醫(yī)學免疫學實驗課件：淋巴細胞功能測定

淋巴細胞功能測定淋巴細胞功能測定的體外試驗淋巴細胞增殖試驗

3H-TdR、MTT、形態(tài)學計數(shù)細胞毒試驗－－NK

51Cr、LDH釋放法、細胞凋亡檢測法分泌功能檢測細胞因子分泌細胞的檢測（ELISPOT）抗體形成細胞的檢測（溶血空斑試驗）T細胞功能檢測

T細胞亞群的檢測

IL-2活性的測定淋巴細胞轉(zhuǎn)化實驗B細胞功能檢測

抗體形成細胞檢測（溶血空斑試驗）

EA花環(huán)試驗（測定Fc受體）

SmIg的測定（直接免疫熒光法）NK細胞活性檢測（細胞毒試驗）吞噬細胞功能檢測NK活性測定何謂NK？—NK概述

NK活性測定實驗原理

實驗材料及試劑

實驗步驟及結(jié)果判讀

屬淋巴細胞；無特異性TCR；無須致敏即直接殺傷靶細胞。表面標記

CD3-、CD56+、CD16+表面受體（1）殺傷細胞活化受體（KAR）結(jié)合靶細胞表面糖類配體，促使NK發(fā)揮殺傷作用。（2）殺傷細胞抑制受體（KIR）識別自身細胞表面MHC-I類分子，產(chǎn)生抑制信號。主要生物學功能

抗感染與抗腫瘤；免疫調(diào)節(jié)自然殺傷細胞

NK細胞不殺傷正常細胞

NK細胞殺傷靶細胞

NK細胞通過ADCC作用殺傷病毒感染的靶細胞NK細胞殺傷靶細胞電鏡圖胞核125I釋放法熒光染料釋放法NK細胞+靶細胞靶細胞溶解、破裂釋放胞漿內(nèi)酶類LDH釋放法胞漿內(nèi)蛋白51Cr釋放法實驗原理效應細胞靶細胞釋放LDH丙酮酸乳酸乳酸脫氫酶(LDH)NAD+NADH+H+PMSNBT

Formazan（OD570nm）實驗材料1、LDH底物溶液（臨用前配制）

2、1%NP-403、1mol/L檸檬酸終止液NBT（硝基氯化四氮唑藍）4mgNAD+（氧化型輔酶I）10mgPMS（吩嗪二甲酯硫酸鹽）1mg混勻后取1.6ml，加1mol/L乳酸鈉0.4ml加入2mlddH2O溶解加入0.1mol/LpH7.4的PBS至10ml實驗步驟效應細胞的制備（分離外周血單個核細胞）靶細胞的制備效-靶細胞相互作用酶促反應結(jié)果判讀取培養(yǎng)24~48hr的靶細胞(K562),洗滌3次（1000rpm×10min）,最后用完全RPMI-1640培養(yǎng)液調(diào)整細胞濃度至1×105/ml,備用。靶細胞的制備：效應細胞的制備（外周血單個核細胞分離）采集靜脈血2ml，加0.2ml肝素溶液（125-250U/ml）抗凝吸取2ml淋巴細胞分層液置10ml離心管中，將管傾斜45°，沿管壁緩緩注入抗凝血離心2000rpm×20min密度梯度離心分離外周血單核細胞用完全RPMI-1640定容細胞，計數(shù)后調(diào)整細胞濃度（加入0.2ml完全RPMI-1640，混勻）將所得PBMC用5倍體積的1640洗滌一次2000rpm×5min將毛細吸管直接伸到灰白色層（在血漿和分層液間），輕輕地吸取該層細胞（即為PBMC）效-靶細胞作用將效應細胞和靶細胞各0.1ml(E/T=100:1)加入96孔細胞培養(yǎng)板的孔中,每份標本設2個復孔,同時設靶細胞自然釋放對照組

(0.1ml靶細胞+0.1mlRPMI-1640液)最大釋放對照組

(0.1ml靶細胞+0.1ml1％NP-40液),1000r/min,2min后,置37℃、5％CO2溫箱中孵育2-4h。A

123456789101112

實驗組自然釋放組最大釋放組

123456效應細胞（100μl）++----靶細胞（100μl）

++++++RPMI1640（100μl）--++--1%NP-40（100μl）----++酶促反應置37℃預溫10min,加入新鮮配制的底物溶液0.1ml,37℃避光反應10～15min。終止酶促反應（用毛細吸管滴一滴1mol/L檸檬酸30μl）A

123456789101112結(jié)果計算用酶標檢測儀在570nm波長下讀取各孔OD值,并計算NK細胞活性。實驗組OD值-自然釋放對照組OD值NK細胞活性（%）最大釋放對照組OD值-自然釋放對照組OD值=×100%1、無論采用何種試驗方法,靶細胞的質(zhì)量是影響細胞標記率、自然釋放率及實驗穩(wěn)定性的重要因