結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義

結(jié)核病實驗室檢查的臨床意義結(jié)核病概況病原學(xué)1882年德國柯赫醫(yī)生發(fā)現(xiàn)結(jié)核致病菌----結(jié)核桿菌1897年提出結(jié)核病的飛沫傳播1922年，卡介苗為預(yù)防結(jié)核病首次對新生兒接種1945年，鏈霉素的問世使肺結(jié)核不再是不治之癥?！?998年完成了結(jié)核分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株H37Rv的基因組測序流行病學(xué)結(jié)核病是人類疾病中最古老的傳染病之一在全球所有傳染病中，結(jié)核病已成為成年人的首要死因耐藥性是使結(jié)核病可能再次成為難治之癥及疫情上升的主要因素

全國感染者近3.3億，患者590余萬，占世界患者的1/4病因抗酸桿菌，對外界的抵抗力較強，生長緩慢

菌體成份含有類脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、多糖類人型和牛型結(jié)核菌是人類主要致病菌病灶中包括數(shù)種不同生長速度的結(jié)核菌

在繁殖過程中由于染色體基因突變而產(chǎn)生耐藥性

結(jié)核菌發(fā)病機制

結(jié)核菌入侵人體后4-8周，機體對結(jié)核菌及其代謝產(chǎn)物所發(fā)生的敏感反應(yīng)稱為變態(tài)反應(yīng)結(jié)核病的變態(tài)反應(yīng)可引起發(fā)熱、乏力、多發(fā)性關(guān)節(jié)炎、皮膚結(jié)節(jié)性紅斑、皰疹性角-結(jié)膜炎

非特異性免疫（先天免疫力）：人體對結(jié)核菌的自然免疫力特異性免疫力（后天性免疫力）：接種卡介菌后經(jīng)過結(jié)核菌感染所獲得的免疫力

免疫變態(tài)反應(yīng)

人體的反應(yīng)性

呼吸道感染是肺結(jié)核的主要感染途徑，飛沫感染為最常見的方式，傳染源主要是排菌的肺結(jié)核患者（尤其是痰涂片陽性）的痰液，僅當(dāng)受大量毒力強的結(jié)核菌侵襲而機體免疫力不足時才能發(fā)病

感染途徑初次感染與再次感染（1）初次感染淋巴結(jié)腫大、可向全身播散（2）再次感染常表現(xiàn)為局部組織反應(yīng)劇烈不易引起淋巴結(jié)腫大不易發(fā)生全身播散病理滲出為主的病變發(fā)生于變態(tài)反應(yīng)強的患者。多見于結(jié)核性炎癥的早期、病灶惡化獲獎膜結(jié)核。病理表現(xiàn)為充血、水腫、白細胞侵潤。病灶中結(jié)核菌數(shù)量較多

發(fā)生于免疫力較強的患者。病理可見結(jié)核病特有的特征性肉芽腫-結(jié)核結(jié)節(jié)。病灶中結(jié)核菌較少

由于機體的抵抗力低，菌量較多，變態(tài)反應(yīng)強烈，在滲出或增殖為主的病變基礎(chǔ)上，發(fā)生組織凝固性壞死，類脂質(zhì)較多，類似干酪增生為主的病變變質(zhì)為主的病變結(jié)核病分型1原發(fā)型肺結(jié)核（I型）2血型播散型肺結(jié)核（II型）3繼發(fā)性肺結(jié)核（III型）4結(jié)核性胸膜炎（IV型）5其他肺外結(jié)核（V型）臨床表現(xiàn)癥狀

體征

1.全身癥狀：消瘦、盜汗、低熱、乏力2.呼吸系統(tǒng)癥狀：咳嗽、約1/3咯血3結(jié)核變態(tài)反應(yīng)表現(xiàn)因肺結(jié)核好發(fā)于肺上葉尖后段及下葉背段，故鎖骨上下、肩胛間區(qū)叩診音濁實驗室檢查影像檢查病理檢查+臨床診斷治療化學(xué)治療對癥治療手術(shù)治療實驗室各項檢查臨床價值結(jié)核病實驗室檢查細菌學(xué)檢查免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定噬菌體生物擴增法生物化學(xué)檢查最原始最基礎(chǔ)的檢測方法涂片鏡檢涂片染色鏡檢臨床價值

適用于多種標(biāo)本；操作簡便，價格低廉。確診涂陽結(jié)核病及開放性結(jié)核

2份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性；1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+肺部影像學(xué)檢查符合活動性肺結(jié)核表現(xiàn)。肺結(jié)核治療評估的主要依據(jù)之一治愈：涂陽肺結(jié)核患者完成規(guī)定療程，連續(xù)2次涂片結(jié)果陰性，其中1次是治療末的涂片。治療失?。盒峦筷柣颊咧委煹?個月末或療程結(jié)束時，痰涂片檢查陽性，涂陰肺結(jié)核患者治療過程中任何1次痰菌檢查陽性，均為治療失敗。缺點：不能區(qū)別是否為非結(jié)核分枝桿菌不能區(qū)別死活菌。結(jié)核桿菌暴露于異煙肼時，某些條件會失去抗酸性，出現(xiàn)假陰性。檢測靈敏度較低（104-105

個細菌/毫升）。結(jié)核菌培養(yǎng)傳統(tǒng)方法：L-J固體培養(yǎng)基快速培養(yǎng)法:

檢測細菌生長過程中代謝產(chǎn)生的CO2或消耗的O2，顯微鏡直接觀察、變色液體培養(yǎng)基等

BACTEC460系統(tǒng)、BACTECMGIT960系統(tǒng)、Bact/ALERT3D、ESPⅡ等。確診結(jié)核病1份痰標(biāo)本直接涂片抗酸桿菌鏡檢陽性+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)痰涂片陰性，肺部影像學(xué)檢查符合活動性肺結(jié)核影像學(xué)表現(xiàn)+1份痰標(biāo)本結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)陽性結(jié)核菌培養(yǎng)臨床價值用于耐多藥結(jié)核療效判定治愈：（1）患者完成療程，且在療程的后12個月，至少最后5次痰培養(yǎng)（每次間隔至少30天）連續(xù)陰性。（2）如出現(xiàn)1次痰培養(yǎng)陽性，其后痰培養(yǎng)（間隔至少30天）最少連續(xù)3次陰性。失?。褐委煹淖詈?2個月，5次痰培養(yǎng)中有兩次或兩次以上陽性；或者在最后的3次，培養(yǎng)中有任何一次是陽性。敏感性較直接涂片法高，理論上10-100條菌/毫升可檢出陽性；特異性較直接涂片法高，可以從菌落生長速度、色素產(chǎn)生初步判斷非結(jié)核分枝桿菌；分離出具有活力的純培養(yǎng)物，為進一步藥敏試驗提供基礎(chǔ)。分離培養(yǎng)的優(yōu)點需時長，根據(jù)接種量的大小，一般2-8周才能得到肉眼可見菌落。結(jié)果受標(biāo)本保存運送時間、培養(yǎng)基成分和質(zhì)量、前處理方法等影響，操作較直接涂片法復(fù)雜，需經(jīng)嚴(yán)格培訓(xùn)。需培養(yǎng)基凝固滅菌器、離心機、渦旋振蕩器、恒溫培養(yǎng)箱等設(shè)備。成本是直接涂片法的7-8倍。分離培養(yǎng)的缺點

絕對濃度法：我國三十多年來一直沿用的藥敏試驗方法。比例法：WHO耐藥監(jiān)測項目推薦藥敏試驗方法。結(jié)核菌藥敏試驗藥物敏感性測定的重要意義臨床治療的重要參考流行病學(xué)的重要指標(biāo)定義耐藥結(jié)核病MDR-TB

=菌株至少對異煙肼和利福平（最重要的一線抗結(jié)核藥）耐藥XDR-TB=

MDR菌株加上對任意氟喹諾酮類藥物、以及3種注射類二線藥物中（阿米卡星、卡那霉素、卷曲霉素）任意一種耐藥MDRTBXDRTB對任意藥物耐藥的結(jié)核DST是確診耐藥結(jié)核病的唯一標(biāo)準(zhǔn)制定耐藥結(jié)核病治療方案耐藥結(jié)核病的診斷包括結(jié)核分枝桿菌病培養(yǎng)、菌種鑒定以及藥敏試驗（DST）技術(shù)。是制定耐藥結(jié)核病治療方案的重要依據(jù)。耐藥結(jié)核病DST結(jié)果的判讀異煙肼，利福平的藥敏試驗結(jié)果準(zhǔn)確率最高；鏈霉素、乙胺丁醇、吡嗪酰胺的可靠性和重復(fù)性相對較低，綜合用藥史酌情參照；氨基糖苷類、多肽類和氟喹諾酮類藥物可靠性較好；其他二線藥物的DST結(jié)果僅供參考。在得到純細菌的培養(yǎng)物后仍需4周可報告結(jié)果，遠遠滯后于臨床診治的需要；試驗比較繁瑣，結(jié)果受多種因素影響，可重復(fù)性較差；實驗室耐藥與臨床耐藥之間的有一定差距。藥敏試驗方法局限性分枝桿菌菌種鑒定鑒別結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌非結(jié)核分支桿菌傳染性小；耐藥性高。噬菌體生物擴增法檢測結(jié)核噬菌體生物擴增法檢測結(jié)核菌噬菌體生物擴增法檢測結(jié)核菌臨床價值

優(yōu)點：檢測結(jié)果只需48小時，使快速診斷成為可能；安全可靠，傳染性小；檢測活菌，且為半定量試驗，可作為治療效果好壞的判斷指標(biāo)。缺點：操作影響因素多，檢測涂片陽性痰標(biāo)本的敏感性29%~99%，特異性52%~100%。結(jié)果差異很大。有待標(biāo)準(zhǔn)化研究。結(jié)核病實驗室檢查細菌學(xué)檢查免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定噬菌體生物擴增法生物化學(xué)檢查體液免疫學(xué)檢查細胞免疫學(xué)檢查體液免疫學(xué)檢查結(jié)核抗體測定結(jié)核抗原測定循環(huán)免疫復(fù)合物測定

結(jié)核病體液免疫學(xué)診斷具有快速、簡易的優(yōu)勢，但靈敏度、特異度較低，可作為輔助診斷方法。結(jié)核病細胞免疫學(xué)檢查結(jié)核菌素皮膚試驗γ干擾素釋放試驗遲發(fā)型細胞超敏反應(yīng)1）方法：1:2000OT或PPD液0.1毫升(5單位)，左前臂屈側(cè)中部皮內(nèi)注射，48～72h測量皮膚硬結(jié)的直徑。PPD試驗2）判斷標(biāo)準(zhǔn)：陰性≤4mm弱陽性5-9mm陽性10-19mm，強陽性≥20mm或局部出現(xiàn)水泡與壞死3)結(jié)核菌素試驗的意義陰性：無結(jié)核菌感染；不能排除結(jié)核感染。陽性：曾有結(jié)核感染，并不一定現(xiàn)在患病。強陽性：活動性結(jié)核病可能

A、變態(tài)反應(yīng)尚未建立；

B、免疫抑制如應(yīng)用皮質(zhì)激素或營養(yǎng)不良等

PPD所含抗原為致病性分枝桿菌、環(huán)境分枝桿菌及卡介苗菌株所共有，其結(jié)果受到卡介苗接種及其他分枝桿菌感染的影響，特異性較差。當(dāng)出現(xiàn)免疫功能低下時可出現(xiàn)假陰性結(jié)果，敏感性低。免疫力正常的陰性有一定意義。強陽性有一定意義。有結(jié)核變態(tài)反應(yīng)、淋巴結(jié)核強陽性多。

經(jīng)濟、簡便，可以用于流行病學(xué)大規(guī)模的篩查和普查，但存在著明顯的缺陷。PPD試驗臨床價值γ干擾素釋放試驗γ-干擾素釋放試驗進行結(jié)核早期診斷的原理

人體初次感染結(jié)核菌后體內(nèi)會存在致敏的淋巴細胞，當(dāng)人體再次接觸結(jié)核桿菌抗原后，致敏的淋巴細胞就會迅速活化為效應(yīng)性淋巴細胞，并產(chǎn)生高水平的細胞因子，其中最重要的細胞因子為γ-IFN。因此高水平的γ-IFN可以作為診斷結(jié)核感染的一項指標(biāo)。

刺激抗原：ESAT-6蛋白(早期分泌抗原靶6）、CFP-10蛋白（培養(yǎng)濾液蛋白），由結(jié)核分枝桿菌特有的RD1基因編碼，可刺激活化的效應(yīng)T淋巴細胞產(chǎn)生γ干擾素。

RD1基因在BCG以及大部分環(huán)境分枝桿菌中缺失。PPD皮試γ-干擾素釋放試驗估計的敏感性(活動性結(jié)核的患者）75~90%（對免疫抑制患者的敏感性進降低明顯）75~95%（對免疫抑制患者的敏感性降低不明顯）估計的特異性（無結(jié)核病史或暴露史的健康人）70~95%（接種BCG者的特異性進一步降低）90~100%（接種BCG者的特異性不變）與BCG的交叉反應(yīng)存在存在的可能性較小與NTM的交叉反應(yīng)存在存在的可能性較小與M.TB暴露的相關(guān)性存在相關(guān)性較PPD皮試大陽性結(jié)果與隨訪期間罹患結(jié)核的相互關(guān)系中到顯著的正相關(guān)無充足的證據(jù)可重復(fù)性中等，但可變較高，但證據(jù)較少

PPD皮試和γ-干擾素釋放試驗的比較PPD皮試γ-干擾素釋放試驗費用低昂貴副反應(yīng)罕見罕見患者來院次數(shù)兩次一次需要的儀器設(shè)備無需要檢測過程簡單相對復(fù)雜得出結(jié)果時間三天一天受醫(yī)生主觀因素影響影響較大影響較小

γ-干擾素釋放試驗具有和PPD皮試相似的敏感性和顯著增高的特異性；受BCG接種和環(huán)境分枝桿菌感染的影響較?。磺铱芍貜?fù)性相對較好；減少了醫(yī)生主觀因素對檢測結(jié)果的影響;故雖然檢測儀器昂貴，操作相對較為復(fù)雜，但仍可視為進行結(jié)核病早期診斷的較為理想的手段。結(jié)核病實驗室檢查細菌學(xué)檢查免疫學(xué)檢查分子生物學(xué)檢查涂片染色鏡檢分枝桿菌分離培養(yǎng)分支桿菌藥敏試驗分枝桿菌菌種鑒定噬菌體生物擴增法生物化學(xué)檢查體液免疫學(xué)診斷細胞免疫學(xué)診斷DNA測序DNA探針技術(shù)基因芯片技術(shù)DNA指紋圖譜聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）PCR在結(jié)核病診斷中的價值

對臨床標(biāo)本中的結(jié)核分枝桿菌有較高的檢出率；報告時間短；痰涂片陽性，痰PCR多次陰性，提示可能非結(jié)核分枝桿菌；存在假陽性、假陰性問題。石蠟包埋組織PCR敏感性高。其他分子生物學(xué)診斷方法可用于對結(jié)核分枝桿菌的檢測、菌種鑒定、耐藥株檢測；結(jié)果報告快，靈敏度、特異度高；線性探針耐多藥檢測方法（HAIN）適用范圍：1、TB的診斷2、一線抗結(jié)核藥物耐藥診斷3、二線抗結(jié)核藥物耐藥的診斷4、目前，利福平（rpoB基因）、異煙肼（Kat基因、inhA基因）耐藥的診斷所需儀器設(shè)備：生安柜、超聲振蕩儀、PCR擴增儀、可調(diào)溫振蕩儀HAIN和目前常規(guī)藥敏方法比較比較項目HAIN常規(guī)藥敏方法時間1-2天2-3個月生物安全級別要求較低二級