生化第11章dna生物合成

DNA的生物合成(復(fù)制)DNABiosynthesis，Replication

第十三章中心法則DNARNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄逆轉(zhuǎn)錄翻譯復(fù)制復(fù)制遺傳信息的流動(dòng)復(fù)制(replication)指遺傳物質(zhì)的傳代，以親代DNA為模板合成兩個(gè)完全相同子代DNA的過程。復(fù)制親代DNA子代DNA復(fù)制的基本規(guī)律——概述BasicRulesofDNAReplication

第一節(jié)半保留復(fù)制(semi-conservativereplication)半不連續(xù)復(fù)制(semi-discontinuousreplication)雙向復(fù)制(bidirectionalreplication)復(fù)制的高保真性(highfidelity)一、半保留復(fù)制（semi-conservativereplication）DNA復(fù)制時(shí)，親代DNA的雙鏈解開成兩條單鏈，各自作為模板(template)按堿基配對規(guī)律，合成與模板互補(bǔ)的新鏈。子代細(xì)胞的DNA雙鏈中，一條單鏈從親代DNA完整地保留下來，另一條單鏈則完全重新合成。兩個(gè)子細(xì)胞的DNA都和親代DNA堿基序列一致。這種復(fù)制方式稱為半保留復(fù)制。概念A(yù)GGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCCCACTGGGGTGACCAGGTACTGTCCATGACTCCATGACAGGTACTGAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACCAGGTACTGCCACTGGTCCATGACGGTGACC+親代DNA復(fù)制叉子代DNA子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式

全保留式半保留式混合式密度梯度實(shí)驗(yàn)

——實(shí)驗(yàn)結(jié)果支持半保留復(fù)制的設(shè)想。含重氮(N15)-DNA的細(xì)菌培養(yǎng)于普通(N14)培養(yǎng)液

第一代繼續(xù)培養(yǎng)于普通培養(yǎng)液

第二代梯度離心結(jié)果按半保留復(fù)制方式，子代DNA與親代DNA的堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺傳信息，體現(xiàn)了遺傳的保守性。半保留復(fù)制的意義遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)，但不是絕對的。DNA聚合酶只能催化在多核苷酸鏈的3

-OH上進(jìn)行聚合反應(yīng)。因此，DNA新鏈的合成只能從5

向3

方向進(jìn)行。二、復(fù)制的半不連續(xù)性（semi-discontinuousreplication）☆DNA合成的方向3

5

3

5

解鏈方向3′5′3′5′前導(dǎo)鏈后隨鏈

順解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制為連續(xù)進(jìn)行，稱為前導(dǎo)鏈。

另一股鏈復(fù)制方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，稱為后隨鏈。

復(fù)制中不連續(xù)片段稱為岡崎片段。

3′☆DNA的半不連續(xù)復(fù)制順著解鏈方向生成的子鏈，復(fù)制是連續(xù)進(jìn)行的，這股鏈稱為前導(dǎo)鏈（領(lǐng)頭鏈，leadingstrand)。另一股鏈因?yàn)閺?fù)制的方向與解鏈方向相反，不能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復(fù)制的鏈稱為后隨鏈（隨從鏈，laggingstrand)。復(fù)制中的不連續(xù)片段稱為岡崎片段(okazakifragment)。

前導(dǎo)鏈連續(xù)復(fù)制而后隨鏈不連續(xù)復(fù)制，就是復(fù)制的半不連續(xù)性。

DNA復(fù)制從固定起始點(diǎn)oriC(originC)開始，向兩個(gè)方向復(fù)制稱為雙向復(fù)制。三、雙向復(fù)制（bidirectionalreplication

）

DNA復(fù)制的酶學(xué)TheEnzymologyofDNAReplication第二節(jié)參與DNA復(fù)制的物質(zhì)模板(template):

解開成單鏈的DNA母鏈引物(primer):

提供3

-OH末端使dNTP可以依次聚合底物(substrate):

dATP,dGTP,dCTP,dTTP聚合酶(polymerase):

依賴DNA的DNA聚合酶，簡寫為DNA-pol其他的酶和蛋白質(zhì)因子：一、解螺旋酶(helicase)

——利用ATP供能，作用于氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈的酶。

大腸桿菌的DnaB蛋白就是一種解螺旋酶，同時(shí)具有ATP酶和解螺旋酶活性。108

局部解鏈后二、DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶

(DNAtopoisomerase)

解鏈過程中正超螺旋的形成目錄拓?fù)洚悩?gòu)酶作用特點(diǎn)既能水解、又能連接磷酸二酯鍵

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ(

TopoⅠ)

拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ(TopoⅡ)分類拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ切斷DNA雙鏈中一股鏈，使DNA解鏈旋轉(zhuǎn)不致打結(jié)；適當(dāng)時(shí)候封閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。反應(yīng)不需ATP。拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅱ切斷DNA分子兩股鏈，斷端通過切口旋轉(zhuǎn)使超螺旋松弛。利用ATP供能，連接斷端，DNA分子進(jìn)入負(fù)超螺旋狀態(tài)。作用機(jī)制

目錄喜樹堿等抗癌藥物抑制TopoⅠ或TopoⅡ活性，干擾細(xì)胞DNA合成，從而抑制腫瘤細(xì)胞增殖?！趶?fù)制中維持模板處于單鏈狀態(tài)并保護(hù)單鏈的完整。

與單鏈DNA的結(jié)合具有協(xié)同效應(yīng)。三、單鏈DNA結(jié)合蛋白(singlestrandedDNAbindingprotein,SSB)四、引物酶

(primase)DNA聚合酶不能從頭催化兩個(gè)游離的dNTP聚合，只能在核苷酸鏈的3

-OH端連接正確配對的脫氧核苷酸。因此復(fù)制需要引物，且為RNA。引物酶是一種依賴DNA的RNA聚合酶，復(fù)制起始時(shí)在模板指導(dǎo)下催化生成RNA引物。不同于轉(zhuǎn)錄過程中的RNA聚合酶，是一種催化反應(yīng)速度較慢且具有差錯(cuò)性的聚合酶。在E.coli中，引物酶是dnaG基因的產(chǎn)物DnaG。五、DNA聚合酶全稱：依賴DNA的DNA聚合酶(DNA-dependentDNApolymerase，DDDP)簡稱：DNA-pol活性：1.5

3

的聚合酶活性及對堿基的選擇性2.核酸外切酶活性5′AGCTTCAGGATA

3′

|||||||||||3′TCGAAGTCCTAGCGAC5′3

5

外切酶活性5

3

外切酶活性?能切除突變的DNA片段。能辨認(rèn)錯(cuò)配的堿基對，并將其水解。

核酸外切酶活性目錄

復(fù)制的高保真性——DNA聚合酶催化DNA高度準(zhǔn)確地進(jìn)行復(fù)制。依賴于3種機(jī)制①嚴(yán)格的堿基配對規(guī)律②DNA聚合酶的堿基選擇功能③DNA聚合酶的堿基校對功能（一）原核生物的DNA聚合酶DNA-polⅠDNA-polⅡDNA-polⅢ功能：切除引物、對復(fù)制和修復(fù)中出現(xiàn)的空隙進(jìn)行填補(bǔ)。DNA-polⅠ（109kD）323個(gè)氨基酸小片段5

核酸外切酶活性大片段/Klenow片段

604個(gè)氨基酸DNA聚合酶活性

5

核酸外切酶活性N端C端木瓜蛋白酶DNA-polⅠKlenow片段是實(shí)驗(yàn)室合成DNA，進(jìn)行分子生物學(xué)研究中常用的工具酶。

DNA-polⅡ

DNA-polII基因發(fā)生突變，細(xì)菌依然能存活。它參與DNA損傷的應(yīng)急狀態(tài)修復(fù)。

功能是原核生物復(fù)制延長中真正起催化作用的酶。

DNA-polⅢ10種近20個(gè)亞基大腸桿菌E.coli中的三種DNA聚合酶分類DNA聚合酶IDNA聚合酶IIDNA聚合酶III分子量(KD)10388791聚合速率(核苷酸/分)1000—600005ˊ→3ˊ聚合酶活性+++3ˊ→5ˊ外切酶活性+++5ˊ→3ˊ外切酶活性+——生物學(xué)功能切除引物延長岡崎片段DNA損傷修復(fù)延長子鏈校讀作用校讀作用DNA損傷修復(fù)（二）真核生物的DNA聚合酶DNA-pol

起始引發(fā)，有引物酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。參與低保真度的復(fù)制。在復(fù)制過程中起校讀、修復(fù)和填補(bǔ)缺口的作用。在線粒體DNA復(fù)制中起催化作用。DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

DNA-pol

真核生物的DNA聚合酶六、DNA連接酶連接DNA鏈3

-OH末端和相鄰DNA鏈5

-P末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。DNA連接酶(DNAligase)作用方式3’HO5’3’3’5’DNA連接酶ATPADP5’3’5’POO-O-OPOO-O-ODNA連接酶連接堿基互補(bǔ)基礎(chǔ)上的單鏈缺口，在DNA修復(fù)、重組及剪接中起縫合缺口作用。不能連接單獨(dú)存在的DNA單鏈和RNA單鏈。是基因工程的重要工具酶之一。功能DNA復(fù)制過程TheProcessofDNAReplication第三節(jié)A.環(huán)狀雙鏈DNA及復(fù)制起始點(diǎn)B.復(fù)制中的兩個(gè)復(fù)制叉C.復(fù)制接近終止點(diǎn)(termination,ter)oriterABC一、原核生物的DNA生物合成

（一）復(fù)制的起始需要解決兩個(gè)問題：從復(fù)制起始點(diǎn)開始，將雙鏈DNA解開成單鏈，提供模板。2.合成引物，提供3-OH末端。DNA復(fù)制過程是一個(gè)連續(xù)的過程，可分為起始、延長和終止三個(gè)階段E.coli復(fù)制起始點(diǎn)oriCGATTNTTTATTT···GATCTNTTNTATT···GATCTCTTATTAG···

1

13

17293244

···TGTGGATTA-‖-ACACATATT-‖-TTTGGATAA-‖-ACACCTATT5866166174201209237245

串聯(lián)重復(fù)序列

反向重復(fù)序列5

3

5

3

1.復(fù)制起始點(diǎn)的辨認(rèn)結(jié)合DnaADnaB、DnaCDNA拓?fù)洚悩?gòu)酶SSB3

5

3

5

2.引發(fā)體和引物含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和DNA復(fù)制起始區(qū)域的復(fù)合結(jié)構(gòu)稱為引發(fā)體。

引物酶3

5

3

5

引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。

引物3'HO5'引物酶（二）復(fù)制的延長復(fù)制的延長指在DNA-pol催化下，dNTP以dNMP的方式逐個(gè)加入引物或延長中的子鏈上，其化學(xué)本質(zhì)是磷酸二酯鍵的不斷生成。

(dNMP)n+dNTP→(dNMP)n+1+PPi

5'

3'5'dATPdGTPdTTPdCTPdTTPdGTPdATPdCTPOH3'3'DNA-pol1.領(lǐng)頭鏈的延長領(lǐng)頭鏈沿著5’→3’方向可以連續(xù)的延長。2.隨從鏈的延長隨從鏈沿著5

→3

方向不可以連續(xù)的延長。復(fù)制簡圖1.原核生物DNA是環(huán)狀的，雙向復(fù)制的復(fù)制片段在復(fù)制的終止點(diǎn)(ter)處匯合。oriter

E.coli8232oriterSV40500（三）復(fù)制的終止5

5

5

DNA-polⅠOHP5

DNA-polⅠdNTP5

5

P5

5

DNA連接酶（NAD+）2.隨從鏈上不連續(xù)性片段的連接二、真核生物的DNA生物合成

☆真核生物DNA復(fù)制在細(xì)胞周期的S期進(jìn)行?！詈斜姸嗟膹?fù)制起始點(diǎn)，具有多點(diǎn)雙向復(fù)制的特點(diǎn)?！钜部煞譃槠鹗?、延長和終止三個(gè)階段，每個(gè)階段的基本過程與原核生物DNA復(fù)制相似，但存在不少差異?！钤鲋臣?xì)胞核抗原(proliferationcellnuclearantigen,PCNA)在復(fù)制起始和延長中起關(guān)鍵作用。哺乳動(dòng)物的細(xì)胞周期DNA合成期G1G2SM?真核生物每條染色體有多個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)，是多復(fù)制子復(fù)制。復(fù)制有時(shí)序性，即復(fù)制子以分組方式激活而不是同步起動(dòng)。?每個(gè)復(fù)制起始點(diǎn)到兩邊的復(fù)制終點(diǎn)之間的DNA片段，稱為一個(gè)復(fù)制子（replicon）或復(fù)制單位（replicationunit）。?復(fù)制的起始需要DNA-polα（引物酶活性）和polδ（解螺旋酶活性）參與。還需拓?fù)涿负蛷?fù)制因子(replicationfactor,RF)。（一）復(fù)制的起始5’3’oriorioriori5’3’5’5’3’3’5’5’3’復(fù)制子3’3

5

5

3

領(lǐng)頭鏈3

5

3

5

親代DNA隨從鏈引物核小體（二）復(fù)制的延長

真核生物的DNA聚合酶δ（取決于增殖細(xì)胞核抗原）催化子鏈的延長，并有校正功能。引物和岡崎片段(約200bp)都比較短。

1.染色體DNA呈線狀，復(fù)制在末端停止。2.復(fù)制中岡崎片段的連接，復(fù)制子之間的連接。3.染色體兩端DNA子鏈上合成的RNA引物，去除后留下空隙。（三）復(fù)制的終止5

3

3

55

3

3

5+5

3

3

3

3

5

5

真核DNA復(fù)制后，兩個(gè)5

末端的引物被切除，缺口無法填補(bǔ)，DNA將面臨多次復(fù)制而逐漸縮短的問題？

端粒指真核生物染色體線性DNA分子末端的結(jié)構(gòu)。TTTTGGGGTTTTGGGG…（四）端粒（telomere）與端粒酶（telomerase）2.結(jié)構(gòu)特點(diǎn)

由末端單鏈DNA序列和蛋白質(zhì)構(gòu)成末端序列是富含TG短序列的多次重復(fù)3.功能維持染色體的穩(wěn)定性。維持DNA復(fù)制的完整性。4.端粒酶（telomerase)◆端粒酶RNA（humantelomeraseRNA,hTR）◆端粒酶協(xié)同蛋白(humantelomeraseassociatedprotein1,hTP1)◆端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(humantelomerasereversetranscriptase,hTRT)

組成端粒酶的催化延長作用爬行模型目錄DNA聚合酶復(fù)制子鏈進(jìn)一步加工目錄表10-9真核生物與原核生物DNA復(fù)制的比較真核生物原核生物復(fù)制起始點(diǎn)多少復(fù)制起始點(diǎn)序列特征富含AT序列3組串聯(lián)重復(fù)序列與2對反向重復(fù)序列引物酶活性DNA聚合酶αDnaG解鏈酶活性DNA-polδDnaB引物長度短長岡崎片斷長度短長延長岡崎片斷填補(bǔ)空隙DNA-polεDNA聚合酶I主要復(fù)制酶DNA-polδDNA-polⅢ復(fù)制速度慢快DNA損傷修復(fù)DNA-polβDNA聚合酶IDNA損傷(突變)的修復(fù)DNADamage(Mutation)andRepair第四節(jié)基因組DNA的分子結(jié)構(gòu)或其序列的改變稱為基因突變（genemutation），又稱為DNA損傷（DNAdamage）。DNA損傷◆突變是進(jìn)化、分化的分子基礎(chǔ)◆突變導(dǎo)致基因型改變◆突變導(dǎo)致死亡◆突變是某些疾病的發(fā)病基礎(chǔ)意義一、基因突變的誘發(fā)因素及其作用1.物理因素

紫外線(ultraviolet,UV)、各種輻射

UV2.化學(xué)因素目錄3.生物因素黃曲霉素、抗生素等二、基因突變的類型

堿基替換(basesubstitution)

缺失(deletion)

插入(insertion)

重排(rearrangement)

動(dòng)態(tài)突變（三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展突變，

trinucleotiderepeatexpansion）

框移（移碼）突變(frameshiftutatiom)

DNA分子中一個(gè)或多個(gè)堿基對被其他堿基對所替換，單一堿基對的替換稱點(diǎn)突變(pointmutation)。發(fā)生在同類堿基之間，即嘌呤代替另一嘌呤，或嘧啶代替另一嘧啶。1.轉(zhuǎn)換發(fā)生在異類堿基之間，即嘌呤變嘧啶或嘧啶變嘌呤。2.顛換（一）堿基替換堿基替換發(fā)生在基因編碼序列的遺傳結(jié)果：①同義突變②錯(cuò)義突變③無義突變④通讀突變鐮形紅細(xì)胞貧血病人Hb(HbS)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

thr

·

pro·

val

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CACGTG基因正常成人Hb(HbA)β亞基N-val

·

his

·

leu

·

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·

pro·

glu

·

glu

·

·

·

·

·

·

C肽鏈CTCGAG基因（二）缺失、插入和框移（移碼）突變?nèi)笔В阂粋€(gè)堿基或一段核苷酸鏈從DNA大分子上消失。插入：原來沒有的一個(gè)堿基或一段核苷酸鏈插入到DNA大分子中間?？蛞疲ㄒ拼a）突變是指三聯(lián)體密碼的閱讀方式改變，造成蛋白質(zhì)氨基酸排列順序發(fā)生改變。

缺失或插入都可導(dǎo)致框移（移碼）突變

。谷酪蛋絲5’……GCA

GUA

CAU

GUC……丙纈組纈正常5’……GAG

UAC

AUG

UC……缺失C缺失引起框移突變（三）重排DNA分子內(nèi)較大片段的交換，稱為重組或重排，包括倒位、易位和融合。由基因重排引起的兩種地中海貧血基因型目錄（四）動(dòng)態(tài)突變動(dòng)態(tài)突變又稱三核苷酸重復(fù)擴(kuò)展突變。人類基因組存在的短串聯(lián)重復(fù)序列，可隨生物世代的傳遞而出現(xiàn)拷貝數(shù)不斷增加，進(jìn)而導(dǎo)致某些遺傳病的發(fā)生。如Huntington舞蹈病的發(fā)生。三、基因突變的后果生物進(jìn)化的分子基礎(chǔ)僅改變基因型，不改變表現(xiàn)型產(chǎn)生蛋白質(zhì)分子的多態(tài)性發(fā)生遺傳和相關(guān)性疾病致死性突變四、DNA損傷的修復(fù)（DNArepairing）概念

在多種酶的作用下，生物細(xì)胞對已發(fā)生分子改變的DNA進(jìn)行恢復(fù)天然結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象和過程。

直接修復(fù)(裂口修復(fù)、光修復(fù)、烷基轉(zhuǎn)移)

切除