【解淀粉芽孢桿菌中磷代謝途徑相關(guān)基因分析4000字】

解淀粉芽孢桿菌中磷代謝途徑相關(guān)基因研究TOC\o"1-3"\h\u273081引言 178381.1解淀粉芽孢桿菌中的磷 16331.1.1磷的作用 154441.1.2磷的存在狀態(tài) 1106172研究所需材料與方法 2122982.1材料 261382.1.1菌株 2239892.1.2主要試劑和儀器 26562.1.3培養(yǎng)基 296752.2方法 2273662.2.1植物病原真菌拮抗實(shí)驗(yàn) 288592.2.2菌株總DNA提取 3276752.2.3全基因測(cè)序 3278243基因的分析 317673.1基因組組分分析 327673.2基因功能分析 3215403.2.1BS-3的進(jìn)化和比較基因組學(xué)分析 3212263.2.2拮抗物質(zhì)分析 330835結(jié)論 519381參考文獻(xiàn) 6摘要磷素是一種重要的養(yǎng)分，對(duì)植物的健康生長(zhǎng)起到很大的作用，但它容易被固定在土壤中，從而影響了它的有效性。所以有關(guān)磷素代謝的有效研究引起了植物學(xué)家的高度重視。本文綜述了解淀粉芽孢桿菌的演化與比較基因組學(xué)，以及拮抗性物質(zhì)的分析，討論了其在磷代謝方面的重要作用，以及未來(lái)需要進(jìn)一步開(kāi)展的工作。關(guān)鍵詞：磷代謝；解淀粉芽孢桿菌；基因分析1引言1.1解淀粉芽孢桿菌中的磷1.1.1磷的作用作為不可或缺的一種元素，磷這種生物營(yíng)養(yǎng)素處于原生質(zhì)里也必不可少，高能磷酸鍵作為一種載體參與了植物的光合作用和生物內(nèi)部的化學(xué)過(guò)程。由于空氣中沒(méi)有含磷的氣體，所以土壤中的磷元素與碳、氮、硫等生物元素循環(huán)不同，其并未擁有氣態(tài)階段。它是一種在土壤與各種植物以及微生物之間進(jìn)行的沉淀循環(huán)。在無(wú)擾動(dòng)的生態(tài)系統(tǒng)中，磷素循環(huán)處于封閉狀態(tài)，大部分磷元素通過(guò)植物殘骸中的磷回收，而磷則通過(guò)微生物的作用實(shí)現(xiàn)。在農(nóng)業(yè)生態(tài)循環(huán)系統(tǒng)中，磷的流失主要是因?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品的清除，以及地表水分的流動(dòng)和沖刷，從而致使磷元素的流失，所以磷元素是以開(kāi)放的模式進(jìn)行循環(huán)。1.1.2磷的存在狀態(tài)土壤中磷主要以兩種形式存在，分別是有機(jī)和無(wú)機(jī)兩種形式。土壤無(wú)機(jī)磷和有機(jī)磷各自占一半的趨勢(shì)，按照分布的情況分析，主要的成分為原生和礦生，原生礦石成分分析來(lái)看，其主要性質(zhì)是磷灰石，元素是氟和磷。次生礦物主要以磷酸鹽沉淀的形式存在，其形態(tài)可分為封閉儲(chǔ)存狀態(tài)和不封閉儲(chǔ)存兩類。封閉儲(chǔ)存磷酸鹽是指被氧化鐵膜包覆的磷酸鐵和磷酸鋁，其生物活性低，磷容量低。非閉蓄態(tài)磷酸鹽包括三種形式：磷酸鐵、磷酸鋁、磷酸三鈣。在特定的環(huán)境中，這三種形式的磷可以被釋放，被植物所吸收。有機(jī)磷占土壤中全磷總量的1/2~1/3中，其中一半的含量為磷酸肌醇（2%~50%），磷脂含量為1%，核酸含量為3%，磷蛋白與磷酸糖含量較少。其余一半的物種的化學(xué)結(jié)構(gòu)和特性尚不明確。土壤中的有機(jī)磷是無(wú)法被植物直接吸收的，只有通過(guò)微生物將其轉(zhuǎn)化為可利用的無(wú)機(jī)物質(zhì)。土壤中包含的能被植物吸收的無(wú)機(jī)磷含量較低，僅為總P值的2%~3%。土壤中包含的有效無(wú)機(jī)磷與土壤中的總P值通常沒(méi)有直接關(guān)系，也就是說(shuō)，當(dāng)土壤中全P值水平高時(shí)，不一定能提供足夠的無(wú)機(jī)磷，反之，當(dāng)土壤中的P值水平較低時(shí)，就說(shuō)明土壤中的無(wú)機(jī)磷水平較低。這是由于施用于土壤中的可溶性磷肥，一部分可以被農(nóng)業(yè)作物所吸收，而另外一些則會(huì)與土壤中的成分發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，從而進(jìn)入到土壤中，從而形成難以被植物所利用的形式。磷的固定主要有兩種，一種是吸附，一種是沉淀。近代學(xué)者進(jìn)一步把磷的固定機(jī)理分為物理吸附、化學(xué)吸附、陰離子交換、表面沉淀、分離固相沉淀等。土壤中磷的固定現(xiàn)象說(shuō)明，即使在高磷水平的情況下，能夠供給作物生長(zhǎng)的有效磷水平也是非常低的。土壤磷元素的循環(huán)系統(tǒng)主要圍繞著微生物的活動(dòng)。土壤中的微生物活性在很大程度上決定著土壤中的磷的轉(zhuǎn)化與效率。國(guó)內(nèi)外已有大量的研究表明，土壤中含有多種微生物，這些微生物可以把植物所不能吸收的磷轉(zhuǎn)變成可以被吸收的形式。2研究所需材料與方法2.1材料2.1.1菌株從云南省景洪市的橡膠樹(shù)根分離得到的解淀粉芽孢桿菌BS-3，具有廣泛的抗菌活性作用，目前已在云南省農(nóng)科院植物保護(hù)和微生物應(yīng)用研究中心進(jìn)行了初步的研究和保存。植物病原真菌：橡膠樹(shù)棕色根霉素、炭疽桿菌尖孢菌、小孢假單胞菌和橡膠疫霉均保存在云南熱帶作物研究所植物保護(hù)與微生物利用研究中心。2.1.2主要試劑和儀器細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒，北京2000，北京天根生化技術(shù)公司，布魯克（北京）技術(shù)公司；.應(yīng)用生物系統(tǒng)；電泳儀器，北京千生物技術(shù)有限公司；納米滴2000，SymerFisher科技有限公司。2.1.3培養(yǎng)基LB培養(yǎng)基（g/L）：馬鈴薯200.0，氯化鈉10.0；蛋白胨10.0，葡萄糖20.0酵母提取物5.0，PDA培養(yǎng)基（g/L）：。在固體培養(yǎng)基中加入15g/L的瓊脂粉。用1×105Pa滅菌30min。2.2方法2.2.1植物病原真菌拮抗實(shí)驗(yàn)將棕色根霉素、炭疽病、小孢子多孢菌和橡膠鼠疫四種病原菌塊放置在PDA平板的中心。BS-3接種在4個(gè)細(xì)菌簇周圍，并用株系標(biāo)記。僅接種致病菌作為對(duì)照，重復(fù)3次，28℃培養(yǎng)5d。測(cè)定抗菌環(huán)的直徑（對(duì)照組菌落生長(zhǎng)直徑÷，治療組菌落生長(zhǎng)直徑）。觀察抗菌效果，并拍照。2.2.2菌株總DNA提取將BS-3菌株接種于LB培養(yǎng)基，在37℃、180r/分鐘的環(huán)境中培養(yǎng)12小時(shí)，用10000xg的培養(yǎng)液進(jìn)行5分鐘的分離來(lái)收集菌塊，用檢測(cè)試劑盒提取基因組。1%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop2000測(cè)定DNA樣品的濃度，純度和降解.2.2.3全基因測(cè)序通過(guò)對(duì)樣品的質(zhì)量檢驗(yàn)，利用Covaris儀器對(duì)DNA進(jìn)行超聲波干擾，建立樣品數(shù)據(jù)庫(kù)。該方法利用二代BGISEQ和PacBio第三代平臺(tái)相互組合的技術(shù)進(jìn)行序列檢測(cè)。3基因的分析3.1基因組分析PB-Falconv2用于第三代閱讀器。2.3由軟件制作，第二代數(shù)據(jù)鑲嵌結(jié)果用波蘭語(yǔ)(Pilonv1.23)進(jìn)行了兩次采集。RepeatMasker(VersionOpen-4.0.5)和TRF(TandemRepeatsFinder，V4.07B)預(yù)測(cè)重復(fù)序列，用基因標(biāo)記(V4.17)預(yù)測(cè)編碼基因。TRNA通過(guò)TrNascan-SE軟件進(jìn)行預(yù)測(cè)(v1.3。1)，RNA采用CMSearch程序檢測(cè)(v1.1RC4)測(cè)定。采用島徑-diomb(V0.2)預(yù)測(cè)基因島，采用Phispy(V2.3)預(yù)測(cè)CRISPR，采用CRISPRDigger(V1.0)預(yù)測(cè)CRISPR。3.2基因功能分析3.2.1BS-3的進(jìn)化和比較基因組學(xué)分析根據(jù)全基因組標(biāo)注信息，選取gyrA基因序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA7.0軟件近似方法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。同時(shí)將BS-3菌株基因組序列與B進(jìn)行比對(duì)?；贛ummers堿基和堿基對(duì)酰基酰胺酮亞屬的參考菌株進(jìn)行了比較。比對(duì)FZB42（CP000560）基因組序列；3.2.2拮抗物質(zhì)分析利用Antismash3.0預(yù)測(cè)菌株BS-3的次生代謝產(chǎn)物合成基因。通過(guò)與NCBIBLAST對(duì)照的基因注釋結(jié)果進(jìn)行分析，對(duì)BS-3次生代謝物中的滅菌物質(zhì)及其編碼基因群進(jìn)行了分析。結(jié)論P(yáng)元素是植物生長(zhǎng)的重要營(yíng)養(yǎng)基礎(chǔ)，而作物對(duì)P元素的吸收與其生物量（r=0.97）、產(chǎn)量（r=0.75）之間存在著極強(qiáng)的相關(guān)性。但是，由于土壤中磷的固定，導(dǎo)致了全球多數(shù)土壤中磷的大量缺乏，而磷供應(yīng)的短缺成為制約我國(guó)農(nóng)業(yè)發(fā)展的主要障礙之一。根據(jù)我國(guó)的國(guó)情，74%的耕地都缺乏P元素，要解決這個(gè)問(wèn)題，只有兩個(gè)辦法：一是加大磷元素源的投入，二是提高土壤中難溶磷的利用。從可持續(xù)發(fā)展角度來(lái)看，第一條道路存在著問(wèn)題，其一是磷是一種不可再生的能源，以目前已知的磷礦儲(chǔ)量和開(kāi)采率來(lái)看，全球磷礦資源僅能支撐100年，同時(shí)，我國(guó)磷礦資源貧乏，品位低下，磷肥料主要依靠進(jìn)口。其次，磷肥的產(chǎn)量多少，取決于對(duì)磷酸和硫酸鹽的需求量，能源消耗極大，使農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本大大提高。其三，在含磷較高的石灰性質(zhì)土壤中施用高水溶性磷肥，作物的季節(jié)利用率通常僅為5%~10%，而若算上作物的后期效應(yīng)，其效果也不會(huì)超過(guò)25%。結(jié)果，大多數(shù)的磷肥都以非有效狀態(tài)（難溶狀態(tài)）的形式存在于土壤中。目前已知的土壤中，70%~90%的磷已經(jīng)滲入土壤，形成了一種固定的形式，很難被作物所吸收和利用。根據(jù)黃土高原7個(gè)省份的實(shí)測(cè)結(jié)果，土壤總P值的平均水平比有效磷高250倍；黃淮海平原的黃潮土壤和風(fēng)沙土壤中的P含量均高于土壤有效磷的130~500倍。我國(guó)從1950年開(kāi)始，我國(guó)土壤中經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的積累了6千萬(wàn)噸的難溶性磷，比國(guó)內(nèi)十年的磷肥用量總和還要多。而另一條道路，則是一條具有巨大潛力的道路，即通過(guò)激活土壤中的磷和磷肥來(lái)增強(qiáng)其有效性，從而實(shí)現(xiàn)低投入、高產(chǎn)量的可持續(xù)發(fā)展。第二條道路由三種途徑組成：一是利用植物自身的潛能，通過(guò)選育技術(shù)的革新，對(duì)磷資源高效利用的植物品種進(jìn)行定向選育，以實(shí)現(xiàn)對(duì)我國(guó)土壤中難溶性磷元素的有效利用。二是通過(guò)對(duì)土壤中磷形態(tài)的分析，以及植物吸收磷特點(diǎn)的研究，經(jīng)過(guò)改善實(shí)施磷肥技術(shù)等措施，以提高磷的潛在效用；三是通過(guò)對(duì)土壤中的有效解磷微生物的篩選，開(kāi)發(fā)出解磷劑，或直接施用于土壤中，使土壤中的難溶磷得到有效的釋放。這對(duì)于發(fā)展可持續(xù)、高效率的農(nóng)業(yè)有著重要的戰(zhàn)略意義。參考文獻(xiàn)[1]張紅娜,王靜,劉敬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