大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及重組子的轉(zhuǎn)化實驗報告

大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備及重組子的轉(zhuǎn)化-實驗報告大腸桿菌，是一種伴隨我們終生的細菌，也是生物實驗常用的模式生物。通過感受態(tài)細胞的制備和宿主細胞的轉(zhuǎn)化等操作實現(xiàn)基因工程改造，大腸桿菌便成為基因工程菌，并造福人類。本期科創(chuàng)科普就讓我們一起來了解相關(guān)的實驗操作及原理吧！10000X大腸桿菌電鏡圖Part01大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備如果我們直接將外源DNA和宿主細胞放在一起，由于細胞膜具有選擇透性，外源DNA無法穿過細胞膜進入宿主細胞。因此我們需要制備感受態(tài)細胞，改變細胞膜結(jié)構(gòu)，增加其通透性，然后才可以進行外源DNA的導入。在本次介紹中，我們采用最常見的CaCl2法進行感受態(tài)細胞的制備。大腸桿菌感受態(tài)細胞圖[1]CaCl2法的優(yōu)缺點及原理優(yōu)點：操作簡單,重復性好。缺點：影響因素較多,若不注意細節(jié)和條件實驗容易失敗。[2]Ca2+改變細胞膜通透性的原理：非生理條件的Ca2+濃度下，一方面，高濃度的Ca2+聚集在細胞表面改變細胞壁的滲透性，使外源DNA更易接近細胞膜；另一方面，少量Ca2+進入細胞，可在細胞膜上形成新的通道，為外源DNA進入細胞提供條件。[3]實驗步驟大腸桿菌感受態(tài)細胞制備實驗步驟圖這個實驗看起來簡單重復；其實不然，感受態(tài)細胞的制備有很多影響因素，哪怕只是濃度的些許差別，都可能使轉(zhuǎn)化效率下降幾個數(shù)量級。影響大腸桿菌感受態(tài)細胞制備的因素Ca2+終濃度：Ca2+終濃度是維持細胞膜通透性的關(guān)鍵因素。當Ca2+濃度在100mmol·L-1時，質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率最高，而大腸桿菌攝取DNA的能力不受轉(zhuǎn)化前是否經(jīng)過Ca2+處理的影響。[2]數(shù)據(jù)來源[4]CaCl2的滅菌方式：不可采用高溫滅菌法，高溫滅菌法并不能有效除去雜質(zhì)，反而會使溶劑減少，形成沉淀物，影響溶液的pH值；應采用過濾滅菌法，可避免上述缺點。[1]大腸桿菌的生長狀態(tài)：其理想狀態(tài)是處于對數(shù)生長早期，生長過度或者發(fā)育不全的細菌制備感受態(tài)細胞的轉(zhuǎn)化率都較低。[2]離心速度和時間：經(jīng)過CaCl2處理后的大腸桿菌處于膨脹狀態(tài)，過快過久的離心會損傷細胞。[2]More：除了CaCl2法，還有TSS法、甘油-聚乙二醇法、電轉(zhuǎn)化技術(shù)、超聲波轉(zhuǎn)化，前兩種為化學法，后兩種為物理法。感興趣的同學可以自行了解。Part02受體細胞的轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞制備完成后，接下來是質(zhì)粒的導入和相應性狀的表達。EGFP（綠色熒光蛋白）的介紹明明有這么多熒光蛋白，為什么我們選擇GFP呢？綠色熒光蛋白于1962年被日本科學家下村修發(fā)現(xiàn)并分離，是最早被發(fā)現(xiàn)的熒光蛋白，因此它是最為我們所熟悉的一種熒光蛋白。當然，GFP的優(yōu)點不止這一個，現(xiàn)在有了加強版EGFP，讓其熒光更加明顯。而其他的熒光蛋白會有光譜重疊，普通的熒光顯微鏡不易看清。所以我們選擇使用EGFP。實驗步驟以及現(xiàn)象的觀察五步教你輕輕松松導入質(zhì)粒冰浴→熱激→冰浴→復蘇→涂布培養(yǎng)Q1：為什么采用冷熱交替的方式？A1：細菌處于0℃，CaCl2的低滲溶液中，大腸桿菌會膨脹成球形，轉(zhuǎn)化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面（因為DNase會消化外源DNA，所以形成抗DNase的物質(zhì)有利外源DNA的生存），從低溫突然提高到42℃短時間熱刺激，應激反應下可產(chǎn)生大量可改變細胞膜通透性的cAMP，促使細胞吸收外源DNA，從而大大提高轉(zhuǎn)化率。Q2：如何看到綠色熒光？A2：取大腸桿菌培養(yǎng)液，離心，棄上清液，無菌水洗滌后置于載玻片上，可用熒光顯微鏡在紫外光下進行鏡檢。[5]當然，在紫外光下，表達了綠色熒光蛋白的單菌落也會發(fā)出肉眼可見的綠色熒光。熒光顯微鏡下大腸桿菌細胞團[6]紫外光下大腸桿菌單菌落大腸桿菌的轉(zhuǎn)化實驗是一個經(jīng)典的標準實驗，通過本期科創(chuàng)科普，相信大家都對感受態(tài)細胞的制備和受體細胞的轉(zhuǎn)化實驗有了一定了解。本期的科創(chuàng)科普就到這里啦，我們下期再見。參考文獻：[1]謝志雄,陳向東,李文化,沈萍,龐代文.大腸桿菌HB101感受態(tài)細胞的嫌我觀察與分析.武漢大學學報(理學版),2002,(02),253-256+132[2]郭夢桃,吳靖芳.大腸桿菌感受態(tài)細胞制備及轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀.河北北方學院學報(自然科學版),2020,36(08),44-48[3]李文化.Ca2+誘導對大腸桿菌攝取外源DNA的研究.[D].武漢,武漢大學生命科學學院.2004,04[4]梅運軍,陳向東,謝志雄,沈萍,李文化.Ca2+對誘導大腸桿菌攝取外源DNA的影響武漢大學學報(理學版),2012,58(04),354-358DOI:10.14188/j.1671-8836.2012.04.018[5]趙仲麟,袁超,朱偉,蘇同福,潘振良,金顯春.化學生物學綜合創(chuàng)新設(shè)計實驗——大腸桿菌中表達綠色熒光蛋白.江西農(nóng)業(yè)學報,2011,23(08),167-168+171DOI:10.193