第四章-核酸化學(xué)

第四章

核酸化學(xué)12/14/2023112/14/20232核酸的研究歷史1868－69，F(xiàn).Miescher從膿細(xì)胞核中提出含磷量高的核素（nuclein）。1889年，稱為核酸（nucleicacid），意指含于細(xì)胞核內(nèi)的酸性物質(zhì)。核酸中的嘌呤和嘧啶主要由Kossel等人所鑒定。1910，Kossel

因核酸化學(xué)研究中的成就而獲諾貝爾化學(xué)獎。1928年，F(xiàn)redGriffith發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌的轉(zhuǎn)化現(xiàn)象（transformation）。12/14/20233核酸的研究歷史1944年，OswaldAvery提出“遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)是DNA”。1952年，AlfredHershey和MarthaChase雙標(biāo)記實驗更進一步證實了核酸在遺傳中的作用。1953年，Watson和Crick建立了DNA結(jié)構(gòu)的雙螺旋模型，說明了基因的結(jié)構(gòu)、信息和功能三者間的關(guān)系，推動了分子生物學(xué)的迅猛發(fā)展。12/14/20234MauriceHughFrederickWilkinsJamesDeweyWatsonFrancisHarryComptonCrick"fortheirdiscoveriesconcerningthemolecularstructureofnucleicacidsanditssignificanceforinformationtransferinlivingmaterial"TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine196212/14/20235TheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1965"fortheirdiscoveriesconcerninggeneticcontrolofenzymeandvirussynthesis"1910-19761902-19941920-InstitutPasteur

Paris,FranceInstitutPasteur

Paris,FranceInstitutPasteur

Paris,FranceFranceFranceFranceJacquesMonodAndreMichellwoff

FrancoisJacob12/14/202361927-1922-1922-1993NationalInstitutesofHealth

Bethesda,MD,USAUniversityofWisconsin

Madison,WI,USACornellUniversity

Ithaca,NY,USAUSAUSAUSAMarshallW.NirenbergHar

GobindKhoranaRobertW.HolleyTheNobelPrizeinPhysiologyorMedicine1968"fortheirinterpretationofthegeneticcodeanditsfunctioninproteinsynthesis"12/14/2023770年代建立DNA重組技術(shù)，改變了分子生物學(xué)的面貌，并導(dǎo)致生物技術(shù)的興起。12/14/2023812/14/2023990年代以后，實施人類基因組計劃（HGP）,開辟了生命科學(xué)新紀(jì)元。生命科學(xué)進入后基因組時代。12/14/202310功能基因組學(xué)（functionalgenomics）：研究基因組中各基因的功能，包括基因的表達及其調(diào)控模式的學(xué)科。mRNA減法雜交（subtractivehybridization）基因表達的系統(tǒng)分析（serialanalysisofgeneexpression，SAGE）cDNA微陣列（cDNA

microarray）DNA芯片（DNAchip）序列標(biāo)志片段顯示（sequencetaggedfragmentsdisplay）

12/14/20231112/14/202312蛋白質(zhì)組學(xué)（proteomics）：闡明生物體各種生物基因組在細(xì)胞中表達的全部蛋白質(zhì)的表達模式及功能模式的學(xué)科。包括鑒定蛋白質(zhì)的表達、存在方式(修飾形式)、結(jié)構(gòu)、功能和相互作用等。等電聚焦（isoelectricfocusing，IEF）雙向凝膠電泳（two-dimensionalgelelectrophoresis，2-DE）質(zhì)譜（massspectrum，MS）12/14/202313核酸，以核苷酸為基本單位，是一類重要的生物大分子，擔(dān)負(fù)著生命信息的儲存與傳遞。核酸是現(xiàn)代生物化學(xué)、分子生物學(xué)的重要研究領(lǐng)域，是基因工程操作的核心分子。核酸概述12/14/202314

98％核中（染色體中）真核線粒體（mtDNA）

核外葉綠體（ctDNA）DNA擬核原核核外：質(zhì)粒（plasmid）

病毒：DNA病毒二、核酸的種類和分布

核酸分為兩大類：脫氧核糖核酸deoxyribose

nucleicacid（DNA）核糖核酸ribosenucleicacid（RNA）12/14/202315動物細(xì)胞內(nèi)主要RNA的種類及功能12/14/202316RNA組學(xué)研究細(xì)胞中非信使小RNAs（snmRNAs）的種類、結(jié)構(gòu)和功能。同一生物體內(nèi)不同種類的細(xì)胞、同一細(xì)胞在不同時間、不同狀態(tài)下小RNAs的表達具有時間和空間特異性。

RNA組學(xué)：12/14/202317三、核酸的生物功能（一）DNA是主要的遺傳物質(zhì)1944，O.Avery肺炎雙球菌轉(zhuǎn)化實驗1952，A.DHershey和M.Chase噬菌體感染實驗12/14/202318O.T.Avery

的細(xì)菌轉(zhuǎn)化實驗12/14/20231912/14/20232012/14/20232112/14/20232212/14/20232312/14/20232412/14/202325（二）

RNA的生物學(xué)功能12/14/20232612/14/202327本章主要內(nèi)容第一節(jié)核酸的組成成分第二節(jié)核酸的結(jié)構(gòu)（RNA、DNA的結(jié)構(gòu)）第三節(jié)核酸的性質(zhì)第四節(jié)核酸的研究方法（分離純化、分析測定）12/14/202328

本章教學(xué)目的要求：教學(xué)要求：理解核酸的化學(xué)組成及其分布；區(qū)別DNA的各級結(jié)構(gòu)及其與RNA的分子結(jié)構(gòu)的差別；掌握核酸的種類與性質(zhì)。重點：掌握核酸的水解產(chǎn)物、構(gòu)成及其命名。

DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)的組成及特點。

RNA三葉草二級結(jié)構(gòu)模型特點，核酸的的變性及影響Tm的因素。

12/14/202329第一節(jié)核酸的組成成分核酸核苷酸核苷磷酸堿基戊糖元素組成：CHONP

核酸完全水解產(chǎn)生嘌呤和嘧啶等堿性物質(zhì)、戊糖（核糖或脫氧核糖）和磷酸的混合物。核酸部分水解則產(chǎn)生核苷和核苷酸。每個核苷分子含一分子堿基和一分子戊糖，一分子核苷酸部分水解后除產(chǎn)生核苷外，還有一分子磷酸。核酸的各種水解產(chǎn)物可用層析或電泳等方法分離鑒定。12/14/202330組成核酸的戊糖有兩種。DNA所含的糖為β-D-2-脫氧核糖；RNA所含的糖則為β-D-核糖。一、戊糖RiboseDeoxyribose12/14/202331

嘌呤

嘧啶二、堿基核酸中含氮的堿性雜環(huán)化合物。12/14/202332（1）嘌呤堿（Adenine）（Guanine）12/14/202333（2）嘧啶堿(uracil)(cytosine)(thymine)12/14/202334嘌呤嘧啶堿基腺嘌呤（Ade）鳥嘌呤（Gua）胞嘧啶（Cyt）胸腺嘧啶（Thy）尿嘧啶（Ura）DNA、RNA均有DNA有RNA有每種核酸都含有四種堿基。12/14/202335N-糖苷鍵NN三、核苷（nucleoside）12/14/202336核苷戊糖+堿基

糖與堿基之間的N-C鍵，稱為N-糖苷鍵糖C1’與嘧啶N1，糖C1’與嘌呤N9堿基與糖環(huán)平面垂直。1’2’3’4’5’(OH)1’2’3’4’5’(OH)12/14/202337

AGCU

dA

dG

dC

dT12/14/202338四、核苷酸（nucleotide）12/14/202339核苷酸:核苷的磷酸酯

核苷酸=核苷+磷酸=戊糖+堿基+磷酸

是核酸的基本結(jié)構(gòu)單位。12/14/2023402’，3’，5’一核糖核苷酸(2′-AMP)(3′-AMP)(5′-AMP)12/14/2023413’，5’—脫氧核糖核苷酸Deoxyadenosine3’-monphosphate

(3’-dAMP)Deoxyadenosine5’-monphosphate

(5’-dAMP)脫氧（核糖）核苷酸（deoxyribonucleotide）12/14/202342PPPPPPPP常見（脫氧）核苷酸的結(jié)構(gòu)和命名鳥嘌呤核苷酸（GMP）尿嘧啶核苷酸（UMP）胞嘧啶核苷酸（CMP）腺嘌呤核苷酸（AMP）脫氧腺嘌呤核苷酸（dAMP）脫氧鳥嘌呤核苷酸（dGMP）脫氧胞嘧啶核苷酸（dCMP）脫氧胸腺嘧啶核苷酸（dTMP）12/14/202343核苷酸衍生物繼續(xù)磷酸化AMPADPATP12/14/202344ATP的重要生理功能：①參與能量代謝。②各種三磷酸核苷酸參與DNA、RAN的生物合成（作原料）；③參與其它合成。如UTP參加糖轉(zhuǎn)化、合成，CTP參與嘌呤、蛋白質(zhì)的合成；④作輔酶的結(jié)構(gòu)成分。如NAD＋、FAD、NADP＋。12/14/202345NMP，NDP，NTP12/14/202346

cAMP

cGMPcAMP：3’,5’-環(huán)腺嘌呤核苷一磷酸cGMP：3’,5’-環(huán)鳥嘌呤核苷一磷酸12/14/202347其他核苷酸主要起調(diào)節(jié)作用，如：

ppGpp：鳥苷—5′—二磷酸—3′—二磷酸

pppGpp：鳥苷—5′—三磷酸—3′—二磷酸12/14/202348（1）核苷的堿基上的H被其它基團取代甲基m

乙?；鵤c

氨基n甲硫基ms

羥基o或h

硫基s

異戊烯基i

羧基c

五、修飾成分12/14/202349例：12/14/202350N5-甲基胞嘧啶核苷m5CN6-甲基腺嘌呤核苷m6A12/14/202351（2）核苷的糖分子中—OH基的H被其它基團取代在其核苷單字代號的右邊加上代表取代基的小寫字母代號。如：Am表示腺苷的第2位上OH基的H被甲基所取代。12/14/202352假尿嘧啶核苷，pseudouridine，ψ（3）堿基與戊糖的連接方式不同U12/14/20235312/14/202354第二節(jié)RNA的結(jié)構(gòu)12/14/202355一、核酸的一級結(jié)構(gòu)

核苷酸殘基沿核酸主鏈排列的順序。

核苷酸相當(dāng)于氨基酸、單糖的角色。12/14/202356脫H2O脂鍵相連3`，5`-磷酸二酯鍵首尾3`5`12/14/202357核酸一級結(jié)構(gòu)特點核苷酸之間連接方式：3`，5`-磷酸二酯鍵；主鏈骨架：戊糖和磷酸；兩個末端：5′-磷酸端（常用5’-P表示）；3′-羥基端（常用3’-OH表示）主鏈走向:核苷酸主鏈具有方向性，走向為5’→3’，一級結(jié)構(gòu)的書寫和閱讀方向也是5’→3’

。12/14/202358核酸一級結(jié)構(gòu)的表示方式DNARNA5′PdAPdCPdGPdTOH3′5′PAPCPGPUOH′

或5′ACGTGCGT3′5′ACGUAUGU3′ACGTGCGTACGUAUGUT5’3’OHU5’3’OHOHOHOHOH線條式縮寫字母式縮寫12/14/202359核酸的化學(xué)組成腺嘌呤、脫氧腺嘌呤核苷、腺嘌呤核苷酸、腺嘌呤二核苷酸、腺嘌呤三核苷酸；修飾成分12/14/202360核酸一級結(jié)構(gòu)特點12/14/202361二、各種RNA一級結(jié)構(gòu)的特點主要功能是參與蛋白質(zhì)的生物合成。1.核糖體RNA（ribosomalRNA，rRNA

）含量最豐富，占總RNA的80%左右rRNA與蛋白質(zhì)形成核糖體，一起構(gòu)成了蛋白質(zhì)合成的場所。12/14/20236212/14/202363大腸桿菌核糖體（70S）原核生物30S亞基50S亞基16SRNA（1542）21種蛋白質(zhì)23SRNA（2940）5SRNA（120）34種蛋白質(zhì)高等動物核糖體（80S）40S亞基60S亞基18SRNA（1874）33種蛋白質(zhì)28SRNA（4718）5.8SRNA（160）49種蛋白質(zhì)12/14/2023642.轉(zhuǎn)移RNA（transferRNA，tRNA）占總RNA的15%在蛋白質(zhì)的生物合成中，起攜帶氨基酸的作用。5’-末端總是磷酸化，常為pG。3’-末端最后三個核苷酸順序相同，總是CCAOH。存在較多的甲基化堿基。12/14/2023653.信使RNA（messengerRNA，mRNA）占總RNA的5%，相對分子質(zhì)量較大，代謝活躍在蛋白質(zhì)生物合成中起著模板的作用。真核細(xì)胞mRNA5′末端帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppXPY，識別翻譯起始3′末端有多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)(polyA)，維持mRNA的穩(wěn)定性AAAA……Anm7GpppAUGGUGUAA………………5′3′5′帽子結(jié)構(gòu)密碼子3′多聚A尾

5′非編碼區(qū)編碼區(qū)3′非編碼區(qū)12/14/20236612/14/202367核酸的一級結(jié)構(gòu)序列測定英國Sanger1955確定牛胰島素結(jié)構(gòu)，1958獲諾貝爾化學(xué)獎1975設(shè)計出DNA測序法，1980獲諾貝爾化學(xué)獎12/14/20236812/14/202369末端終止法——Sanger2’，3’雙脫氧核苷三磷酸（ddNTP）是DNA合成鏈延伸的抑制劑。12/14/20237012/14/202371DNA序列分析儀：四色熒光基團標(biāo)記的dNTP12/14/202372三、RNA的高級結(jié)構(gòu)堿基按一定規(guī)律形成堿基對（basepair,bp）RNA鏈由于自身回折的結(jié)果可以形成“發(fā)卡”（hairpin）結(jié)構(gòu)“發(fā)卡”結(jié)構(gòu)可進而形成螺旋結(jié)構(gòu)不能形成堿基配對的形成“突環(huán)”（loop）12/14/202373tRNA的二級結(jié)構(gòu)★★酵母丙氨酸t(yī)RNA（tRNAAla）分子中含有較多的修飾成分（10-20%）3’-末端都具有－CCA－OH的結(jié)構(gòu)5’-末端磷酸化，常為G（pC）“三葉草”四臂四環(huán)P12/14/202374①氨基酸臂：由7對bp組成，富含G，末端為CCA，接受活化AA②二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)）：由8－12個核苷酸組成③反密碼環(huán)：識別密碼子④額外環(huán)：大小是tRNA分類的重要指標(biāo)⑤假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核苷環(huán)（TΨC環(huán)）12/14/202375tRNAAla三級結(jié)構(gòu)特點像一個倒“L”形兩個螺旋區(qū)：氨基酸臂和TΨC臂形成；D臂和反密碼子臂形成。倒“L”的拐角：TΨC環(huán)和D環(huán)倒“L”形的一端是3’-CCA-OH；另一端是反密碼子環(huán)。12/14/202376基因與基因組基因（gene）：一段有功能的DNA片段，生物細(xì)胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。

蛋白質(zhì)（mRNA蛋白質(zhì)）產(chǎn)物tRNA

RNA

rRNA

調(diào)節(jié)功能：調(diào)節(jié)基因無產(chǎn)物

作用未知結(jié)構(gòu)基因第三節(jié)DNA的結(jié)構(gòu)12/14/202377基因組（genome）：某生物體（完整單倍體）所含全部遺傳物質(zhì)的總和。包括：核基因組（擬核/核DNA）及核外（質(zhì)粒/質(zhì)體DNA）

bp（堿基對）103104105106107108109101010111012人兩棲類魚類藻類酵母細(xì)菌E.Coli病毒質(zhì)粒各種細(xì)胞、病毒和細(xì)菌質(zhì)粒中基因組的大小12/14/202378原核生物基因組特點

重復(fù)序列少，多位編碼區(qū)多為操縱子形式組織有重疊基因存在真核生物基因組特點以染色體存在重復(fù)序列多12/14/202379一、DNA的二級結(jié)構(gòu)（重點）

DNA的二級結(jié)構(gòu)指DNA的雙螺旋結(jié)構(gòu)12/14/20238012/14/202381（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景堿基組成分析Chargaff

規(guī)則：[A]=

[T][G]=

[C]A+C=G+TA+G=C+T堿基的理化數(shù)據(jù)分析A-T、G-C以氫鍵配對互補配對原則的重要性

DNA纖維的X-線衍射圖譜分析12/14/20238212/14/202383（二）DNA雙螺旋模型要點1、主鏈：兩條右手螺旋的多核苷酸鏈反向平行，圍繞同一中心軸纏繞。磷酸和核糖在外側(cè)，堿基位于雙螺旋的內(nèi)側(cè)，堿基平面互相平行并且與縱軸垂直。兩條鏈的磷酸二酯鍵的方向相反，習(xí)慣上把3’→5’向定為正向；2、堿基：堿基互補配對，A、T形成兩個氫鍵；G、C形成三個氫鍵。2.0nm大溝12/14/2023842.0nm小溝大溝3、螺旋參數(shù)雙螺旋的直徑為2nm，螺距3.4nm，每圈螺旋含10個核苷酸殘基。相鄰堿基的距離為0.34nm，相鄰堿基的夾角36°。4、螺旋表面表面有大溝和小溝。12/14/202385（三）穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的作用力①堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。②堿基堆積作用在維系DNA二級結(jié)構(gòu)上更重要（主要因素）③離子鍵：磷酸基上的負(fù)電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成。12/14/202386（四）DNA雙螺旋的多樣性類型旋轉(zhuǎn)方向螺旋直徑（nm）螺距（nm）每轉(zhuǎn)堿基對數(shù)目堿基對間垂直距離（nm）堿基對與水平面傾角A－DNAB－DNAZ－DNA右右左2.02.31.82.83.44.51110120.2550.340.2720o0o7o12/14/202387（五）生物學(xué)意義第一次描述了DNA分子的結(jié)構(gòu)，提出了遺傳信息的儲存方式以及DNA的復(fù)制機理，對DNA復(fù)制、基因遺傳、RNA翻譯、基因表達、調(diào)控等方面的研究都奠定了基礎(chǔ)，揭開了分子生物學(xué)研究的序幕，為分子遺傳學(xué)的研究奠定了基礎(chǔ)。12/14/202388二、DNA的三級結(jié)構(gòu)DNA雙螺旋的進一步扭曲構(gòu)成三級結(jié)構(gòu)超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的一種常見形式即DNA雙螺旋的螺旋正超螺旋和負(fù)超螺旋螺旋超螺旋12/14/20238912/14/20239012/14/202391核小體組蛋白八聚體連接DNAH1組蛋白真核細(xì)胞染色質(zhì)的組裝12/14/202392真核生物染色體DNA組裝不同層次的結(jié)構(gòu)

DNA（2nm）核小體鏈（11nm，每個核小體200bp）纖絲（30nm，每圈6個核小體）突環(huán)（150nm，每個突環(huán)大約75000bp）玫瑰花結(jié)（300nm，6個突環(huán)）螺旋圈（700nm，每圈30個玫瑰花）染色體（1400nm）12/14/202393如果人體有1014個細(xì)胞，每個體細(xì)胞的DNA含量為6.4×109個堿基對。試計算人體DNA的總長度是多少？是太陽-地球之間距離（2.2×109

公里）的多少倍？每個體細(xì)胞的DNA的總長度為：6.4×109×0.34nm=2.176×109nm=2.176m。人體內(nèi)所有體細(xì)胞的DNA的總長度為：2.176m×1014=2.176×1011km這個長度與太陽-地球之間距離（2.2×109公里）相比為：2.176×1011/2.2×109=99倍。12/14/202394第四節(jié)核酸及核苷酸的性質(zhì)一、溶解性二、核酸及其組分的兩性性質(zhì)三、紫外吸收★★四、核酸的變性與復(fù)性★★12/14/202395一、溶解性RNA、核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶堿呈白色結(jié)晶或粉末DNA：疏松的石棉纖維狀固體兩性解離/一般呈酸性（在中性溶液中帶負(fù)電荷），微溶于水，不溶于有機溶劑0.14摩爾法12/14/202396二、核酸及其組分的兩性性質(zhì)磷酸基、含氮堿基（一）堿基的解離12/14/202397（二）核苷的解離戊糖可增強堿基的酸性解離核糖中的羥基也可發(fā)生解離（三）核苷酸及核酸分子的解離磷酸基使核苷酸具有很強的酸性（四）核苷酸與核酸的等電點DNA等電點為4～4.5；RNA等電點為2～2.512/14/202398三、核酸的紫外吸收特性核酸的堿基具有共扼雙鍵，因而有紫外吸收性質(zhì)，吸收峰在260nm（蛋白質(zhì)的紫外吸收峰在280nm）。可利用紫外分光光度計測定各波長下的光吸收值（absorbance,A）A260或OD260：樣品在波長260nm下的光吸收值12/14/202399核酸的紫外吸收的應(yīng)用1.核酸及其組分含量的測定核酸濃度與A260成正比1μg/mlDNA，A260=0.020；1μg/mlRNA，A260=0.025；A260=1.0相當(dāng)于50μg/ml雙鏈DNA40μg/ml單鏈DNA（或RNA）12/14/20231002.核酸純度的測定通過測定260nm和280nm的光吸收比值DNA純品:A260/A280=1.8RNA純品:A260/A280=2.0含雜蛋白及苯酚，<1.8有RNA污染，>1.812/14/2023101四、核酸的變性與復(fù)性(一)核酸的變性（denaturation）1.核酸變性的概念某些理化因素會破壞氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子的高級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而引起核酸理化性質(zhì)及生物學(xué)功能發(fā)生改變變性因素：加熱、過高過低的pH值、有機溶劑、尿素及酰胺等。12/14/2023102DNA變性12/14/20231032.變性的實質(zhì)某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變12/14/2023104降解：核苷酸骨架上3’，5’-磷酸二酯鍵的斷裂DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂12/14/20231053.變性后理化性質(zhì)變化粘度下降，某些顏色反應(yīng)增強，生物學(xué)功能改變等紫外吸收增加——增色效應(yīng)12/14/202310612/14/20231074、DNA熱變性的特征變性過程是“躍變式”的，而非漸變將引起DNA變性的溫度稱為熔點（meltingtemperature，Tm）指增色效應(yīng)達50%時的溫度（或DNA變性一半所需溫度）一般DNATm值在85-90

C之間12/14/2023108Tm值大小與下列因素有關(guān)：（1）DNA的均一性：（2）G－C含量：經(jīng)驗公式：(G+C)%＝（Tm－69.3）×2.44（3）介質(zhì)中的離子強度：12/14/2023109某些DNA的Tm值60801001.01.41.2100%A260t\0CTmTmTm12312/14/2023110(二)核酸的復(fù)性（renaturation）被拆開的兩股多核苷酸鏈重新由氫鍵連接而成雙螺旋結(jié)構(gòu)——復(fù)性變性過程的逆過程熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，這一過程稱為退火(annealing)

。12/14/2023111DNA復(fù)性12/14/2023112分子量越大復(fù)性越難；濃度越大，復(fù)性越容易；減色效應(yīng)（低色效應(yīng)）——復(fù)性時紫外吸收減少的現(xiàn)象12/14/2023113第5節(jié)

核酸的研究方法

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）核酸的凝膠電泳核酸的分子印跡技術(shù)12/14/20231141.概述聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）體外擴增DNA已成為應(yīng)用最廣泛的一種生物技術(shù)。1985年K.Mullis在研究DNA聚合酶反應(yīng)時發(fā)明了這項技術(shù)。最初采用Klenow酶來擴增DNA，但每次加熱變性DNA時都會使酶失活，需要重新添加DNA聚合酶，因此使用不方便。1988年Saiki等人用耐熱的TaqDNA聚合酶取代Klenow酶之后，才使這項技術(shù)成熟，從而得到各方面的應(yīng)用。一、聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）12/14/20231152.步驟（1）設(shè)計一對引物以便有效擴增所需要的DNA序列，并盡量減少可能產(chǎn)生的非特異產(chǎn)物。（2）優(yōu)化反應(yīng)體系，以便獲得最好的擴增效果。該反應(yīng)體系應(yīng)包括適量模板(1ng～0.001ng)，引物（～100pmol/100ul）,4種dNTP(200umol/L）TaqDNA聚合酶（2u/100ul），和適量Mg2+（0.05～5mmol/L)。12/14/2023116