DB5132T 88-2023牦牛肉PCR-膜芯片技術(shù)檢驗(yàn)方法

ICS07.080A04DB5132四川?。ò尾刈迩甲遄灾沃荩┑胤綐?biāo)準(zhǔn)DB5132/T88—2023牦牛肉PCR—膜芯片技術(shù)檢驗(yàn)方法IdentificationofYakMeatwithPCR-membraneChipTechnology2023-10-26發(fā)布2023-12-25實(shí)施阿壩藏族羌族自治州市場(chǎng)監(jiān)督管理局發(fā)布IDB5132/T88—2023前言 II引言 III 12規(guī)范性引用文件 13術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ) 13.1術(shù)語(yǔ)和定義 1 1 25設(shè)備與材料 26主要試劑 27實(shí)驗(yàn)用水 28檢驗(yàn)步驟 2 2 38.3多重PCR反應(yīng)體系 48.4膜芯片制備 48.5雜交顯色 48.6結(jié)果判讀 59結(jié)果表述 510生物安全及檢測(cè)過(guò)程中防止交叉污染的措施 5參考文獻(xiàn) 7IIDB5132/T88—2023本文件按照GB/T1.1—2020《標(biāo)準(zhǔn)化工作導(dǎo)則第1部分：標(biāo)準(zhǔn)化文件的結(jié)構(gòu)和起草規(guī)則》給出的規(guī)則起草。請(qǐng)注意本文件的某些內(nèi)容可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。本文件由阿壩藏族羌族自治州農(nóng)業(yè)農(nóng)村局提出并歸口。本文件起草單位：四川省龍日種畜場(chǎng)、西南民族大學(xué)、成都產(chǎn)品質(zhì)量檢驗(yàn)研究院有限責(zé)任公司、成都鴻宜瑞信息技術(shù)咨詢有限公司。本文件主要起草人：何明珠、江明鋒、史贇學(xué)、趙睿驍、蒲華榮。IIIDB5132/T88—2023本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)提請(qǐng)注意,聲明符合本文件時(shí)，可能涉及到專利號(hào)為ZL201910400450.2《一種牦牛肉鑒定試劑盒》相關(guān)的專利的使用。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)對(duì)于該專利的真實(shí)性、有效性和范圍無(wú)任何立場(chǎng)。該專利持有人已向本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)承諾。他愿意同任何申請(qǐng)人在合理且無(wú)歧視的條款和條件下，就專利授權(quán)許可進(jìn)行談判。該專利持有人的聲明已在本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)備案。相關(guān)信息可以通過(guò)以下聯(lián)系方式獲得:專利持有人姓名:江明鋒(西南民族大學(xué)),文勇立(西南民族大學(xué)),王譽(yù)(西南民族大學(xué))。請(qǐng)注意：除上述專利外，本文件的某些內(nèi)容仍可能涉及專利。本文件的發(fā)布機(jī)構(gòu)不承擔(dān)識(shí)別專利的責(zé)任。1DB5132/T88—2023牦牛肉PCR-膜芯片技術(shù)檢驗(yàn)方法1范圍本文件規(guī)定了牦牛肉動(dòng)物源性成分的PCR-膜芯片技術(shù)檢測(cè)方法。本文件適用于水牛、黃牛、豬、羊、雞、兔、鴨、狗、牦牛肉及其制品的動(dòng)物源性成分檢測(cè)，檢出2規(guī)范性引用文件下列文件對(duì)于本文件的應(yīng)用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，僅所注日期的版本適用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本文件。GB/T682分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法GB/T27403實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范食品分子生物學(xué)檢測(cè)GB/T34796水溶液中核酸的濃度和純度檢測(cè)3術(shù)語(yǔ)和定義、縮略語(yǔ)3.1術(shù)語(yǔ)和定義下列術(shù)語(yǔ)和定義適用于本文件。3.1.1聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)polymerasechainreaction；PCR在DNA聚合酶催化下，以母鏈DNA為模板，以特定引物為伸起點(diǎn)，通過(guò)變性、退火、延伸等步驟，體外復(fù)制出與母鏈模板DNA互補(bǔ)的子鏈DNA的過(guò)程。3.1.2多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)multiplexPCR在同一PCR反應(yīng)體系中加入兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)。3.1.3膜芯片技術(shù)membraneChipTechnology將預(yù)先制備的DNA探針有序的固定于尼龍膜表面，然后與標(biāo)記的樣品雜交，通過(guò)對(duì)雜交信號(hào)的檢測(cè)分析，得出樣品的遺傳信息（基因序列及表達(dá)的信息）。3.2縮略語(yǔ)2DB5132/T88—2023SSPE：核酸雜交緩沖液4原理針對(duì)牦牛肉及市場(chǎng)常見(jiàn)假冒牦牛肉動(dòng)物源性成分特異基因片段設(shè)計(jì)引物，對(duì)DNA模板進(jìn)行多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物與固定有目標(biāo)基因特異性探針的膜芯片進(jìn)行雜交，經(jīng)化學(xué)顯色后可在雜交點(diǎn)上形成肉眼可見(jiàn)的雜交信號(hào)。5設(shè)備與材料除實(shí)驗(yàn)室滅菌及常規(guī)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下：5.4生物安全柜5.5膜芯片雜交儀（MFS-8)5.6尼龍轉(zhuǎn)印膜（厚度6mm孔徑0.45μm負(fù)電荷）6主要試劑6.1動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒。6.4去活化清洗液（2×SSPE，0.1%SDS）。6.6孵育液（堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素按1∶2000的比例加入孵育液中）。6.9顯色液（BCIP/NBT、5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸和氯化硝基四氮唑蘭）。6.10PCR引物及探針（引物濃度20μmol/L、探針濃度5μmol/L）。7實(shí)驗(yàn)用水實(shí)驗(yàn)用水符合GB/T6682-2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》中一級(jí)水的要求。8檢驗(yàn)步驟3DB5132/T88—20238.1PCR引物及探針引物和探針序列見(jiàn)表1。表1PCR引物信息豬鴨狗兔雞4DB5132/T88—20238.2樣品處理與DNA提取抽取牦牛鮮肉（牦牛肉制品）經(jīng)制備后，使用動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取并純化DNA。8.2.1DNA濃度按GB/T34796《水溶液中核酸的濃度和純度檢測(cè)》規(guī)定的方法進(jìn)行，DNA的濃度≥10%。8.3多重PCR反應(yīng)體系以8.2中提取并純化后的DNA為模板，在20μL體系中加入Mix酶10μL、正向引物（20μ8.4膜芯片制備將尼龍轉(zhuǎn)印膜制備成1.2cm×1.815×SSC浸泡15min，取出放在濾紙上60℃烘干，待尼龍膜降溫至室溫，按順序加入內(nèi)參探針（5μ圖1芯片點(diǎn)樣模式圖8.5雜交顯色2)將PCR變形產(chǎn)物加入膜芯片雜交儀中,并開始雜交程序。3)膜芯片去活化：將制備好的膜芯片放入雜交盒內(nèi)，芯片標(biāo)簽正面朝上，加入1mL去活5DB5132/T88—20237)孵育：吸除雜交清洗液，加入預(yù)熱好的酶孵育液，42℃水平搖床90r/min，震蕩孵育30去離子水37℃洗滌2次，待膜芯片干燥后進(jìn)行結(jié)果判讀。具體流程如表2所示。表2雜交流程表85555555558.6結(jié)果判讀表3膜芯片結(jié)果判定結(jié)果類型內(nèi)參基因靶基因結(jié)果判定1 雜交失敗，重復(fù)試驗(yàn)2-+--PCR擴(kuò)增失敗，重復(fù)試驗(yàn)3++--樣品中不含本標(biāo)準(zhǔn)中9中動(dòng)物源性成分4++-+樣品中含有與陽(yáng)性信號(hào)點(diǎn)對(duì)應(yīng)的動(dòng)物源性成分注：“+”為陽(yáng)性，“-”為陰性。9結(jié)果表述9.1牦牛點(diǎn)顯色，表述為“檢出牦牛成分”；牦牛點(diǎn)未顯色，表述為“未檢出牦牛成分”。9.2牦牛點(diǎn)與其他靶基因點(diǎn)同時(shí)顯色，表述為“檢出牦牛成分，且混有顯色點(diǎn)動(dòng)物源性成分”。6DB5132/T88—202310生物安全及檢測(cè)過(guò)程中防止