青霉素G酰化酶的應(yīng)用

β-內(nèi)酰胺類抗生素是當(dāng)前應(yīng)用最為廣泛的一類抗細(xì)菌感染藥物，酶法合成β-內(nèi)酰胺類抗生素具有反應(yīng)條件溫和、反應(yīng)步驟簡單、反應(yīng)過程綠色環(huán)保等特點，成為研究者關(guān)注的熱點。青霉素G?；福≒GA）是酶法合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的關(guān)鍵酶，因為利用游離酶生產(chǎn)存在著生產(chǎn)成本高、酶穩(wěn)定性差、分離難度大和酶回收利用難等問題，生產(chǎn)中常使用固定化酶。盡管青霉素G?；腹潭ɑ芯咳〉昧酥匾M(jìn)展，但是目前可以載體和反應(yīng)器依舊不多。一種操作性良好、固定化步驟簡單、固定化成本低廉、普遍適用各類酶和催化環(huán)境的固定化方法以及固定化載體仍是發(fā)展的主流。因此，我們將3D打印技術(shù)與酶固定化有機(jī)結(jié)合，這樣不僅可以得到價格低廉，安全無毒的載體材料，更可以靈活的制造結(jié)構(gòu)復(fù)雜的部件，以滿足各類反應(yīng)器的實際生產(chǎn)需求。本文的主要研究內(nèi)容如下：本文從實驗室篩選到的一株高合成活性的青霉素G?；赋霭l(fā)，以碳纖維支撐的聚乳酸（C-PLA）為載體，通過食人魚溶液處理，再使用硅烷偶聯(lián)劑對其表面進(jìn)行活性改性，向載體表面引入氨基基團(tuán)，使得青霉素G酰化酶可以通過共價結(jié)合固定在載體上，最后利用固定化酶合成阿莫西林。（1）C-PLA載體的修飾與酶的固定化：對食人魚溶液處理的條件進(jìn)行優(yōu)化，通過預(yù)實驗，初步選定了溫度，時間，溶液添加比例三個條件的優(yōu)化范圍，在此基礎(chǔ)上，進(jìn)行響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析，最終得到最優(yōu)處理條件：溫度：84℃；添加比例：30%過氧化氫/濃硫酸（v/v）=1.4；時間：110min。完成載體處理后使用3%(v/v)氨基硅烷對載體進(jìn)行活化，活化時間30min，充分洗滌后用3%的戊二醛溶液處理2小時，洗滌后使用6U/mLPGA粗酶液對1g修飾后的載體進(jìn)行固定化，固定10h，固定化酶比活為4.03U/g,擔(dān)載量為2.31mg/g。（2）C-PLA載體的表征：通過傅里葉變換紅外分析（FT-IR）,掃描電鏡（SEM）,N2吸附-脫附曲線對修飾前后的載體進(jìn)行表征，綜合表征結(jié)果可以看出，修飾后的載體仍然具有較好的機(jī)械結(jié)構(gòu)，且比表面積在食人魚刻蝕后增大，通過硅烷偶聯(lián)劑修飾后成功引入了氨基基團(tuán)，與實驗預(yù)期相符。（3）固定化酶的催化性能：6-APA：D-HPGME?HCl=200mM：240mM，反應(yīng)初始pH為6.0，反應(yīng)溫度為20?C。在此最適條件下，S/H值達(dá)到3.75，反應(yīng)240min，通過流加活性?；w的方法，阿莫西林的合成轉(zhuǎn)化率達(dá)92.5%，產(chǎn)物從反應(yīng)體系中析出，實現(xiàn)了原位分離。固定化酶重復(fù)使用使用10次還有88.1%的初試轉(zhuǎn)化率。1.1青霉素G?；父攀靓?內(nèi)酰胺類抗生素是臨床上使用最為廣泛的一類抗細(xì)菌感染藥物，具有殺菌活性強(qiáng)、毒性低、適應(yīng)征廣、副作用小等諸多優(yōu)點。臨床上常見的β-內(nèi)酰胺類抗生素有阿莫西林、氨芐西林、甲氧西林、青霉素V、亞胺培南、美洛培南等。由中國產(chǎn)業(yè)信息網(wǎng)統(tǒng)計，2014年我國β-內(nèi)酰胺類抗生素年銷售額能達(dá)到1016億元，占有78%的抗生素銷售份額，預(yù)計2019年年銷售額可達(dá)1300億元。由于部分天然抗生素不適應(yīng)酸性環(huán)境，不宜口服甚至還會產(chǎn)生過敏反應(yīng)，研發(fā)新型抗生素具有重要意義，為此，半合成抗生素引起人們的關(guān)注。目前主要采用化學(xué)法和酶法進(jìn)行β-內(nèi)酰胺類抗生素的合成，而化學(xué)法占有較大份額。但是由于現(xiàn)代人們對環(huán)境保護(hù)的關(guān)注度上升，利用酶法合成β-內(nèi)酰胺類抗生素的生產(chǎn)方法成為研究的熱點。與化學(xué)法相比，酶法合成β-內(nèi)酰胺類抗生素具有反應(yīng)步驟少、產(chǎn)品純凈、生產(chǎn)廢棄物少、易于分離等優(yōu)點，是一種綠色環(huán)保的生產(chǎn)方式ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Arroyo</Author><Year>2003</Year><RecNum>53</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[1]</style></DisplayText><record><rec-number>53</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555128275">53</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Arroyo,M.,.</author><author>Mata,I,DeLa</author><author>Acebal,C.,.</author><author>MPilar,Castillón%JAppliedMicrobiology</author><author>Biotechnology</author></authors></contributors><titles><title>Biotechnologicalapplicationsofpenicillinacylases:state-of-the-art</title></titles><pages>507-514</pages><volume>60</volume><number>5</number><dates><year>2003</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[1]。青霉素G?；福≒enicillinGacylase,PGA，E.C.3.5.1.11）最大的用途是制備半合成抗生素母核以及拆分手性DL-苯甘氨酸ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Vandamme</Author><Year>1977</Year><RecNum>55</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[2,3]</style></DisplayText><record><rec-number>55</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555133053">55</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Vandamme,E.J.%JAdvancesinAppliedMicrobiology</author></authors></contributors><titles><title>EnzymesInvolvedinβ-LactamAntibioticBiosynthesis</title></titles><pages>89</pages><volume>21</volume><number>21</number><dates><year>1977</year></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Verhaert</Author><Year>1997</Year><RecNum>57</RecNum><record><rec-number>57</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555134796">57</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Verhaert,RM,</author><author>Riemens,AM,</author><author>Laan,JM,VanDer</author><author>Duin,J,Van</author><author>Quax,WJ,%JApplied</author><author>EnvironmentalMicrobiology</author></authors></contributors><titles><title>MolecularcloningandanalysisofthegeneencodingthethermostablepenicillinGacylasefromAlcaligenesfaecalis</title></titles><pages>3412</pages><volume>63</volume><number>9</number><dates><year>1997</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[2,3]。隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)以及對酶催化的認(rèn)識不斷深入，研究者把目光投向半合成抗生素如阿莫西林、氨芐西林等具有廣譜抗菌性抗感染藥物的綠色合成。1.1.1青霉素G?；傅膽?yīng)用青霉素G酰化酶已被成功用于催化合成半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素和β-內(nèi)酰胺類抗生素中間體的生產(chǎn)，此外，青霉素?；高€被用于短鏈多肽的合成脫保護(hù)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Fuganti</Author><Year>1986</Year><RecNum>70</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[14]</style></DisplayText><record><rec-number>70</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555138139">70</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Fuganti,Claudio</author><author>Grasselli,Piero</author><author>Casati,Paolo%JCheminform</author></authors></contributors><titles><title>Immobilizedpenicillinacylase:Applicationtothesynthesisofthedipeptideaspartame</title></titles><pages>3191-3194</pages><volume>27</volume><number>27</number><dates><year>1986</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[4]、拆分外消旋的氨基脂類物質(zhì)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Fadnavis</Author><Year>1997</Year><RecNum>67</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[15]</style></DisplayText><record><rec-number>67</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555137800">67</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Fadnavis,NitinW.</author><author>Sharfuddin,Mohd.</author><author>Vadivel,S.Kumara</author><author>Bhalerao,UdayT.%JJournaloftheChemicalSocietyPerkinTransactions</author></authors></contributors><titles><title>Efficientchemoenzymaticsynthesisof(2S,3S)-3-hydroxyleucinemediatedbyimmobilisedpenicillinGacylase?</title></titles><pages>3577-3578</pages><volume>24</volume><number>24</number><dates><year>1997</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[5]。（1）催化水解產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺類抗生素中間體在上個世紀(jì)70年代，多種β-內(nèi)酰胺類抗生素中間體主要以化學(xué)法生產(chǎn)，其合成工藝較為復(fù)雜，生產(chǎn)條件需要高溫高壓，同時還使用多種有毒有害的試劑，原子經(jīng)濟(jì)性較差A(yù)DDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Deshmukh</Author><Year>1982</Year><RecNum>142</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[16]</style></DisplayText><record><rec-number>142</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555620354">142</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Deshmukh,P.V.%JHindustanAntibioticsBulletin</author></authors></contributors><titles><title>Recentadvancesinthechemistryofbeta-lactamantibiotics</title></titles><pages>127</pages><volume>24</volume><number>3-4</number><dates><year>1982</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[6]。Sudhakaran等通過熱力學(xué)控制的方法利用大腸桿菌來源的青霉素G?；杆?-PADCA生成7-ADCA，調(diào)節(jié)反應(yīng)溫度為50℃，反應(yīng)pH為8.5,110min內(nèi)完成5%的7-PADCA的水解ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Sudhakaran</Author><Year>1989</Year><RecNum>141</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[17]</style></DisplayText><record><rec-number>141</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555619826">141</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Sudhakaran,V.K.</author><author>Deshpande,B.S.</author><author>Ambedkar,S.S.</author><author>Shewale,J.G.%JHindustanAntibioticsBulletin</author></authors></contributors><titles><title>Enzymatichydrolysisof7-phenylacetamidodesacetoxycephalosporanicacidbyimmobilizedpenicillinGacylase</title></titles><pages>79-82</pages><volume>31</volume><number>3-4</number><dates><year>1989</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[7]。（2）催化合成半合成β-內(nèi)酰胺類抗生素各種具有抗菌活性的半合成抗生素可以用7-ADCA、6-APA等母核與各種活性?；w在酸性條件下催化合成。酶法合成β-內(nèi)酰胺類抗生素可以分為熱力學(xué)控制和動力學(xué)控制兩種方法。熱力學(xué)控制是依靠熱力學(xué)平衡，通過改變各種反應(yīng)條件使得反應(yīng)平衡往產(chǎn)物方向偏移從而增加產(chǎn)率，但反應(yīng)平衡不受催化劑影響。動力學(xué)控制合成與反應(yīng)條件和催化劑性質(zhì)有關(guān)，可以改變反應(yīng)平衡，從而獲得更高的產(chǎn)率。當(dāng)前研究主要是通過動力學(xué)控制的方法合成半合成內(nèi)酰胺類抗生素。（3）拆分手性化合物在醫(yī)藥行業(yè)中，手性藥物占有重要地位。青霉素?；缚梢圆鸱职被?、胺、仲醇，在立體構(gòu)型中更偏向D-型氨基酸，其對含苯環(huán)的酰基側(cè)鏈也有很高的選擇性，可以催化苯環(huán)上的?；鶑拇?、胺或者肽鏈上水解離去，獲得單一的對映體，達(dá)到手性拆分的目的ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Langen</Author><Year>2000</Year><RecNum>68</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[24]</style></DisplayText><record><rec-number>68</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555137985">68</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Langen,L.M.Van</author><author>Oosthoek,N.H.P.</author><author>Guranda,D.T.</author><author>Rantwijk,F.Van</author><author>?vedas,V.K.</author><author>Sheldon,R.A.%JTetrahedronAsymmetry</author></authors></contributors><titles><title>Penicillinacylase-catalyzedresolutionofaminesinaqueousorganicsolvents</title></titles><pages>4593-4600</pages><volume>11</volume><number>22</number><dates><year>2000</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[8]。（4）有機(jī)合成的脫保護(hù)多肽及其衍生物在藥物、藥物載體、食品等領(lǐng)域具有巨大的應(yīng)用潛力，化學(xué)合成多肽往往需要保護(hù)某些基團(tuán)。在有機(jī)合成中，青霉素?；改軌蛟跍睾偷臈l件下對苯乙酰衍生物保護(hù)的羥基或者氨基等基團(tuán)進(jìn)行水解脫保護(hù)。1.1.2酶法合成半合成抗生素的過程控制方法利用PGA酶法制備半合成抗生素是PGA的應(yīng)用之一,其合成方法分為熱力學(xué)控制合成和動力學(xué)控制合成兩種ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Fernández-Lafuente</Author><Year>1996</Year><RecNum>71</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[25]</style></DisplayText><record><rec-number>71</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555138862">71</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Fernández-Lafuente,R.</author><author>Rosell,C.M.</author><author>Piatkowska,B.</author><author>Guisán,J.M.%JEnzyme</author><author>MicrobialTechnology</author></authors></contributors><titles><title>Synthesisofantibiotics(cephaloglycin)catalyzedbypenicillinGacylase:Evaluationandoptimizationofdifferentsyntheticapproaches</title></titles><pages>9-14</pages><volume>19</volume><number>1</number><dates><year>1996</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[25]。熱力學(xué)控制主要應(yīng)用在半合成抗生素母核的制備，溫度是影響水解產(chǎn)率的主要控制因素。為了提高半合成抗生素的產(chǎn)率，使用動力學(xué)控制方法合成較為容易實現(xiàn)。該過程如圖1-4所示（以阿莫西林和頭孢羥氨芐的合成為例）ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Pan</Author><Year>2018</Year><RecNum>23</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[26]</style></DisplayText><record><rec-number>23</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="0">23</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Pan,Xin</author><author>Wang,Li</author><author>Ye,Jiajie</author><author>Qin,Song</author><author>He,Bingfang</author></authors></contributors><titles><title>Efficientsynthesisofbeta-lactamantibioticswithverylowproducthydrolysisbyamutantProvidenciarettgeripenicillinGacylase</title><secondary-title>AppliedMicrobiologyandBiotechnology</secondary-title></titles><periodical><full-title>AppliedMicrobiologyandBiotechnology</full-title></periodical><pages>1749-1758</pages><volume>102</volume><number>4</number><dates><year>2018</year><pub-dates><date>Feb</date></pub-dates></dates><isbn>0175-7598</isbn><accession-num>WOS:000424053700019</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000424053700019</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1007/s00253-017-8692-8</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[26]。Wu等用青霉素G鉀鹽和HPGME按150mM：450mM的比例一鍋法合成阿莫西林，他們通過對溫度、有機(jī)溶劑添加等熱力學(xué)因素控制青霉素G鉀鹽的水解，使用?；w作為原料，采用動力學(xué)方法控制阿莫西林的合成，最終達(dá)55%的阿莫西林產(chǎn)率ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wu</Author><Year>2010</Year><RecNum>143</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[27]</style></DisplayText><record><rec-number>143</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555621933">143</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Wu,Qi</author><author>Chen,ChunXiu</author><author>Du,LiLi</author><author>Lin,XianFu%JAppliedBiochemistry</author><author>Biotechnology</author></authors></contributors><titles><title>EnzymaticSynthesisofAmoxicillinviaaOne-potEnzymaticHydrolysisandCondensationCascadeProcessinthePresenceofOrganicCo-solvents</title></titles><pages>2026-2035</pages><volume>160</volume><number>7</number><dates><year>2010</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[27]。圖1-4動力學(xué)控制合成阿莫西林和頭孢羥氨芐示意圖Fig.1-4Kineticallycontrolledsynthesisofamoxicillinandcefadroxil.ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Pan</Author><Year>2018</Year><RecNum>23</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[26]</style></DisplayText><record><rec-number>23</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="0">23</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Pan,Xin</author><author>Wang,Li</author><author>Ye,Jiajie</author><author>Qin,Song</author><author>He,Bingfang</author></authors></contributors><titles><title>Efficientsynthesisofbeta-lactamantibioticswithverylowproducthydrolysisbyamutantProvidenciarettgeripenicillinGacylase</title><secondary-title>AppliedMicrobiologyandBiotechnology</secondary-title></titles><periodical><full-title>AppliedMicrobiologyandBiotechnology</full-title></periodical><pages>1749-1758</pages><volume>102</volume><number>4</number><dates><year>2018</year><pub-dates><date>Feb</date></pub-dates></dates><isbn>0175-7598</isbn><accession-num>WOS:000424053700019</accession-num><urls><related-urls><url><GotoISI>://WOS:000424053700019</url></related-urls></urls><electronic-resource-num>10.1007/s00253-017-8692-8</electronic-resource-num></record></Cite></EndNote>[26]動力學(xué)控制的反應(yīng)過程中，由于存在產(chǎn)物二次水解的情況，積累的最高產(chǎn)量(Pmax)只是一個暫時的值，它可以衡量各種PGA生產(chǎn)半合成抗生素的能力。PGA催化抗生素合成的另一個重要參數(shù)是S/H，它是產(chǎn)物的初始合成速度與底物初始水解速度的比值。該參數(shù)可以比較不同PGA的合成活性，它與酶本身的性質(zhì)和底物濃度有關(guān)ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Youshko</Author><Year>2002</Year><RecNum>73</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[28]</style></DisplayText><record><rec-number>73</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555139118">73</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Youshko,MaximI</author><author>Chilov,GhermesG</author><author>Shcherbakova,TatyanaA</author><author>?vedas,VytasK%JBBA-Proteins</author><author>Proteomics</author></authors></contributors><titles><title>Quantitativecharacterizationofthenucleophilereactivityinpenicillinacylase-catalyzedacyltransferreactions</title></titles><pages>134-140</pages><volume>1599</volume><number>1</number><dates><year>2002</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[28]。S/H受催化環(huán)境和固定化方法影響，S/H隨溫度、pH、加酶量變化，酶進(jìn)行固定化后S/H發(fā)生改變。PGA既可以催化底物的水解，也催化產(chǎn)物的水解，α值表示酶分子對抗生素產(chǎn)物（Ps）和?；w（AD）的水解偏好性，用于描述抗生素產(chǎn)物和活性?；w競爭酶的情況，這個值低越好ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Mihailovska</Author><Year>2005</Year><RecNum>74</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[29]</style></DisplayText><record><rec-number>74</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555140017">74</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Mihailovska,Elena%JEnzyme</author><author>MicrobialTechnology</author></authors></contributors><titles><title>Anovelpenicillinacylasefromtheenvironmentalgenepoolwithimprovedsyntheticproperties</title></titles><pages>182-190</pages><volume>36</volume><number>2-3</number><dates><year>2005</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[29]。一個酶具有低的α值表示該酶對產(chǎn)物水解能力弱，有利于產(chǎn)物的積累。α值可以表示為：

α=kcatKmPs(k為了獲得更高的產(chǎn)率，通常需要提供過量的?；w，從綠色合成的角度出發(fā)，達(dá)到計量化學(xué)產(chǎn)率理論值，酰基供體與母核的比例接近1:1，為達(dá)到這一目的，關(guān)鍵在于提高S/H。綜合上述因素，一個具有開發(fā)潛力的PGA應(yīng)該具有高的Pmax、高的S/H以及低的α值。我們可以在合成的過程中可以通過對pH、溫度、加酶量這些參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，來提高合成產(chǎn)率。1.2酶的固定化概述酶具有高效催化性、底物專一性和反應(yīng)條件溫和等特點，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)。限制游離酶大規(guī)模使用的原因有：首先，酶的活性受使用環(huán)境影響，在使用的過程中容易失去催化能力。直接使用游離酶進(jìn)行生產(chǎn)時，酶的穩(wěn)定性較差，且容易受溫度、極端酸堿性、有機(jī)試劑、金屬離子以及高濃度的催化底物或產(chǎn)物等影響。其次游離酶難以回收利用，混入產(chǎn)物之中會導(dǎo)致分離難度增加。且催化劑成本也比較高。固定化酶可提高生物催化劑的穩(wěn)定性和重復(fù)使用性。酶的固定化是指在保留酶的活性的基礎(chǔ)上，通過物理或化學(xué)的方法將游離酶固定在一定的空間范圍內(nèi)，形成顆粒狀固體，使得生物催化劑回收利用更為簡便的一項技術(shù)。固定化酶具有下列優(yōu)點：（1）重復(fù)可用性（2）穩(wěn)定性提高（3）降低分離成本，提高產(chǎn)品質(zhì)量（4）降低酶制劑使用成本（5）使反應(yīng)可控。固定化酶是上世紀(jì)60年代發(fā)展起來的一項新技術(shù)，1971年，當(dāng)?shù)谝粚靡怨潭ɑ笧橹黝}的國際酶工程會議在美國召開后，固定化的研究才得到真正重視的發(fā)展ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Kennedy</Author><Year>1981</Year><RecNum>76</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[30]</style></DisplayText><record><rec-number>76</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555142603">76</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Kennedy,JohnF.</author><author>White,CharlesA.%JEnzyme</author><author>MicrobialTechnology</author></authors></contributors><titles><title>Immobilizedenzymes:Anintroductionandapplicationsinbiotechnology:M.D.TrevanJohnWileyandSons,Chichester,1980,xiv+138pp,￡8.75,US$24.10</title></titles><pages>376-376</pages><volume>3</volume><number>4</number><dates><year>1981</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[12]。經(jīng)典的固定化方式可分為吸附法、共價結(jié)合法、交聯(lián)法和包埋法ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>徐莉</Author><Year>2010</Year><RecNum>77</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[31]</style></DisplayText><record><rec-number>77</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555142878">77</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>徐莉</author><author>侯紅萍%J釀酒科技</author></authors></contributors><titles><title>酶的固定化方法的研究進(jìn)展</title></titles><pages>86-89</pages><volume>2010</volume><number>1</number><dates><year>2010</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[13]，（1）吸附法是指利用分子間的一些非共價鍵的相互作用力（如氫鍵、離子鍵、疏水相互作用力及范德華力等），將游離酶吸附在載體上的一種方法。根據(jù)酶與載體之間結(jié)合力不同，吸附法又可分為物理吸附和離子吸附兩種。物理吸附常用的材料有硅藻土、活性炭、多孔陶瓷以及分子篩等，當(dāng)前有不少納米材料如介孔二氧化鈦、二氧化硅也是吸附法的常用材料ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>周成</Author><Year>2008</Year><RecNum>78</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[32]</style></DisplayText><record><rec-number>78</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555143087">78</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>周成</author><author>王安明</author><author>王華</author><author>杜志強(qiáng)</author><author>祝社民</author><author>楊明</author><author>張俊</author><author>沈樹寶%J中國抗生素雜志</author></authors></contributors><titles><title>青霉素?；傅墓潭ɑc應(yīng)用新進(jìn)展</title></titles><pages>257-264</pages><volume>33</volume><number>5</number><dates><year>2008</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[32]。離子吸附則需要載體帶有與游離蛋白質(zhì)不同的電荷，以便二者通過靜電作用相互吸引，常用的載體有陰陽離子交換樹脂。最早的被用于工業(yè)化生產(chǎn)的固定化酶就是通過吸附法進(jìn)行固定化的，Tosa團(tuán)隊把氨基酰化酶吸附在DEAE-纖維素上，用于連續(xù)生產(chǎn)拆分DL-氨基酸。該方法具有操作簡便、固定化條件溫和的特點，一般不會引起酶的失活，并且固定化的載體選擇范圍廣，但因為是吸附法利用相互作用力，酶與載體結(jié)合力弱，所以酶容易脫落，這限制了這一方法的廣泛使用。（2）包埋法是把酶包埋進(jìn)高分子凝膠或者半透膜之中的一種固定化方法。首先將酶均勻地分散到液相中，然后通過一定的手段把酶包裹到某種載體之中，受傳質(zhì)阻力的影響，包埋法不適合催化反應(yīng)體系中有大分子的反應(yīng)。同時，受外部包埋材料的影響，固定化酶的酶活也可能受到影響。當(dāng)前常用的包埋材料有海藻酸鈣凝膠、卡拉膠、聚乙烯醇和各類生物半透膜ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>高磊章</Author><Year>2016</Year><RecNum>79</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[33]</style></DisplayText><record><rec-number>79</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555143850">79</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>高磊章</author><author>金利群%J發(fā)酵科技通訊</author></authors></contributors><titles><title>青霉素G?；傅墓潭ɑ芯窟M(jìn)展</title></titles><pages>55-60</pages><volume>45</volume><number>1</number><dates><year>2016</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[33]。包埋法的反應(yīng)條件較為溫和，幾乎可以包裹所有參與固定化的酶，但由于傳質(zhì)阻力的問題，利用包埋法固定化的酶對底物的親和力較低。而且，由于包埋法載體不穩(wěn)定，酶容易泄露。由于微膠囊包埋與細(xì)胞結(jié)構(gòu)類似，當(dāng)前微膠囊包埋的方法正在藥物治療、藥物遞送給藥方面廣受關(guān)注。（3）共價結(jié)合是指酶通過共價鍵的形式與載體相結(jié)合的固定化方法。共價結(jié)合法要求載體材料帶有環(huán)氧、氨基、羥基、羧基等基團(tuán)，然后通過對載體的活化與酶形成共價鍵ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>Wiseman</Author><Year>1977</Year><RecNum>80</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[34]</style></DisplayText><record><rec-number>80</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555144044">80</key></foreign-keys><ref-typename="Book">6</ref-type><contributors><authors><author>Wiseman,A</author></authors></contributors><titles><title>Topicsinenzymeandfermentationbiotechnology</title></titles><dates><year>1977</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[34]。共價固定的酶與載體結(jié)合十分牢固，因而酶具有較高的重復(fù)使用性，所以這是當(dāng)前比較普遍的一種固定化方式。酶與載體反應(yīng)的過程需要復(fù)雜的修飾，并且酶活性中心可能因為與載體反應(yīng)而導(dǎo)致失活。可供共價修飾的固定化載體比較多，大部分是天然的大分子亦或者是人工合成的高分子化合物，當(dāng)前多種多樣的固定化載體也已經(jīng)投入到工業(yè)生產(chǎn)之中ADDINEN.CITE<EndNote><Cite><Author>KATCHALSKIKATZIR</Author><Year>2000</Year><RecNum>81</RecNum><DisplayText><styleface="superscript">[35,36]</style></DisplayText><record><rec-number>81</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555144295">81</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>KATCHALSKIKATZIR</author><author>KRAEMER</author><author>D.,M%JJournalofMolecularCatalysisBEnzymatic</author></authors></contributors><titles><title>Eupergit?C,acarrierforimmobilizationofenzymesofindustrialpotential</title></titles><pages>157-176</pages><volume>10</volume><number>1</number><dates><year>2000</year></dates><urls></urls></record></Cite><Cite><Author>Mateo</Author><Year>2010</Year><RecNum>82</RecNum><record><rec-number>82</rec-number><foreign-keys><keyapp="EN"db-id="a9assvwxmx5d0refsz5xv55t2fe92ee2ddpf"timestamp="1555144395">82</key></foreign-keys><ref-typename="JournalArticle">17</ref-type><contributors><authors><author>Mateo,Cesar</author><author>Abian,Olga</author><author>Fernández-Lorente,Gloria</author><author>Pedroche,Justo</author><author>Fernández-Lafuente,Roberto</author><author>Guisan,JoseM.%JBiotechnologyProgress</author></authors></contributors><titles><title>EpoxySepabeads:ANovelEpoxySupportforStabilizationofIndustrialEnzymesviaVeryIntenseMultipointCovalentAttachment</title></titles><pages>629-634</pages><volume>18</volume><number>3</number><dates><year>2010</year></dates><urls></urls></record></Cite></EndNote>[35,36]。共價結(jié)合通過化學(xué)鍵增加酶與載體結(jié)合的穩(wěn)定性，可以實現(xiàn)固定化酶多次重復(fù)利用，但是酶與載體共價結(jié)合制備條件激烈，酶表面氨基酸會參與反應(yīng)，甚至活性中心也會受到影響，劇烈的的化學(xué)反應(yīng)會改變酶的構(gòu)象，造成酶活的損失。(4)交聯(lián)法是指利用多功能試劑使得酶分子間相互交聯(lián)，從而實現(xiàn)酶的固定化。交聯(lián)最常用的交聯(lián)劑是戊二醛，此外還有順丁烯二醋酸、聚荃淀粉等。但由于該方法損失嚴(yán)重，故這個方法很少單獨使用，常和其他方法連用。1.33D打印技術(shù)酶催化在于它們在食品，化學(xué)，制藥和其他行業(yè)等多種領(lǐng)域的應(yīng)用，促進(jìn)了精細(xì)化學(xué)品，食品添加劑和藥品的綠色制造和可持續(xù)生產(chǎn)。然而，在工業(yè)應(yīng)用中，游離酶催化反應(yīng)在復(fù)雜的反應(yīng)體系中容易失活，例如有機(jī)相，高濃度反應(yīng)體系，高溫，極端pH范圍等。而且，游離酶不能長時間穩(wěn)定地操作和再利用，并且酶難以與反應(yīng)體系分離。酶可以與載體組合以完成酶的回收和再利用以增加穩(wěn)定性。固定化酶可形成反應(yīng)器以增加可操作性和持久性以達(dá)到連續(xù)反應(yīng)的目的。但是由于載體過于昂貴，商業(yè)化的效果并不理想。許多固定化載體具有低蛋白質(zhì)負(fù)載和固定化效率。納米材料的研究提供了用于酶固定的高負(fù)載固定化材料，并且多功能固定化方法提高了酶的固定化效率。各種方法致力于提高固定效率，簡化固定步驟，降低固定化成本，但目前可廣泛應(yīng)用的固定策略和載體是有限的。一般而言，具有良好可操作性，簡單固定化步驟，低成本，各種酶的普遍應(yīng)用和催化環(huán)境的方法或固定化載體仍然是發(fā)展的主流。增材制造，通常稱為3D打印，是一種新興的自下而上的制造技術(shù)，有可能實現(xiàn)復(fù)雜幾何形狀的快速原型制作。它已廣泛應(yīng)用于工業(yè)設(shè)計，建筑，組織工程等領(lǐng)域。3D打印的主要優(yōu)點是能夠構(gòu)建復(fù)雜的結(jié)構(gòu)，尤其是具有復(fù)雜內(nèi)部結(jié)構(gòu)的封閉式外殼，多孔結(jié)構(gòu)和具有多個彎曲的通道。3D打印的另一個優(yōu)點是打印組件的形貌是可控的。只需修改基于計算機(jī)的技術(shù)圖紙，即可對其進(jìn)行全面修改或本地修改。復(fù)雜部件通常由幾個簡單的部件機(jī)械組裝而成。為了精確組裝，組件需要彼此特定且精確地對齊。傳統(tǒng)的加工方法不適合于創(chuàng)建這種集成的復(fù)雜結(jié)構(gòu)。除了更方便地實現(xiàn)某些復(fù)雜的3D幾何形狀的創(chuàng)建之外，3D打印還具有低成本和節(jié)省時間的優(yōu)點。工程技術(shù)的進(jìn)步和印刷設(shè)備的成本降低為3D打印提供了在實驗室環(huán)境中創(chuàng)建功能設(shè)備的機(jī)會。已經(jīng)使用諸如反應(yīng)器，組織工程支架和檢測器的3D打印件完成了許多工作。3D打印的組織支架允許細(xì)胞附著生長，如果打印的載體被修飾，則可以固定酶。目前，關(guān)于3D打印在固定化中的應(yīng)用的研究很少。因此，3D打印在酶固定化中的應(yīng)用具有良好的發(fā)展?jié)摿Α?.3.13D打印技術(shù)概況3D打印是一種增材制造（AM）技術(shù)，用于從三維（3D）模型數(shù)據(jù)制造各種結(jié)構(gòu)和復(fù)雜幾何形狀。該過程包括印刷彼此疊加形成的連續(xù)材料層。該技術(shù)由CharlesHull于1986年開發(fā)，稱為立體光刻（SLA），隨后又發(fā)展出粉末床熔合，熔融沉積成型（FDM），噴墨印刷和輪廓加工（CC）等方法。使3D制造系統(tǒng)適應(yīng)傳統(tǒng)技術(shù)的日益增長的共識歸功于幾個優(yōu)點，包括制造具有高精度的復(fù)雜幾何形狀，最大程度地節(jié)省材料，設(shè)計靈活性和個人定制。目前用于3D打印的各種材料包括金屬，聚合物，陶瓷和混凝土。聚乳酸（PLA）和丙烯腈丁二烯苯乙烯（ABS）是用于復(fù)合材料3D打印的主要聚合物。AM能夠制造從微觀到宏觀尺度的各種尺寸的零件。但是，印刷部件的精度取決于所采用方法的精確度和印刷規(guī)模。例如，微尺度3D打印對分辨率，表面光潔度和層粘合提出了挑戰(zhàn)，有時需要后處理技術(shù)，如燒結(jié)[5]。另一方面，可用于3D打印的材料有限，這對于在各行業(yè)中利用該技術(shù)帶來了挑戰(zhàn)。因此，需要開發(fā)可用于3D打印的合適材料，并需要進(jìn)一步的研究來增強(qiáng)3D打印部件的機(jī)械性能。3D打印的顯著優(yōu)點是大規(guī)模定制，即，生產(chǎn)一系列個性化商品，使得每個產(chǎn)品可以是不同的，同時由于大規(guī)模生產(chǎn)而保持低價格。由于模具制造和用于定制產(chǎn)品的工具，3D打印沒有增加的成本。因此，許多相同部件的批量生產(chǎn)可以與相同數(shù)量的不同個性化商品一樣具有成本效益。不同設(shè)計之間的變化很簡單，增加的成本可以忽略不計，無需特殊準(zhǔn)備。AM還具有大規(guī)模生產(chǎn)復(fù)雜幾何形狀（例如晶格結(jié)構(gòu)）的潛力，與傳統(tǒng)制造方法（例如鑄造）相比耗時更少并且不需要后處理。1.3.23D打印方法1.3.2.1熔融沉積模型在FDM方法中，熱塑性聚合物的連續(xù)長絲用于3D打印材料層（圖1a）。燈絲在噴嘴處被加熱以達(dá)到半液態(tài)，然后在平臺上或在先前印刷的層的頂部上擠出。聚合物長絲的熱塑性是該方法的基本性質(zhì)，其允許長絲在印刷期間熔合在一起，然后在印刷后在室溫下固化。長絲的層厚度，寬度和取向以及氣隙（在同一層或?qū)又g）是影響印刷部件機(jī)械性能的主要工藝參數(shù)[9]。發(fā)現(xiàn)層間失真是機(jī)械性能薄弱的主要原因[10]。低成本，高速度和簡單的過程是FDM的主要優(yōu)點。另一方面，弱機(jī)械性能，逐層外觀，表面質(zhì)量不高[11]和有限數(shù)量的熱塑性材料是FDM的主要缺點[9]。使用FDM開發(fā)纖維增強(qiáng)復(fù)合材料增強(qiáng)了3D打印部件的機(jī)械性能[12]。然而，纖維取向，纖維與基體之間的粘合和空隙形成是3D打印復(fù)合材料部件中出現(xiàn)的主要挑戰(zhàn)[12,13]。1.3.2.2粉末床熔合粉末床熔合工藝由非常細(xì)的粉末薄層組成，這些粉末在平臺上展開并緊密包裝。每層中的粉末用激光束或粘合劑熔合在一起。隨后的粉末層在先前的層上滾動并熔合在一起，直到最終的3D部件被構(gòu)建（圖1d）。然后通過真空除去過量的粉末，并且如果需要，進(jìn)行進(jìn)一步的處理和細(xì)化，例如涂覆，燒結(jié)或滲透。粉末尺寸分布和包裝決定了印刷部件的密度，是影響該方法效果的最關(guān)鍵因素[14]。激光只能用于低熔點/燒結(jié)溫度的粉末，否則應(yīng)使用液體粘合劑。選擇性激光燒結(jié)（SLS）可用于各種聚合物，金屬和合金粉末，而選擇性激光熔化（SLM）僅可用于某些金屬，如鋼和鋁。SLS中的激光掃描不會使粉末完全熔化，并且晶粒表面上升高的局部溫度導(dǎo)致粉末在分子水平上熔合。另一方面，在SLM中激光掃描后，粉末完全熔化并融合在一起，從而產(chǎn)生優(yōu)異的機(jī)械性能[15]。使用SLM對不同材料和應(yīng)用的詳細(xì)介紹可參見參考文獻(xiàn)。[16]。1.3.2.3噴墨打印與輪廓加工噴墨印刷是陶瓷增材制造的主要方法之一。它用于印刷復(fù)雜和先進(jìn)的陶瓷結(jié)構(gòu)，用于組織工程支架等應(yīng)用。在該方法中，穩(wěn)定的陶瓷懸浮液例如，將水中的氧化鋯粉末[17]泵送并通過注射噴嘴以液滴的形式沉積在基板上。然后液滴形成連續(xù)的圖案，該圖案固化到足夠的強(qiáng)度，以便保持隨后的印刷材料層（圖1b）。該方法快速有效，增加了設(shè)計和打印復(fù)雜結(jié)構(gòu)的靈活性。兩種主要類型的陶瓷油墨是蠟基油墨和液體懸浮液。將基于蠟的油墨熔化并沉積在冷的基底上以固化。另一方面，液體懸浮液通過液體蒸發(fā)固化。陶瓷的粒度分布，油墨的粘度和固體含量，以及擠出速率，噴嘴尺寸和印刷速度是決定噴墨印刷部件質(zhì)量的因素[18]。必需保持連續(xù)加工，粗糙分辨率和層之間缺乏粘合性是該方法的主要缺點。1.3.2.4立體光刻SLA是最早的增材制造方法之一，于1986年開發(fā)[20]。它使用UV光（或電子束）在樹脂或單體溶液層上引發(fā)鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。單體（主要是丙烯酸或環(huán)氧基）具有紫外線活性，并在活化后立即轉(zhuǎn)化為聚合物鏈（自由基化）。聚合后，樹脂層內(nèi)的圖案固化，以保持后續(xù)層（圖1c）。在印刷完成后除去未反應(yīng)的樹脂。對于一些印刷部件，可以使用諸如加熱或光固化的后處理，以實現(xiàn)期望的機(jī)械性能。陶瓷顆粒在單體中的分散體可用于印刷陶瓷-聚合物復(fù)合材料[18]或聚合物衍生的可陶瓷化的單體，例如碳氧化硅[21]。SLA以低至10μm的精細(xì)分辨率打印高質(zhì)量零件[13]。另一方面，它相對緩慢，昂貴并且用于印刷的材料范圍非常有限。而且，反應(yīng)動力學(xué)和固化過程是復(fù)雜的。光源的能量和曝光是控制每層厚度的主要因素[20]。SLA可以有效地用于復(fù)雜納米復(fù)合材料的增材制造[22]。1.3.33D打印材料聚合物被認(rèn)為是3D打印行業(yè)中最常見的材料，因為它們具有多樣性并易于采用不同的3D打印工藝。用于添加劑制造的聚合物以熱塑性長絲，反應(yīng)性單體，樹脂或粉末的形式存在。多年來，在許多工業(yè)應(yīng)用中，例如航空航天，建筑，玩具制造和醫(yī)療領(lǐng)域，已經(jīng)探索了使用聚合物和復(fù)合材料的3D打印的能力。使用3D打印制造復(fù)合材料的一些好處包括能夠高精度地定制幾何體。此外，該工藝比其他傳統(tǒng)的形成方法更具成本效益，例如定制產(chǎn)品的模塑和擠出。另一方面，由于固有的強(qiáng)度和功能缺乏，由3D打印機(jī)構(gòu)建的純聚合物產(chǎn)品通常僅用于概念原型。正在進(jìn)行旨在解決3D打印聚合物的較差機(jī)械性能的研究，這導(dǎo)致開發(fā)用于制造具有更好性能的先進(jìn)聚合物復(fù)合材料的各種方法和材料[13,87]。光聚合物樹脂在立體光刻3D打印中通過UV光活化時可聚合。根據(jù)WohlersAssociates進(jìn)行的年度行業(yè)調(diào)查，工業(yè)領(lǐng)域近50％的3D打印市場歸功于使用光聚合物生成的原型[88]。然而，光聚合物的熱機(jī)械性能仍應(yīng)得到改善。例如，由于UV暴露和強(qiáng)度的梯度，3D打印聚合物的分子結(jié)構(gòu)和排列取決于層的厚度[89,90]。另一方面，據(jù)報道，用于選擇性激光燒結(jié)（SLS）的塑料是3D打印的第二重要類別。在SLS聚合物中有聚苯乙烯，聚酰胺和熱塑性彈性體[88]。事實上，基于光聚合物的系統(tǒng)可以提供較薄的層厚度和打印精度。使用新樹脂的進(jìn)一步發(fā)展具有改善的強(qiáng)度和耐溫性。熱塑性聚合物（例如丙烯腈-丁二烯-苯乙烯共聚物（ABS）[91]，聚碳酸酯（PC）[92]和聚乳酸（PLA）[93]）可以通過各種3D印刷方法加工。雖然在低溫下保持最佳樹脂粘度是使用PLA的關(guān)鍵挑戰(zhàn)，但是兩種解決方案可以解決這個問題：1。在加工過程中提高溫度和2.使用合適的增塑劑。后一種解決方案更有利，因為它可以防止熱降解。基于PLA的復(fù)合材料共混物目前用于制造用于組織工程的3D打印支架。Senatov等人。[94]通過SEM成像證實在PLA基支架結(jié)構(gòu)內(nèi)存在互連孔，如圖2所示.LCD和生物活性CaP玻璃的組合被3D打印以開發(fā)用于各種組織的3D多孔生物相容支架工程應(yīng)用[95]。另外，聚合物多孔材料通過涉及使用化學(xué)或物理發(fā)泡劑的方法制造。制造這些細(xì)胞材料的另一種技術(shù)是3D打印，其中Abueidda等人。[96]研究了三個三次周期性最小表面（TPMS）的機(jī)械性能，以產(chǎn)生新的聚合物細(xì)胞材料。各種3D打印技術(shù)可用于制造聚合物和復(fù)合材料;立體光刻，SLS，F(xiàn)DM，3D生物印刷和噴墨印刷。FDM最常用于制造低熔點的聚合物復(fù)合材料和熱塑性塑料[13]。然而，具有良好物理性質(zhì)的環(huán)保型聚合物材料是FDM的主要關(guān)注點，因為用于3D打印的常見商業(yè)聚合物，例如ABS和PLA，不能滿足出口的需要。ABS具有良好的機(jī)械性能，但在加工過程中會產(chǎn)生令人不快的氣味，而PLA具有環(huán)保性，但機(jī)械性能較差[97]。Song等人的研究。[98]證明，與注塑成型的PLA相比，3D打印的PLA顯示出增強(qiáng)的機(jī)械性能，即彈塑性，正交各向異性行為，在壓縮和拉伸方面具有強(qiáng)大的不對稱性。嵌入PLA基體中的天然纖維增強(qiáng)材料的后張力也改善了機(jī)械性能[99]。纖維增強(qiáng)材料的添加可以增強(qiáng)聚合物的機(jī)械性能，是3D打印的一個很有前途的進(jìn)步[[100]，[101]，[102]]。最近，研究人員發(fā)現(xiàn)開發(fā)連續(xù)纖維增強(qiáng)材料以改善3D打印聚合物復(fù)合材料的機(jī)械性能具有挑戰(zhàn)性[12]。Tekinalp等人的一項研究。[103]強(qiáng)調(diào)了與3D打印纖維增強(qiáng)復(fù)合材料相關(guān)的挑戰(zhàn)，并評估了由碳纖維和ABS樹脂原料制成的復(fù)合材料部件的承載潛力。通過FDM和壓縮模塑（CM）制造的樣品導(dǎo)致強(qiáng)度和剛度的顯著增加。此外，CM樣品的較高強(qiáng)度表明纖維取向?qū)煨阅艿挠绊懶∮诳紫堵?。此外，CF與聚合物原料的混合物將導(dǎo)致強(qiáng)度和剛度增加，并減少最終3D打印部件的變形[104]。1.4主要研究內(nèi)容本研究的重點是3D打印在酶固定化和酶反應(yīng)器中的應(yīng)用。選擇青霉素G?；D(zhuǎn)移酶，蛋白酶，糖苷酶和脂肪酶作為模型酶，用于固液兩相系統(tǒng)，有機(jī)相反應(yīng)系統(tǒng)和高粘度反應(yīng)系統(tǒng)。印刷載體用食人魚溶液蝕刻，然后用過乙酸羥基化，用硅烷偶聯(lián)劑改性，最后用酶固定。該方法旨在建立一種具有可操作性強(qiáng)，固定步驟簡單，成本低，各種酶的普遍應(yīng)用或反應(yīng)條件的固定化方法。我們應(yīng)該拓寬3D打印的應(yīng)用范圍，為生物催化提供有前途的反應(yīng)器。C-PLA修飾與PGA的固定化2.1儀器和試劑見附錄一2.2實驗方法2.2.1PGAPX04的制備挑適量重組菌BL21-pET28a/pg