染色質(zhì)免疫共沉淀課件

染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)染色質(zhì)免疫共沉淀目錄染色質(zhì)免疫共沉淀一、簡(jiǎn)介DNA與蛋白質(zhì)相互作用研究DNaseⅠ足紋法電泳遷移率變動(dòng)分析生物信息學(xué)方法酵母單雜交系統(tǒng)ChIP染色質(zhì)免疫共沉淀一、簡(jiǎn)介ChIP

是目前唯一研究體內(nèi)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的方法。不僅可以檢測(cè)體內(nèi)反式因子與DNA的動(dòng)態(tài)作用，還可以用來(lái)研究組蛋白的各種共價(jià)修飾與基因表達(dá)關(guān)系。染色質(zhì)免疫共沉淀二、原理在活細(xì)胞狀態(tài)下固定蛋白質(zhì)—DNA復(fù)合物，并將其隨機(jī)切斷為一定長(zhǎng)度范圍內(nèi)的染色質(zhì)小片段，然后通過(guò)免疫學(xué)方法沉淀此復(fù)合物，特異性地富集目的蛋白結(jié)合的DNA片段，通過(guò)對(duì)目的片段的純化與檢測(cè)，從而獲得蛋白質(zhì)與DNA相互作用的信息。染色質(zhì)免疫共沉淀三、技術(shù)流程

具體操作流程DNA分析染色質(zhì)免疫共沉淀1、甲醛交聯(lián)細(xì)胞具體步驟10ml1×PBS孵育8min棄上清4-5ml預(yù)冷1×PBS預(yù)冷1×PBS洗滌兩次轉(zhuǎn)移4000rpm離心5min棄上清1ml預(yù)冷1×PBS懸浮新離心管4000rpm離心5min1ml1.25mol/L甘氨酸室溫10-20min染色質(zhì)免疫共沉淀2、染色質(zhì)超聲斷裂1.加SDS裂解溶液重懸浮沉淀，冰上10min.每1min顛倒搖動(dòng)一次離心管。2.把DNA粉碎為長(zhǎng)度200-1000bp，置于冰上。不同樣本都進(jìn)行超聲條件優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。3.14000rpm離心10min（4℃），轉(zhuǎn)移上清于1.5ml離心管。染色質(zhì)免疫共沉淀3.免疫沉淀蛋白和DNA復(fù)合物超聲染色質(zhì)液體2ml超聲稀釋液4℃搖床搖動(dòng)一小時(shí)1000rmp離心2min（4℃）轉(zhuǎn)移上清液至新離心管ChIP稀釋液稀釋10倍加入20μl蛋白A/G瓊脂糖珠1-4μl免疫沉淀抗體取50μl上清液作為對(duì)照？？染色質(zhì)免疫共沉淀4、收獲免疫復(fù)合物（抗體-蛋白質(zhì)-DNA）樣品搖動(dòng)1-2h，4℃40μlProteinA/GAgaroseBeads1×PBS洗3次離心1000rpm,1min.棄上清，用4μl1×PBS懸浮1000rpm,離心5min,4℃a低鹽洗脫溶液1ml洗一次b高鹽洗脫溶液1ml洗一次c氯化鋰洗脫溶液1ml洗一次dTE溶液(pH8.0)1ml洗兩次每次洗時(shí)，在搖床上搖10min,4℃，4000rpm離心5min棄上清染色質(zhì)免疫共沉淀5、洗脫免疫復(fù)合物Beads200μlChIP洗脫溶液洗脫搖床上搖動(dòng)10min12000rpm離心1min取上清Beads取上清200μl,ChIP洗脫溶液(3次)600μl洗脫液染色質(zhì)免疫共沉淀6、去除甲醛交聯(lián)①加5mlNaCl使用NaCl終濃度為0.2mol/l②陰性對(duì)照+350μlChIP洗脫溶液+16μl

5mol/lNaCl。③65℃,過(guò)夜,去交聯(lián)。染色質(zhì)免疫共沉淀7、DNA純化①酚/氯仿抽提實(shí)驗(yàn)樣本(600μl)50μl陰性對(duì)照10μlRNase√√50μl蛋白酶K√√等量酚/氯仿/異戊醇（25:24:1）√√12000rmp離心5min上清液上清液1/10體積3mol/l乙酸鈉√√2倍體積冰凍無(wú)水乙醇√√-80℃冰箱1h.12000rmp離心20min，棄上清加入70%乙醇，懸浮沉淀，12000rpm離心10min，去上清，DNA干燥后，40μlTE溶解②硅膠柱純化染色質(zhì)免疫共沉淀8、染色質(zhì)免疫共沉淀DNA的分析和蛋白質(zhì)在DNA上結(jié)合位點(diǎn)的鑒定(1)如果目的蛋白靶序列已知，或懷疑某一序列是目的蛋白靶序列，則可選用定量或者半定量PCR方法。(2)如果目的蛋白的靶序列未知或者研究目的蛋白基因組分布情況，找出轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，則可采用ChIP克隆測(cè)序，ChIP-chip，和ChIP-seq方法。染色質(zhì)免疫共沉淀四、應(yīng)用組蛋白修飾研究轉(zhuǎn)錄調(diào)控分析藥物開(kāi)發(fā)研究有絲分裂研究DNA損傷與凋亡分析染色質(zhì)免疫共沉淀五、優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn)：充分反映生理?xiàng)l件下DNA與蛋白質(zhì)相互作用的真實(shí)情況，可以找出生理?xiàng)l件下某個(gè)DNA結(jié)合蛋白與DNA序列的結(jié)合位點(diǎn)，從而反映體內(nèi)基因表達(dá)調(diào)控的真實(shí)情況。缺點(diǎn)：需要一個(gè)特異性蛋白質(zhì)抗體，