前列腺癌方面免疫組化基礎(chǔ)知識

前列腺癌的免疫組化標記物1整理課件1前列腺特異性抗原前列腺特異性抗原(prostatespecificantigen，PSA)是分子量34000的單鏈糖蛋白，由237個氨基酸構(gòu)成，它是一種絲氨酸蛋白酶，使凝固的精液溶解、液化。它是在1979年作為前列腺腺上皮細胞的標志物被發(fā)現(xiàn)的。血清PSA目前已被廣泛應(yīng)用于前列腺癌的早期篩查。2整理課件PSA在正常前列腺、前列腺增生、前列腺癌、前列腺上皮內(nèi)瘤，均呈陽性表達，定位于上皮細胞的胞質(zhì)中，而在前列腺轉(zhuǎn)移癌那么呈陰性表達，因此PAS陽性提示腫瘤來自前列腺上皮，可用于區(qū)分前列腺癌與前列腺轉(zhuǎn)移癌[5]。PSA在前列腺良、惡性病變中均呈陽性表達，故PSA不能用于鑒別良惡性病變。幾乎所有的前列腺癌〔除了分化最差的癌和少數(shù)激素治療后復(fù)發(fā)的進展期癌以外〕PSA標記都陽性，而高分化前列腺癌的PSA表達強于低分化前列腺癌,說明PSA表達與分化程度有關(guān)。而對于分化很差的癌，即使PSA陰性也不能完全排除前列腺癌，還要結(jié)合其他檢查綜合考慮。偶爾PAS陽性可出現(xiàn)在前列腺以外的組織和腫瘤，但一般為局灶性弱陽性[6]。3整理課件[5]HarveyAM,GriceB,HamiltonC,eta1.Diagnosticutilityofp504s/p63cocktail,prostate-specificantigen,andprostaticacidphosphataseinVerifyingprostaticcarcinomainvolvementinseminalVesicles:astudyof57casesofradicalprostatectomy,specimentsofpathologicstagepT3b[J].ArchPatholLabMed,2021,134(7):983-988.[6]BostwickDG,QianJ,RamnaniDM.Immunohistochemistryoftheprostateandbladder,testisandrenaltumors.In:DabbsDJ,ed.DiagnosticImmunohistochemistry.Philadelphia:ChurchillLivingstone,2002.407-334整理課件CK34βEl21984年，Gown等[7]首先報道了CK34βEl2，它是一種高分子量57000～66000的細胞角蛋白。CK34βEl2標記良性前列腺組織，僅在前列腺基內(nèi)幕胞的細胞膜以及細胞質(zhì)中表達，而不在前列腺分泌上皮細胞表達，故CK34βEl2可作為對前列腺的基內(nèi)幕胞層進行選擇性的標記[8]。由于基內(nèi)幕胞消失是診斷前列腺癌的重要形態(tài)學(xué)依據(jù)，而蘇木素-伊紅染色切片判斷基內(nèi)幕胞是否存在常十分困難，因此用CK34βEl2標記基內(nèi)幕胞就成為前列腺良惡性鑒別診斷的重要手段之一。5整理課件在正常和良性增生以及上皮內(nèi)瘤的前列腺腺體，導(dǎo)管周圍形成連續(xù)或斷續(xù)的CK34βE12分布。而前列腺癌的腺體的基內(nèi)幕胞層完全消失，所以最終表現(xiàn)為CK34βE12不表達。但CK34βE12標記基內(nèi)幕胞可局部陰性，對經(jīng)尿道電切的標本，常因標本經(jīng)人為燒灼而受影響，因此可靠性和穩(wěn)定性欠佳。有20%～30%的前列腺癌導(dǎo)管腺癌和篩狀癌周圍有連續(xù)或間斷的基內(nèi)幕胞，而局部良性前列腺病變,如腺病和不完全性萎縮的腺泡周圍基內(nèi)幕胞可局部甚至完全消失。說明基內(nèi)幕胞消失并非診斷前列腺癌的絕對指標。而免疫組化操作不當，那么有可能出現(xiàn)假陰性結(jié)果而誤診。故免疫組化結(jié)果應(yīng)結(jié)合HE切片中的其他形態(tài)學(xué)特征綜合判斷。6整理課件P631998年，Okada等[9]別離出新基因P63，P63是P53抑癌基因家族的成員，位于人類染色體3q27-29。P63能特異性地標記前列腺基內(nèi)幕胞，呈胞核陽性，棕黃色顆粒狀，故而可以顯示基內(nèi)幕胞的存在，而前列腺的分泌上皮細胞那么呈陰性[10]。絕大多數(shù)的前列腺良性增生及低級別上皮內(nèi)瘤的腺體的周圍呈現(xiàn)連續(xù)性的P63分布；而高級別上皮內(nèi)瘤可見P63不同程度的間斷消失，而前列腺癌中腺體周圍P63為陰性，顯示基內(nèi)幕胞已經(jīng)完全的消失。因此，P63也可用于前列腺癌的鑒別診斷。7整理課件CK34βE12、P63均可用于標記基內(nèi)幕胞，而作為診斷前列腺癌的有力手段。P63與CK34βEl2相比，具有以下優(yōu)點：①局部CK34βE12標記陰性的基內(nèi)幕胞，P63標記可呈陽性；②對有燒灼的經(jīng)尿道電切的前列腺標本，P63標記結(jié)果比較穩(wěn)定。③P63標記基內(nèi)幕胞呈核陽性，結(jié)果容易判斷，背景比較清晰。缺點那么是其陽性表達是間斷的，當可疑腺泡少時，判斷其基內(nèi)幕胞是否消失有時比較困難。在實際應(yīng)用中，兩者具有互補作用。8整理課件基內(nèi)幕胞消失是前列腺癌的重要診斷依據(jù)，但局部的基內(nèi)幕胞缺失卻不能作為診斷前列腺癌的唯一標準。由于前列腺癌可有殘留的基內(nèi)幕胞，而且浸潤性癌在管腔內(nèi)擴散及良性腺體陷入癌組織中[11],因此個別前列腺癌中CK34βEl2與P63亦有陽性表達。少數(shù)前列腺增生病變基內(nèi)幕胞標記亦呈陰性表達，說明少數(shù)前列腺良性腺體基內(nèi)幕胞可以不連續(xù)或不能被證實存在，這也提示基內(nèi)幕胞免疫標志物陰性不能單獨作為確診惡性的指標。9整理課件α-甲基-輔酶A-消旋酶(P504s)2001年Jiang等[12]首次將P504s抗體應(yīng)用于前列腺癌的診斷。P504s即α-甲基-輔酶A-消旋酶((alpha-methylacyl-CoAracemase)，其基因定位于染色體5P13，它所編碼的蛋白由382個氨基酸組成，在支鏈脂肪酸的β-氧化和衍生過程中起作用。P504s在前列腺癌中高表達，而在正常中前列腺組織中那么呈陰性或灶性弱陽性。Jiang等在所檢測的137例前列腺癌中陽性率高達100%，并提出P504s是前列腺癌高度敏感性和特異性的標記物。10整理課件P504s陽性，CK34βEl2和p63陰性，能從正反兩面支持前列腺癌診斷，從而大大提高前列腺癌的診斷正確率[13]。然而，臨床上并非所有的前列腺癌都是P504s陽性，CK34βEl2及p63陰性，也并非所有的前列腺良性病變都是P504s陰性，CK34βEl2及p63完整陽性。楊京哲[14]等人的試驗中，P504s不僅在前列腺癌中有高表達，而且在前列腺上皮內(nèi)瘤中也高表達，這說明P504s不但對前列腺癌敏感，并且對PIN也非常敏感，故用P504s只能區(qū)別前列腺良性增生，而不能把前列腺癌和PIN鑒別開來。11整理課件2004版WHO中，P504s在前列腺癌的陽性率為80%以上，但在某些前列腺癌如泡沫狀腺癌、萎縮性癌、假增生性癌和治療后前列腺癌中陽性率比較低。而且P504s在12%的良性增生，17.5%的前列腺腺病，萎縮型腺體以及90%以上的高級別PIN中呈陽性反響。此外，P504s在前列腺以外的腫瘤如尿路上皮癌、結(jié)腸癌、腎癌以及良性腎源性腺瘤也可陽性。這說明P504s沒有組織特異性，不是前列腺癌的特異性標志物。12整理課件綜上所述，免疫組化在前列腺癌診斷中的應(yīng)用具有重要價值，但決不能完全依靠免疫組化去診斷前列腺癌，單獨的P504s(或基內(nèi)幕胞標志物)陽性或陰性均不能確診前列腺癌。只有將組織病理形態(tài)與免疫組化染色結(jié)果結(jié)合起來，全面分析，綜合判斷，才能有效地防止誤診。13整理課件免疫酶細胞化學(xué)實驗技術(shù)---實用免疫細胞與核酸技術(shù)〔周德山〕免疫酶細胞化學(xué)是免疫細胞化學(xué)〔Immunocytochemistry,ICC〕中最常用的方法之一，它是在抗原抗體特異反響存在的前提條件下，借助于酶細胞化學(xué)的手段，檢測某種物質(zhì)〔抗原/抗體〕在組織細胞內(nèi)存在部位的一門新技術(shù)：即預(yù)先將抗體與酶連結(jié)，再使其與組織內(nèi)特異抗原反響，經(jīng)細胞化學(xué)染色后，于光鏡或電子顯微鏡下觀察分析的形態(tài)學(xué)研究方法。14整理課件為克服熒光抗體法的缺乏、并能在超微結(jié)構(gòu)水平定位抗原物質(zhì)的存在部位，Nakane(1966)等成功地引入了酶代替熒光色素標記抗體，進行組織細胞內(nèi)抗原或半抗原的定位，開辟了酶標抗體技術(shù)免疫酶細胞化學(xué)之路。結(jié)合筆者經(jīng)驗，介紹ICC染色中的主要程序：組織標本的固定、切片、染色原理及步驟、結(jié)果判定及一些進展、特殊應(yīng)用等供讀者參考。15整理課件第一節(jié)固定和切片一、固定假設(shè)想得到理想的ICC染色結(jié)果、正確地判斷抗原物質(zhì)在組織細胞內(nèi)的位置，除需有良好酶和抗體外，保持組織細胞內(nèi)抗原物質(zhì)的不動性〔Immobility〕和免疫活性也是至關(guān)重要的。換言之，如果抗原物質(zhì)在組織細胞間彌散、喪失或失去免疫活性，無論如何努力染色都是徒勞的，所以說固定是ICC染色中非常重要的一環(huán)。ICC與其它組織學(xué)技術(shù)不同，除要求保存良好的結(jié)構(gòu)外，還需保存組織抗原的免疫活性。一般認為，新鮮組織能夠最大限度地保存組織抗原的免疫活性，但結(jié)構(gòu)較差，易出現(xiàn)抗原彌散喪失現(xiàn)象。16整理課件Cumming〔1980〕報告，不固定的組織切片ICC染色時，環(huán)鳥苷酸含量喪失80%以上。固定的目的是使構(gòu)成組織細胞成分的蛋白等物質(zhì)不溶于水和有機溶劑，并迅速使組織細胞中各種酶降解、失活，防止組織自溶和抗原彌散，保持組織細胞的完整性和所要檢測物質(zhì)的抗原性。因此迅速充分固定是ICC染色成功的關(guān)鍵一步。用于ICC的固定劑種類較多，選擇時應(yīng)根據(jù)所要檢測物質(zhì)的抗原性質(zhì)和切片方法以及所用抗體特征等做最正確篩選。制片及固定方法見第一章，下面介紹兩種近年報道的新方法。17整理課件1．AMEX〔AcetoneMethEnzoateXylene〕法是改進的冰凍置換法〔freezesubstitution〕的簡稱，主要用于石蠟包埋標本。Sato(1986)報告，該法具有同新鮮〔未固定〕組織冰凍切片同樣的抗原保持性和石蠟切片的良好組織結(jié)構(gòu)保存。其機制為：組織在丙酮中固定〔脫水〕，組織細胞內(nèi)水份逐漸被丙酮取代，繼之，用苯甲酸酯取代組織內(nèi)丙酮，經(jīng)二甲苯置換后，石蠟包埋。組織在-20℃丙酮內(nèi)過夜亦形成冰晶，所以原方法將組織先置4℃丙酮20～30min，再移入-20℃丙酮過夜。實際上組織在4℃丙酮內(nèi)過夜亦可得到同樣效果。如在該固定液內(nèi)參加少量蛋白酶活性阻斷劑，并采用低溶點石蠟包埋等，可獲得更佳染色結(jié)果。18整理課件微波固定〔Microwavefixation〕為近幾年所注目的問題之一。該方法能保持良好的組織結(jié)構(gòu)和抗原性，適于各種切片的酶組化、ICC以及免疫電鏡等材料固定。其固定機理可能與微波〔頻率1000～3000MHz〕具有被水分吸收的性質(zhì)〔通常所用的微波是頻率2450MHz，波長12cm〕；生物材料含有大量水份，照射后，溫度升高，分子運動加快，促進固定液向組織內(nèi)滲透，加速與組織成分的反響，短時間內(nèi)到達固定的效果等有關(guān)。經(jīng)微波照射固定的組織，需置相同固定液中，繼續(xù)固定2～6h，室溫。19整理課件二、切片光鏡ICC染色，常用的有冰凍切片和石蠟切片兩種，二者各有其優(yōu)缺點，應(yīng)根據(jù)抗原的性質(zhì)、實驗室條件，合理選擇之。對未知抗原顯示時，最好同時應(yīng)用。冰凍切片為ICC研究所首選。20整理課件Shi〔1991〕等報告：微波爐照射的切片，能夠激活局部核內(nèi)抗原活性。其機制不清，可能與高溫、高熱的作用，使核內(nèi)DNA雙鏈解開，DNA、RNA解離，抗原暴露有關(guān)。其步驟為：將切片脫蠟水洗后，置染色瓶中，參加去離子水或緩沖液至瓶頸處，反復(fù)屢次照射，每次1min，照射5～10次，每次照射后，補充瓶中蒸發(fā)掉的液體，照射溫度不超過90～95℃為宜。此處理后，細胞核染色以蘇木精為佳21整理課件第二節(jié)染色方法一、本科標抗體法酶標抗體技術(shù)是通過共價鍵將酶連結(jié)在抗體上，制成酶標抗體，再借酶對底物的特異催化作用，生成有色的不溶性產(chǎn)物或具有一定電子密度的顆粒，于光鏡或電鏡下進行細胞外表及細胞內(nèi)各種抗原成分的定位。22整理課件〔一〕酶的種類及特點從理論上講，用細胞化學(xué)方法能顯示的酶，均可用于標記抗體，進行ICC染色，但實際上在ICC中所能用的酶并不多。現(xiàn)將常用的幾種酶列于表4-1，供選用時參考。23整理課件24整理課件Sternberger(1986)指出，用于標記的酶應(yīng)具備以下幾點①酶催化的底物必須是特異的，且容易被顯示，所形成的產(chǎn)物易于光鏡或電鏡下觀察；②所形成的終產(chǎn)物沉淀必須穩(wěn)定，即終產(chǎn)物不能從酶活性部位向周圍組織彌散，影響組織學(xué)定位；③較易獲得的酶分子，最好有商品出售；④中性pH時，酶應(yīng)穩(wěn)定，酶標記抗體后，保存1～2年活性不應(yīng)改變，且酶的催化活性〔Turnover〕越高越好；⑤酶標過程中，酶與抗體連結(jié)，不能影響二者的活性；⑥被檢測組織中，不應(yīng)存在與標記酶相同的內(nèi)源性酶或類似物質(zhì)。25整理課件〔二〕本科標抗體的制備〔Boosma,DM,1983〕酶標抗體與熒光色素標記抗體不同，它需借助橋-偶聯(lián)劑的作用，將酶連結(jié)在抗體分子上。偶聯(lián)劑是一種雙功能試劑，具備3個根本特征：①偶聯(lián)劑與抗體和酶之間的連結(jié)，必須是不可逆的，即借共價鍵連結(jié)；②偶聯(lián)劑不應(yīng)影響酶和抗體的活性；③不能因偶聯(lián)劑的參加，使酶與組織成分了生非特異結(jié)合?？贵w制作步驟未列出26整理課件〔四〕染色原理及步驟1．根本原理酶標抗體與熒光色素標記抗體的染色相同，亦分直接法和間接法。直接法是將酶直接標記在每一抗體上，間接法是將酶標記在第二抗體上，檢測組織細胞內(nèi)的特定抗原物質(zhì)。間接法所用的第一抗體是對組織細胞內(nèi)某種抗原的特異性抗體〔80%～90%的抗血清系由家兔制得，而絕大數(shù)單克隆抗體系由小鼠制備〕；第二抗體那么為第一抗體〔家兔/小鼠的IgG〕的抗體。所以，只要不同的第一抗體均來自同一種屬，同一標記的第二抗體就能用來顯示其不同特異性抗原的存在，這樣可防止了直接法中標記每一種第一抗體的麻煩，并且提高了方法的敏感度。目前的ICC染色中，以間接法為常用，在此著重介紹間接法的染色程序。27整理課件2．染色程序〔1〕切片準備：見第一章。①石蠟切片經(jīng)二甲苯或Hemo-De脫蠟，下行酒精至水。②固定/無固定新鮮組織冰凍切片，室溫枯燥2h以上?！?〕未固定的新鮮組織切片，丙酮固定20～30min(fretrieval)，簡而言之，即用蛋白酶處理，去除固定劑交聯(lián)造成的空間遮蔽〔室溫〕，風(fēng)干15～30min.;已固定的組織冰凍切片及石蠟切片，根據(jù)需要可進行組織抗原的激活。28整理課件〔3〕用蠟筆沿切片周圍勾劃一道屏障，以防止孵育液流失及孵育過程中切片枯燥，同時也能節(jié)省抗體用量，保持切片與抗體的充分接觸，風(fēng)干。石蠟切片〔滴少量PBS，以防其枯燥〕直接進行步驟〔6〕。〔4〕切片經(jīng)PBS或其它緩沖液漂洗3次，每次2min，溶解除去冰凍切片上的OCT包埋劑。但應(yīng)用ALP標記抗體時，禁用二甲胂酸鈉緩沖液漂洗，因后者可使ALP失活。〔5〕根據(jù)需要，用甲醇+0.3%H2O2處理切片15～30min〔室溫〕，封閉內(nèi)源性過氧化酶的活性。應(yīng)用ALP標記抗體時，此步可省略。29整理課件〔6〕PBS漂洗2min〔共兩次〕，移至0.05%Tween-20/PBS(或0.22～1%TritonX-100)中5min〔室溫〕。Tween-20為一種外表活性劑，除具有清潔作用外，還可增加組織的通透性，有利于組織細胞內(nèi)抗原的顯示。〔7〕4%BlockAce或0.1%～1%BSA濕盒內(nèi)孵育15～25min〔室溫〕，然后；輕輕棄去孵育液〔不沖洗〕；以阻斷組織與抗體的非特異性結(jié)合，降低背景染色。〔8〕根據(jù)需要，可用1/5～1/30正常來活兔/羊血清孵育15～20min〔室溫，以酶標抗體相同種屬正常血清為宜，最好是同一動物免疫前的血清〕。或者省略此步，而在稀釋酶標抗體時，參加1%～2%的同一種屬正常血清。30整理課件9〕輕輕棄去孵育液，滴加含0.2%BSA/0.05NaN3/PBS稀釋的第一抗體〔抗體用量：每張切片一般為50～80μl〕，濕盒內(nèi)孵育1～2h〔20～25℃〕；免疫電鏡用標本，4℃過夜?！?0〕PBS充分沖洗〔3次×2min〕，以去除切片上非特異吸附的抗體。應(yīng)用不同的第一抗體或同時進行對照標本染色時，需分別沖洗，以防相互污染?！?1〕經(jīng)0.05%Tween-20/PBs2min后,滴加含0.2%BSA/1%正常血清/PBS稀釋的HRP酶標記的第二抗體,濕盒內(nèi)孵育45～60min(20～25℃)。31整理課件〔12〕PBS漂洗〔3次×2min〕,此處不需分別漂洗，因所有切片均系同一酶標抗體孵育?！?3〕未固定或固定較弱的冰凍切片，此處可輕微固定。首先將切片從PBS移至TBS中3～5min，去除PBS，以防其中的磷酸與后面使用的固定液中的CaCl2形成磷酸鈣而沉淀后，然后用Baker氏固定液固定5min〔室溫〕此時輕微固定，既不影響抗原抗體結(jié)合，又較有利于保存第一抗體孵育前的組織抗原，尤其適用于單克隆抗體的ICC染色。32整理課件〔14〕呈色：HRP標記抗體的呈色液為0.01%～0.1%H2O20.01%～0.05%DAB0.05～0.1mol/LTris–HCl(pH7.4)。切片經(jīng)PBS或Tris-HCl液漂洗后，置上述呈色液內(nèi)10～15min〔室溫、暗處〕，亦可鏡下控制顯色速度。終產(chǎn)物為棕褐色沉淀。用于電鏡觀察的標本，呈色3～5min即可，防止DAB終產(chǎn)物向周圍擴散，影響超微結(jié)構(gòu)定位。另外，顯色液應(yīng)于用前新鮮配制，防止DAB本身氧化變質(zhì)。新配制的DAB為無色透明液體。假設(shè)DAB液已氧化變?yōu)樽霞t色，應(yīng)換新藥重新配制。〔15〕將切片置流水中〔僅光鏡觀察〕