葛根芩連湯方煮散與飲片煎煮效果對比研究

葛根芩連湯方煮散與飲片煎煮效果對比研究

中藥湯散屬于中藥液體范疇。它具有快速吸收和快速治療的特點(diǎn)。同時(shí)，傳統(tǒng)的湯劑保持了靈活的調(diào)節(jié)和組合，隨著證候的增加，藥物在煮出過程中相互作用。煮散以其獨(dú)特的粗粉顆粒進(jìn)行煎煮,較之傳統(tǒng)飲片湯劑又有其獨(dú)特的優(yōu)勢,在保證療效的同時(shí)能減少藥材使用量、節(jié)省能源、煎出率高等,這些已被現(xiàn)代研究和臨床實(shí)踐所證實(shí)［1－5］。目前,根及根莖類中藥約占整個(gè)植物類藥材的1/3,而臨床處方用藥量逐漸增大,部分藥材資源緊缺［6］,價(jià)格不斷上漲,若將此類藥材以煮散形式應(yīng)用于臨床,不失為解決現(xiàn)代中藥藥材緊張的有效途徑之一。本文以葛根芩連湯中藥味為研究對象,葛根芩連湯出自張仲景的《傷寒論》,由葛根、黃芩、黃連、炙甘草組成,葛根、黃芩、甘草、黃連均為根或根莖類中藥。葛根主要含葛根素、大豆苷等成分［7］,黃芩主要含黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素等成分［8］,黃連主要含小檗堿、黃連堿、藥根堿、巴馬汀等成分［9］,炙甘草主要含甘草酸銨、甘草苷等成分［10］。本實(shí)驗(yàn)分別對四種飲片及煮散的煎出固形物、煎出液中有效成分的含量進(jìn)行對比研究,初步得出四種藥味煮散與飲片煎煮所得主要有效成分的化學(xué)劑量對比關(guān)系,為煮散替代飲片應(yīng)用于臨床提供科學(xué)依據(jù)。材料表面1炮制品、藥品、制劑葛根、黃芩、黃連、炙甘草購于北京雙橋燕京中藥飲片廠,葛根為豆科植物野葛Puerarialobata(Wild.)Ohwi的干燥根,黃芩為唇形科植物黃芩ScutellariabaicalensisGeorgi.的干燥根,黃連為毛茛科植物黃連CoptischinensisFranch.的干燥根莖,炙甘草為豆科植物甘草GlycyrrhizauralensisFisch.的干燥根及根莖經(jīng)蜜炙加工的炮制品,經(jīng)檢驗(yàn)均符合2010年版《中國藥典》一部的規(guī)定。葛根素(批號(hào)752-200108)、大豆苷(批號(hào)111738-200501)、黃芩苷(批號(hào)0715-9708)、黃芩素(批號(hào)111595-200905)、藥根堿(批號(hào)110733-200806)、巴馬汀(批號(hào)110733-200806)等對照品均購于中國食品藥品鑒定研究院;漢黃芩苷(批號(hào)1119-090820)、黃連堿(批號(hào)1413-091027)、小檗堿(批號(hào)1370-090805)、甘草苷(批號(hào)1105-091121)、甘草酸銨(批號(hào)1234-091020)均購于中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心。乙腈、甲醇為Fisher,HPLC級;水為娃哈哈高純水;其余試劑均為分析純。2俄羅斯lcsolus工作站LC20A高效液相色譜儀(日本島津公司,配有LCsolution工作站);BP211D天平(德國Sartori-us公司)。方法和結(jié)果1單味藥物指數(shù)成分的檢測方法1.1葛根素、大豆苷的標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍1.1.1色譜條件HypersilODS色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相甲醇-0.02%磷酸溶液(25∶75);檢測波長250nm;流速1.0mL·min－1;柱溫40℃。對照品進(jìn)樣量5μL,供試品進(jìn)樣量10μL,色譜圖見圖1。1.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍取葛根素、大豆苷對照品適量,精密稱定,加甲醇稀釋,得到質(zhì)量濃度為122.8,43.36μg·mL－1的混合溶液,作為對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液2,4,6,8,10,12μL注入液相色譜儀,按上述方法測定,以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),以進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。葛根素回歸方程為Y=3819716X+555.1(r=0.9999),線性范圍0.246~1.474μg;大豆苷回歸方程為Y=3755705X-1903.7(r=0.9999),線性范圍0.087~0.520μg。1.1.3供試品溶液的制備精密量取葛根水煎液樣品各1mL,加甲醇稀釋至5mL,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1.2.1色譜條件HypersilODS色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);流動(dòng)相甲醇-0.2%磷酸溶液(47∶53);檢測波長為280nm;流速1.0mL·min－1;柱溫35℃。對照品進(jìn)樣量5μL,供試品進(jìn)樣量10μL,色譜圖見圖2。1.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍取黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素對照品,精密稱定,加50%甲醇稀釋,得到質(zhì)量濃度為123.24,92.16,57.42μg·mL－1的混合溶液,作為對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液2,4,6,8,10μL注入液相色譜儀,按上述方法測定,以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。黃芩苷回歸方程為Y=2443898X-4755(r=0.9999),線性范圍0.246~1.23μg;漢黃芩苷回歸方程為Y=3152290X-3458(r=0.9999),線性范圍0.184~0.922μg;黃芩素回歸方程為Y=5284136X-37637(r=0.9997),線性范圍0.115~0.574μg。1.2.3供試品溶液的制備精密量取黃芩水煎液樣品各1mL,加甲醇稀釋至5mL,搖勻,再精密量取1mL置10mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。1.3標(biāo)準(zhǔn)曲線、線性范圍考察1.3.1色譜條件MerckChromolithRP-18e色譜柱(100mm×4.6mm,2μm);以0.05%磷酸(含0.01mol·L－1磷酸二氫鉀)為流動(dòng)相A,以乙腈為流動(dòng)相B,梯度洗脫,0~15min,8%~14%B;15~25min,14%~16%B;25~45min,16%~38%B;檢測波長345nm;流速:2mL·min－1;柱溫:35℃。對照品進(jìn)樣量10μL,供試品進(jìn)樣量10μL,色譜圖見圖3。1.3.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍取黃連堿、藥根堿、小檗堿、巴馬汀對照品,精密稱定,加50%甲醇稀釋,得到質(zhì)量濃度為36.92,34.96,74.56,47.12μg·mL－1的混合溶液,作為對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液2,4,6,8,10,12μL注入液相色譜儀,按上述方法測定,以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。黃連堿回歸方程為Y=3307820X-4317(r=0.9999),線性范圍0.074~0.443μg;藥根堿回歸方程為Y=3597630X-2036(r=0.9999),線性范圍0.070~0.420μg;小檗堿回歸方程為Y=2909778X-3886(r=0.9999),線性范圍0.14~0.895μg;巴馬汀回歸方程為Y=3585734X-2870(r=0.9999),線性范圍0.094~0.565μg。1.3.3供試品溶液的制備精密量取黃連水煎液樣品各1mL,加甲醇稀釋至25mL,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍試驗(yàn)1.4.1色譜條件HypersilODS色譜柱(250mm×4.6mm,5μm);以乙腈為流動(dòng)相A,以0.5%磷酸溶液為流動(dòng)相B,梯度洗脫,0~8min,81%B;8~35min,81%~50%B;35~36min,50%~0%B;36~40min,0%~81%B;檢測波長237nm;流速:1mL·min－1;柱溫35℃。對照品進(jìn)樣量5μL,供試品進(jìn)樣量10μL,色譜圖見圖4。1.4.2標(biāo)準(zhǔn)曲線及線性范圍取甘草酸銨、甘草苷對照品,精密稱定,加50%甲醇稀釋,得到質(zhì)量濃度為67.80,63.66μg·mL－1的混合溶液,作為對照品溶液。精密吸取混合對照品溶液2,4,6,8,10μL注入液相色譜儀,按上述方法測定,以峰面積積分值(Y)為縱坐標(biāo),進(jìn)樣量(X)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。甘草酸銨回歸方程為Y=492328X-638.4(r=0.9999),線性范圍0.136~0.678μg;甘草苷回歸方程為Y=1794240X-915.8(r=0.9999),線性范圍0.127~0.637μg。1.4.3供試品溶液的制備精密量取甘草水煎液樣品各1mL,加甲醇稀釋至5mL,搖勻,用0.45μm微孔濾膜濾過,取續(xù)濾液即得。2統(tǒng)計(jì)分析測定結(jié)果采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析。2.1樣品處理和有效成分測定2.1.1煮散煎液的制備將飲片粉碎為煮散顆粒,精密稱取5g,加20倍量水,浸泡20min,煎煮20min,煎煮1次,紗布濾過,濾液定容至100mL,備用。2.1.2煮散煎煮法制備飲片煎液(A液)精密稱取飲片5g,加20倍量水,浸泡20min,煎煮20min,煎煮1次,紗布濾過,濾液定容至100mL,備用。2.1.3常規(guī)煎煮法制備飲片煎液(B液)精密稱取飲片5g,浸泡20min,煎煮2次,第1次加6倍量水,第2次加6倍量水,各煎煮30min,紗布濾過,濾液合并,定容至100mL,備用。2.1.4干膏率測定精密移取各樣品水煎液10mL,分別置于已干燥至恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中,水浴蒸干,于105℃干燥3h,置干燥器中冷卻0.5h,迅速稱定質(zhì)量,計(jì)算干膏率,結(jié)果見圖5~圖8。2.1.5有效成分含量測定結(jié)果葛根、黃芩、黃連、炙甘草中水煎液有效成分含量測定結(jié)果見圖5~圖8。結(jié)果表明,對比分析煎煮液中有效成分的含量,葛根煮散為飲片(A)的1.7倍(P<0.05),為飲片(B)的1.4倍(P<0.05);對比分析干膏率,葛根煮散為飲片(A)的2.4倍(P<0.05),為飲片(B)的1.8倍(P<0.05)。結(jié)果表明,對比分析煎煮液中有效成分的含量,黃芩煮散為飲片(A)的1.4倍(P<0.05),為飲片(B)的1.2倍(P<0.05);對比分析干膏率,黃芩煮散為飲片(A)的1.3倍(P<0.05),為飲片(B)的1.2倍(P<0.05)。結(jié)果表明,對比分析煎煮液中有效成分的含量,黃連煮散為飲片(A)的1.6倍(P<0.05),為飲片(B)的1.35倍(P<0.05);對比分析干膏率,黃連煮散為飲片(A)的1.5倍(P<0.05),為飲片(B)的1.3倍(P<0.05)。炙甘草水煎液有效成分含量及干膏率見圖8。結(jié)果表明,對比分析煎煮液中有效成分的含量,炙甘草煮散為飲片(A)的2.5倍(P<0.05),為飲片的1.5倍(P<0.05);對比分析干膏率,炙甘草煮散為飲片(A)的1.4倍(P<0.05),為飲片(B)的1.2倍(P<0.05)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析第2種以塊狀或段狀形式存在的根及根莖類飲片,質(zhì)地或硬或堅(jiān)實(shí),溶劑不易進(jìn)入細(xì)胞組織溶解其有效成分,經(jīng)過適當(dāng)?shù)姆鬯?在一定程度上破壞了細(xì)胞組織,增大了表面積,改變了物理形態(tài),根據(jù)Fick第一擴(kuò)散定律,物質(zhì)的擴(kuò)散量正比于藥材的比表面積,增加藥材的比表面積進(jìn)而能增加藥物浸出效率,即粒度變小提取率均明顯升高［15］。不同的根及根莖類飲片與煮散在相同煎煮條件下有效成分煎出量倍數(shù)不一致,可能與飲片自身的物理形狀、比表面積、孔隙結(jié)構(gòu)等有關(guān)。課題組研究發(fā)現(xiàn)黃連飲片若為圓柱形段狀,煮散有效成分煎出量可達(dá)到飲片的4倍,由此亦可見,臨床使用飲片的性狀規(guī)范也極為重要,直接影響其煎煮效果。甘草飲片的顯微結(jié)構(gòu)顯示其致密組織較多［16］,則可能會(huì)影響有效成分從細(xì)胞中的溶出,而制成煮散可破壞其組織結(jié)構(gòu),使成分易于溶出,因此兩者煎出效果差異較大。本文通過對比根及根莖類煮散與飲片的兩種煎煮方法中煎出液中有效成分的含量,進(jìn)一步證明了煮散具有比飲片煎出速率快,