塔瑪亞歷山大藻對(duì)鰓組織na

塔瑪亞歷山大藻對(duì)鰓組織na

0n-磺酰氨甲酰基類毒素中毒的爆發(fā)嚴(yán)重威脅了畜牧業(yè)。麻痹性苦毒（pm）是一個(gè)重要因素。在亞太地區(qū)，從1934年到1994年的赤潮對(duì)水產(chǎn)養(yǎng)殖的損害中，麻痹性苦毒事件占41.7%。這些事件主要是由p.bamaenevar.cov等甲藻引起的。大多數(shù)時(shí)間分布在塔馬利亞海岸。麻痹性貝毒是一類四氫嘌呤的衍生物.現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的毒素有20多種,根據(jù)R4基團(tuán)的不同可以分為4類,分別是氨基甲酸酯類毒素(Carbamatetoxin),包括石房蛤毒素(STX),新石房蛤毒素(neoSTX),膝溝藻毒素1-4(GTXI-4);N-磺酰氨甲?；惗舅?N-sulfcarbamoy1toxins),包括B1-2,C1-4;脫氨甲?；惗舅?decarbamoyltoxin),包括dcSTX,dcneoSTX,dcGTXI-4;脫氧脫氨甲?；惗舅?deoxydecarbamoy1toxins),包括doSTX,doGTX2,3,最近又在一種蟹Zosimusaeneus中檢出了石房蛤毒素和新石房蛤毒素的N-羥基衍生物(N-hydroxycarbamoylderivatives)hySTX和hyneoSTX,可能是一類新的麻痹性貝毒毒素.由于Na+,K+—ATP酶在低等、高等生物體內(nèi)普遍存在,具有廣泛的生態(tài)意義,在機(jī)體中起到至關(guān)重要的作用,并且是多種毒物攻擊的靶點(diǎn).因此在本次實(shí)驗(yàn)中采用檢測(cè)染毒生物體興奮性和分泌性組織中Na+,K+—ATP酶活力的方法,對(duì)塔瑪亞歷山大藻對(duì)該酶的影響及機(jī)理進(jìn)行研究.傳統(tǒng)的觀點(diǎn)認(rèn)為毒素對(duì)貝類本身沒(méi)有影響,貝類只是起中間媒介的作用.但80年代以后的研究表明,有毒藻能夠影響貝類,影響的大小與貝的種類以及以往是否接觸過(guò)有毒藻有關(guān).不同種的貝對(duì)有毒藻的反應(yīng)差別很大.從已有的實(shí)驗(yàn)看,赤潮密度下有毒藻可以使貝產(chǎn)生下述反應(yīng):1)是閉殼反應(yīng),尤其是沒(méi)有接觸過(guò)有毒藻的貝中閉殼反應(yīng)明顯;2)濾水率下降,這在一定程度上與貝的閉殼反應(yīng)有關(guān),但也有貝表現(xiàn)出濾水率增加或不變的現(xiàn)象;3)攝食的選擇性,大部分可以攝食有毒藻,但有的貝如沙海螂(Mya.arenaria)表現(xiàn)出攝食選擇現(xiàn)象,有毒藻只出現(xiàn)在假糞中;4)影響足絲分泌;5)耗氧率和心臟活動(dòng)受到影響.文獻(xiàn)對(duì)塔瑪亞歷山大藻對(duì)扇貝受精、胚胎發(fā)育及幼體變態(tài)等影響進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)該藻對(duì)受試生物存在明顯的抑制效應(yīng).但有關(guān)塔瑪亞歷山大藻對(duì)動(dòng)物組織中ATP酶的影響目前在國(guó)內(nèi)尚未見報(bào)道.為進(jìn)一步了解塔瑪亞歷山大藻的毒作用機(jī)制,筆者選用分布廣,數(shù)量多,有一定經(jīng)濟(jì)價(jià)值的菲律賓蛤仔(Ruditapesphilippinarum)、翡翠貽貝(PernaviridisLinnaeus),研究塔瑪亞歷山大藻體對(duì)這些動(dòng)物組織Na+,K+—ATP酶的影響.1材料和方法1.1na+、k+—原理Na+,K+—ATP酶是一組在細(xì)胞內(nèi)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和能量代謝過(guò)程中起重要作用的酶系統(tǒng).它從水解ATP分子中獲得能量,逆電化學(xué)梯度轉(zhuǎn)運(yùn)Na+和K+,也稱鈉泵.Na+,K+—ATP酶廣泛分布于各類細(xì)胞質(zhì)膜上,其活性在不同的組織內(nèi)差異很大,在興奮性和分泌性組織中酶活性很高.麻痹性貝毒的毒理機(jī)制是在分子層級(jí)上,阻斷鈉離子內(nèi)流,其對(duì)鈉離子通道具有特殊親和性.當(dāng)毒素與鈉離子通道結(jié)合后,將會(huì)使神經(jīng)傳導(dǎo)發(fā)生困難.使細(xì)胞不能提供正?；顒?dòng)所需要的能量,嚴(yán)重情況下,可導(dǎo)致生物死亡.Na+,K+—ATP酶將腺三磷(ATP)水解為腺二磷(ADP)和無(wú)機(jī)磷,在實(shí)驗(yàn)中以無(wú)機(jī)磷的釋放量來(lái)表示酶的活性.1.2非規(guī)劃性培養(yǎng)基塔瑪亞歷山大藻由本實(shí)驗(yàn)室培養(yǎng),培養(yǎng)條件為非無(wú)菌培養(yǎng),f/2培養(yǎng)基;溫度(20±0.5)℃;光照3000lx;光暗比為12∶12.實(shí)驗(yàn)用藻取自指數(shù)生長(zhǎng)期.1.3設(shè)備1)DU520型紫外分光光度計(jì);2)2DPR-52D型高速冷凍離心機(jī);3)玻璃勻漿器;4)電子天平;5)解剖工具.1.4實(shí)驗(yàn)方法1.4.1對(duì)不同浮液藻細(xì)胞的毒力將采回的菲律賓蛤仔在沙濾海水中暫養(yǎng)24h后,挑選大小均勻、足絲分泌正常的個(gè)體隨機(jī)分配到3個(gè)實(shí)驗(yàn)組中,每組放入8只蛤仔(殼長(zhǎng)為(3±0.56)cm)及1000mL沙濾海水.對(duì)照組水體僅為1000mL沙濾海水,實(shí)驗(yàn)組分別加入濃縮藻液,使其水中塔瑪亞歷山大藻細(xì)胞濃度分別為35000cell/mL和17500cell/mL.在不充氣,不換水下染毒48h后,解剖取樣.暫養(yǎng)后的翡翠貽貝被分在染毒組和對(duì)照組,每組放8只,對(duì)照組飼養(yǎng)在2000mL沙濾海水中,染毒組為2000mL沙濾海水加入濃縮藻液,使藻細(xì)胞密度為10000cell/mL,染毒48h后解剖取樣.1.4.2活性成分檢測(cè)由于菲律賓蛤仔個(gè)體組織較小,故取樣時(shí),將1組合為1個(gè)樣進(jìn)行測(cè)量,而貽貝則1貝為1個(gè)樣品.解剖出來(lái)的鰓及內(nèi)臟囊先稱重,每克樣品中加入4mL線粒體提取液,勻漿后以2750rad/min離心10min,以去除細(xì)胞碎片.上清液以11500rad/min的轉(zhuǎn)速離心20min,得線粒體沉淀,將線粒體沉淀物溶于1mL線粒體懸浮液中,置于-80℃低溫冰箱內(nèi)以供測(cè)定Na+,K+—ATP酶活力使用.1.4.3樣品中的蛋白質(zhì)含量測(cè)定1.4.4na-，k-kp酶活性測(cè)定2結(jié)果2.1兩組k+—菲律賓蛤仔的實(shí)驗(yàn)結(jié)果結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的菲律賓蛤仔鰓及內(nèi)臟囊Na+,K+—ATP酶的活性高,而17500cell/mL組酶活力又比35000cell/mL高.且組間差異顯著(P<0.5).見圖1.2.2兩組血清na+、k+—翡翠貽貝實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表1可見,染毒組翡翠貽貝鰓組織內(nèi)的Na+,K+—ATP酶平均活力為10.032±2.231,較對(duì)照組的6.449±2.272要強(qiáng),兩組個(gè)體間鰓組織Na+,K+—ATP酶活力差異顯著(P<0.5).3藻密度對(duì)金魚肝胰腺組織na+,k+—討論水中含有塔瑪亞歷山大藻使得菲律賓蛤仔鰓組織Na+,K+—ATP酶活性有所增高,但并不是隨著藻密度的增大而增大,在實(shí)驗(yàn)中可以看出藻密度在17500cell/mL時(shí)酶活力達(dá)到較高水平(2.112),在35000cell/mL時(shí)有所下降(2.073).而水中該藻密度為10000cell/mL時(shí)同樣明顯提高翡翠貽貝鰓組織Na+,K+—ATP酶活性(比對(duì)照組增加0.6倍).這說(shuō)明塔瑪亞歷山大藻活藻體可造成貝類鰓組織Na+,K+—ATP酶活性改變.而且,在較低的濃度下往往是增加酶活性,較高濃度下酶的活性反而下降.筆者認(rèn)為這是因?yàn)镻SP進(jìn)入動(dòng)物體與鈉離子通道結(jié)合,阻斷鈉離子內(nèi)流.而生物的應(yīng)激反應(yīng)促使酶超常活動(dòng)以抵消危害,因此使得Na+,K+—ATP酶的活力增加.生物體在這種不良環(huán)境下的這種應(yīng)激反應(yīng)在不少研究中已被證實(shí),如藻類在低濃度農(nóng)藥影響下會(huì)增加光合作用強(qiáng)度和分裂速度,但隨著農(nóng)藥濃度的加大,二者均被抑制而降低.當(dāng)然應(yīng)激反應(yīng)是有限的,如果外界影響超出機(jī)體的調(diào)節(jié)能力,則必然導(dǎo)致機(jī)體正常功能受損,因此,最終將表現(xiàn)出抑制效應(yīng).本實(shí)驗(yàn)也顯示隨著藻類密度的增加,塔瑪亞歷山大藻的毒性使得動(dòng)物Na+,K+—ATP酶受到抑制,活性轉(zhuǎn)而呈下降趨勢(shì).4排肝胰腺組織p酶活性的變化水中具有一定密度(