高效液相色譜法測定記憶缺失性貝毒軟骨藻酸

高效液相色譜法測定記憶缺失性貝毒軟骨藻酸

氨基乙醇是由有毒和有害的赤潮生物產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)的總稱，也被稱為赤潮生物毒素。貝類毒素不僅嚴(yán)重破壞海洋漁業(yè)資源和水產(chǎn)養(yǎng)殖,惡化海洋環(huán)境,還可以通過食物鏈的傳遞,危害人類健康,造成人體中毒甚至死亡。在世界范圍內(nèi),由赤潮毒素引起的人員中毒和死亡事件屢見不鮮。首次報(bào)道記憶缺失性貝類毒素事件是在1987年加拿大愛德華王子島發(fā)生因食用養(yǎng)殖紫貽貝而引起的食物中毒。隨后加拿大國立大西洋研究中心的QUILLIAM等從當(dāng)?shù)鼐用袷秤玫酿B(yǎng)殖貝類體內(nèi)分離出了一種被稱為軟骨藻酸(DomoicAcid,DA)的活性物質(zhì),確認(rèn)它為引起中毒的化學(xué)物質(zhì),并肯定該物質(zhì)來源于經(jīng)常在加拿大東海岸形成赤潮的一種硅藻。1996年,墨西哥Baja地區(qū),成百上千只海鳥因食用體內(nèi)富集高濃度DA的螃蟹、鳳尾魚、沙丁魚中毒死亡。1998年美國加利福尼亞州中部沿海發(fā)生400多頭海獅中毒死亡事件,存活的海獅中有神經(jīng)功能失調(diào)癥狀,從海獅的體液中檢測出了高濃度DA。由DA引起的中毒癥狀包括惡心、嘔吐、腹痛、腹瀉等,同時(shí)有昏眩、昏迷等類似神經(jīng)性中毒癥狀,一段時(shí)間內(nèi)喪失部分記憶是此類中毒的典型特征,因此這類毒素被稱為記憶缺失性貝類毒素。軟骨藻酸是記憶缺失性貝類毒素的最常見生物毒素,是由硅藻門Bacillariophyta、羽紋硅藻綱Pennatae、管殼縫目Aulonoraphidinals、菱形藻科Nitzschiaceae中的擬菱形藻屬Pseudo-nitzschia和菱形藻屬Nitzschia中硅藻的某些種產(chǎn)生的一種興奮性神經(jīng)毒素。軟骨藻酸是一種溶于水具有強(qiáng)烈神經(jīng)毒性、與紅藻酸(2-梭基-3-異丙稀基脯氨酸)相關(guān)的興奮性非蛋白氨基酸類物質(zhì)。軟骨藻酸是長鏈羽狀硅藻Nitzschiapseudodelicatissima的代謝物,熱穩(wěn)定,熔點(diǎn)為223~224℃。易溶于水、稀酸和堿溶液中,微溶于甲醇和乙醇,不溶于石油醚和苯,紫外光譜最大吸收波長為242nm。水中的貝類和魚類對DA有較強(qiáng)的耐受力,它們可以富集藻類產(chǎn)生的DA,再經(jīng)食物鏈的傳遞對所在地區(qū)的生態(tài)環(huán)境造成影響,人類食用被DA污染的海產(chǎn)品后即可引起中毒。1998年被英國作為貝類動物的常規(guī)檢測項(xiàng)目,規(guī)定DA<20mg/kg的貝類才可以食用。筆者根據(jù)軟骨藻酸貝類毒素的性質(zhì),建立一種快速簡便的高效液相色譜分析方法。1材料和方法1.1方法原理試樣中的記憶缺失性貝類毒素經(jīng)適當(dāng)甲醇水提取,經(jīng)過陰離子柱凈化,用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測;外標(biāo)法定量。1.2試劑和材料實(shí)驗(yàn)所用試劑應(yīng)無干擾峰,除另有特別說明外,所用試劑均為分析純,實(shí)驗(yàn)用水應(yīng)符合GB/T6682一級水的要求。1.2.1應(yīng)硫酸鹽及三應(yīng)硫酸鈉甲醇、乙腈,色譜純;三氟乙酸,優(yōu)級純;冰乙酸,鹽酸,氫氧化鈉,氨水,甲酸銨,乙酸銨,磷酸氫二鈉,磷酸二氫鈉,磷酸銨,磷酸氫二銨,庚烷磺酸鈉。標(biāo)準(zhǔn)品:軟骨藻酸(DA)購自加拿大海洋局,Lot#20071205。1.2.2微生物濾膜與均質(zhì)器高效液相色譜儀:配紫外-可見光檢測器(島津LC-20A);電子天平(梅特樂公司CP124S):感量0.0001g;離心機(jī)(西格瑪公司3-18K):10000r/min;微孔濾膜:0.45μm;組織均質(zhì)器(IKA公司T25BASIC);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(LABOROTA-4003);旋渦混合器(IKA公司MSI)。1.3柱凈化和清液制備取樣:用清水清洗外殼,開殼,清水淋洗除去泥沙等外來雜質(zhì),取可食用部分用作檢測,勻質(zhì)。提取:稱取試樣5.0g,于50mL離心管中,加入10mL甲醇水溶液,旋渦混勻,超聲波提取5min,以4000r/min離心5min,移取全部上清夜至50mL離心管中。柱凈化:取陰離子交換柱,依次用6mL甲醇,3mL水,3mL50%甲醇水溶液過柱活化,然后取提取液5.0mL,以1滴/s的速度過柱,再用1mL甲醇洗滌,棄去流出液,擠干,最后用2mL冰乙酸+甲醇(25+75)洗脫,收集洗脫液。45℃水浴,N2吹干。準(zhǔn)確移取1mL乙腈+水(1+9)溶解殘留物,轉(zhuǎn)移到5mL離心管,加入1mL正己烷萃取,靜置1min,棄上層液體,下層過0.45μm微孔濾膜,供高效液相色譜儀檢測。1.4流動相、檢測條件色譜柱:VenusilASBC8,4.6×250mm;流動相:乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸鈉;流速:1.0mL/min;檢測條件:紫外檢測器,檢測波長242nm;進(jìn)樣量:20μL;柱溫:室溫。1.5標(biāo)準(zhǔn)工作曲線測定以乙腈+水(1+9)稀釋標(biāo)準(zhǔn)儲備液分別配成為含軟骨藻酸0.1、1.0、2.5、10.0、25.0μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,按樣品處理柱凈化步驟進(jìn)行,高效液相色譜儀測定,得出標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。測量保留時(shí)間和峰面積,用峰面積和含量作圖,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。1.6軟骨藻酸殘留量樣品中軟骨藻酸的殘留量按下式計(jì)算。X/mg·kg-1為樣品中軟骨藻酸的殘留量;Ci/μg·mL-1為標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出試樣溶液中軟骨藻酸的濃度;V1/mL提取液總體積;V2/mL為凈化用提取液體積;V3/mL為洗脫液體積;m/g為樣品重量。2結(jié)果與討論2.1提取時(shí)間的選取設(shè)計(jì)超聲波提取時(shí)間分別為2、3、5、7、10min,經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)提取5min時(shí),提取接近完全,延長提取時(shí)間意義不大,故選取提取時(shí)間為5min。2.2柱凈化效率檢測(1)柱子類型:分別自行生產(chǎn)的I、II、III型陰離子交換柱,取適量提取液過柱凈化洗滌后,用2mL冰乙酸甲醇溶液洗脫;處理洗脫液后上高效液相色譜檢測,以檢驗(yàn)離子交換柱的凈化效率,結(jié)果見表1,I型陰離子交換柱凈化效果最佳。(2)柱pH:用氨水調(diào)節(jié)提取液pH為7、9、11、14,過柱后收集洗脫液上機(jī)檢測;結(jié)果表明:隨著pH的升高,柱子上保留的雜質(zhì)量也相應(yīng)升高,嚴(yán)重影響檢測。(3)過柱體積:設(shè)定過柱的提取液體積分別為3、5、8、10、15mL,過柱后收集洗脫液上機(jī)檢測;試驗(yàn)發(fā)現(xiàn):過柱提取液的體積過高或過低,都影響柱子的保留效率,體積過低及過高還會導(dǎo)致部分雜質(zhì)保留在柱體上,影響檢測結(jié)果。(4)洗脫液的體積:試驗(yàn)表明,2mL洗脫液基本能將柱子上吸附的目標(biāo)物質(zhì)完全洗脫下來,增加洗脫液的體積意義不大。2.3流動相的選擇配制了乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸鈉、0.1%三氟乙酸+乙腈+甲醇和0.1%三氟乙酸+乙腈+0.5%庚烷磺酸鈉溶液三種流動相,后2種峰形和分離度較差,因此采用乙腈+0.1%三氟乙酸+0.02%庚烷磺酸鈉作為實(shí)驗(yàn)的流動相。2.4軟骨藻酸保留時(shí)間和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差配成濃度為0.1、1.0、2.5、10.0、25.0μg/mL的軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液系列,進(jìn)樣20μL,軟骨藻酸的保留時(shí)間約為17.732min,測量峰面積,計(jì)算平均值,求得回歸方程Y=0.010975x+0.009456,r=0.9999,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為6.3%、4.8%、5.7%、3.9%、5.9%,平均為5.3%。2.5樣品處理及定量測定稱取兩批貝肉,在其中加入不同濃度的軟骨藻酸標(biāo)準(zhǔn)品。各稱取5.0g,按照1.3樣品處理中步驟進(jìn)行,高效液相色譜儀檢測定量。檢測4組不同添加濃度的貝肉,計(jì)算測定方法回收率、精密度和檢測下限,結(jié)果見表2。DA標(biāo)準(zhǔn)溶液、空白樣品、空白樣