zhì)（商品名：Ampholine，一種含有各種連續(xù)

pI

的小分子混合物）的電泳方法稱聚丙烯酰胺等電聚焦電泳（IEF）。原理兩性電解質(zhì)載體在電場作用下，按各自pI形成從陽極到陰極逐漸增加的連續(xù)的pH梯度。當(dāng)酶或其它兩性電解質(zhì)進入此體系時，不同的兩性電解質(zhì)即移動到（聚焦于）與其等電點相當(dāng)?shù)奈恢蒙?，從而使不同等電點的物質(zhì)得以分離。兩性電解質(zhì)載體(carrierampholytes)(1)易溶于水，有足夠的緩沖能力——以便保持穩(wěn)定的pH梯度。

(2)導(dǎo)電性能好——以保持電場強度的均勻性。

(3)分子量小——電泳后易分離除去。

(4)化學(xué)組成不同于蛋白質(zhì)——不干擾測定。

兩性電解質(zhì)載體是由許多種多烯多胺（如五乙烯六胺等）與丙烯酸進行加成反應(yīng)而制備得到的混合物。目前有商品出售，如Ampholine,Phamalyte等。等電聚焦電泳

操作：

1）凝膠配制：凝膠濃度T為5％~7.5％（C=3%左右）

2）加樣：任意位置

3）電泳：