納米雄黃固體分散體的制備及體外溶出考察

納米雄黃固體分散體的制備及體外溶出考察

中藥雄黃的主要成分為as2s2和as4s4，以及少量as2o3和其他重金屬鹽。傳統(tǒng)醫(yī)學認為，雄黃具有解毒、除濕、祛痰、瘧疾等作用。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明,雄黃還具有抗腫瘤作用,大量文獻報道了中藥雄黃對惡性血液病、多發(fā)性骨髓瘤、宮頸癌及子宮頸癌前病變等的治療研究,其抗腫瘤機制包括誘導凋亡、抑制增殖、促進分化等。但雄黃的主要活性成分As2S2水溶性差,體內難以吸收,導致其生物利用度低、臨床使用量大,從而影響了治療效果。納米技術已經被運用于提高雄黃的療效,近年的研究表明,經納米化后,雄黃體現(xiàn)出更佳的抗腫瘤作用。同時,雄黃到達納米級后也帶來了其他需要解決的問題,粒徑減小,導致其比表面積增加,更加容易發(fā)生氧化反應形成As2O3從而帶來毒性;另外,納米雄黃粉極易發(fā)生團聚,限制了其臨床使用效果。本課題通過固體分散體技術來提高納米雄黃的抗氧化性,增加納米雄黃的穩(wěn)定性,降低其毒性的同時不影響其活性。1數(shù)碼顯微成像系統(tǒng)行星式球磨機(PM100型,德國Rersch);原子吸收分光光度計(990AFG,北京普析通用有限公司);紫外-可見分光光度計(UV765,上海精科);Sartorius天平(CP225D,德國);5804R臺式離心機(EPPENDORF,德國);NanoZS90Zetasizer粒徑/Zeta電位測定儀(Malvern,英國);RC-806溶出度儀(天津天大天發(fā)科技有限公司);X-射線衍射儀(Rigaku,日本);eclipse80i數(shù)碼顯微鏡(日本Nikon);DS-Ri1數(shù)碼成像系統(tǒng)(日本Nikon)。雄黃(湖南石門);砷標準溶液(用As2O3配制,國家標準物質中心);聚乙二醇6000(PEG6000,國藥集團化學試劑有限公司);泊洛沙姆188(F68,德國巴斯夫有限公司);其余試劑均為分析純。硫脲-抗壞血酸溶液:稱取硫脲、抗壞血酸各5g,用蒸餾水溶解并定容至100mL,配成50g·L-1的溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。硼氫化鉀溶液:稱取硼氫化鉀5g溶于20g·L-1氫氧化鉀溶液500mL中,配成10g·L-1的溶液,現(xiàn)用現(xiàn)配。稀鹽酸:取鹽酸234mL,加水稀釋至1000mL,即得。碘化鉀試液:取碘化鉀16.5g,加水使溶解成100mL,即得。本液應臨用前新鮮配制。酸性氯化亞錫試液:取氯化亞錫20g,加鹽酸使溶解成50mL,濾過,即得。本液配成后3個月即不適用。二乙基二硫代氨基甲酸銀試液:取二乙基二硫代氨基甲酸銀0.25g,加氯仿適量與三乙胺1.8mL,加氯仿至100mL,攪拌使溶解,放置過夜,用脫脂棉濾過,即得。本液應置棕色玻璃瓶內,密塞,置陰涼處保存。標準砷溶液:準確稱取As2O30.132g,置1000mL量瓶中,加20%氫氧化鈉溶液5mL溶解后,用適量的稀鹽酸中和,再加稀鹽酸10mL,用水稀釋至刻度,搖勻,作為貯備液。臨用前,精密量取貯備液10mL,用水稀釋至刻度,搖勻,即得(每1mL相當于1μg的As)。上述試劑均購于國藥集團化學試劑有限公司。2方法2.1as2o3分析的建立采用2010年版《中國藥典》砷鹽檢查法測定中的二乙基二硫代氨基甲酸銀法。2.1.1ddc-ag-l-1標準曲線精密量取As2O3標準溶液1,5,10,15,20mL(相當于1,5,10,15,20μg的As)分別放入100mL標準磨口錐形瓶中,加鹽酸5mL與水21mL,再加碘化鉀試液5mL與酸性氯化亞錫試液5滴,在室溫放至10min后,加鋅粒2g,立即安上裝有醋酸鉛棉導氣管的瓶塞,導管通入盛有5mLDDC-Ag液的吸收管中,反應45min,取出,用氯仿補至5mL,混勻,置lcm吸收池中以二乙基二硫代氨基甲酸銀液為空白,用分光光度計在510nm處測定吸光度,以吸光度(Y)對質量濃度(X,mg·L-1)進行線性回歸,求得標準曲線方程Y=0.0128X+0.0026(r=0.9986),線性范圍0.0~20.0mg·L-1。2.1.2稀鹽酸溶液破碎精密稱定樣品粉末0.2g,加稀鹽酸20mL,攪拌30min,濾過,殘渣用稀鹽酸洗滌2次,每次10mL,攪拌10min。洗液與濾液合并,置100mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,精密量取2mL,其余操作同As2O3標準溶液。2.2as2s2分析采用氫化物原子吸收分光光度法測定。2.2.1燃燒高度及位置測定波長193.7nm;光譜帶寬0.4nm;負高壓535V;燈電流6mA;燈元素As;燃氣流量200mL·min-1;燃燒器高度10mm;燃燒器位置3mm;載流0.9%鹽酸。2.2.2標準曲線的制備2.3黃納米材料和性能2.3.1球磨法制備納米雄黃按文獻報道方法,采用高能球磨機濕磨法制備納米雄黃。將塊狀雄黃粉碎過篩,得粗顆粒,按球料比40∶1投入至球磨罐中,加入飽和十二烷基硫酸鈉溶液(SDS)10mL作為球磨介質,球磨轉速400r·min-1,正轉30min,停3min,反轉30min,球磨12h取出得到納米雄黃。2.3.2研缽加標研磨法采取水飛法對納米雄黃進行炮制去毒。取10g納米雄黃置研缽中,加蒸餾水5mL,研磨5min呈糊狀,再加蒸餾水100mL攪拌1min,靜置2min,傾取混懸液,下沉的粗粉繼續(xù)研磨,如此反復操作11次,最后用剩余水沖洗研缽,合并各次混懸液,靜置24h,傾去上清液,抽濾即可。2.3.3醇中ma基于ma基于mavern粒徑的檢測取少量納米雄黃,超聲分散于適量乙二醇中,利用Malvern粒徑測定儀測定其粒徑;另取少量納米雄黃分散于去離子水中進行Zeta的測定。2.3.4透射電鏡觀察利用透射電鏡對納米雄黃的外觀形態(tài)進行觀察。納米雄黃經適量蒸餾水稀釋后,取適量滴加至銅網上,自然干燥約10min,放至透射電鏡下進行觀察。2.4樣品的制備2.4.1納米雄黃固體分散體的制備采用熔融法制備納米雄黃固體分散體。按設計比例(質量比1∶5)稱取經炮制的納米雄黃粉和載體材料(PEG6000,F68),先將載體材料置蒸發(fā)皿中,水浴加熱至一定溫度熔化后,投入納米雄黃粉,高剪切攪拌一定時間,迅速將樣品轉移至冰浴冷卻,于真空干燥箱內干燥過夜,粉碎后過80目篩,得到納米雄黃固體分散體,最后放入干燥器中室溫陳化48h備用。2.4.2物理混合物的制備將納米雄黃與載體材料PEG6000,F68分別按質量比1∶5于研缽中研細,混勻后過80篩,即得,備用。2.5固體分散體的識別2.5.1x-射線衍射分析將納米雄黃,PEG6000,F68,物理混合物及固體分散體進行X-射線衍射分析。輻射源Cu-Ka;掃描范圍2θ2°~50°;掃描速度5°·min-1。2.5.2物理混合物及固體分散體的光學顯微觀察將納米雄黃,PEG6000,F68,物理混合物及固體分散體用甘油分散于載玻片上,蓋上蓋玻片后,置于光學顯微鏡下(物鏡40倍,目鏡10倍)觀察。2.6穩(wěn)定性研究2.6.1納米雄黃粒度穩(wěn)定將制備的納米雄黃室溫下避光存放于干燥器中,于第1,2,3,10天分別取樣,測定其粒徑。2.6.2穩(wěn)定性測定:1.2o3不同水將雄黃粗粉、納米雄黃、納米雄黃的PEG6000固體分散體(質量比1∶5)、納米雄黃的F68固體分散體(質量比1∶5)室溫下存放至干燥器中(不避光),于第7天取樣,按2.1.2項下條件測定As2O3含量。2.7外溶2.7.1溶出介質的選擇分別精密稱取雄黃粗粉和納米雄黃各1g,納米雄黃的PEG6000固體分散體(質量比1∶5)和納米雄黃的F68固體分散體(質量比1∶5)適量(均含納米雄黃1g),分別置于往復式水浴恒溫振蕩器中,加人工胃酸溶液60mL作為溶出介質,(37±0.5)℃水浴震蕩36h后,取樣10mL,離心取上清液用0.45μm濾膜過濾,精密量取100μL置10mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,按2.2.1項下條件測定As2S2含量并計算其砷溶出量。2.7.2溶出介質中as2s2參考文獻方法對各組雄黃的砷溶出速度進行考察。精密稱取雄黃粗粉和納米雄黃各3g,納米雄黃的PEG6000固體分散體(質量比1∶5)和納米雄黃的F68固體分散體(質量比1∶5)適量(均含納米雄黃3g),分別置于溶出試驗儀中,加人工胃酸180mL作為溶出介質,采用小杯法,(37±0.5)℃,攪拌轉速120r·min-1,分別于5,10,15,20,30,40,50,60,80min抽取樣品液2mL,并補加同溫空白介質2mL,樣品離心后取上清液用0.45μm濾膜濾過,精密量取100μL置10mL量瓶中,加水至刻度,搖勻,按2.2.1項下條件測定As2S2含量并繪制溶出曲線。3結果3.1超聲分散在測定粒徑時為了起到更好的分散效果,本研究將納米雄黃超聲分散于適量乙二醇中。結果見圖1,納米雄黃的平均粒徑為(85.4±3.5)nm,Zeta電位為(-34.3±1.7)mV,表明納米雄黃粒子表面帶負電。3.2研究納米雄黃形態(tài)納米雄黃的透射電鏡(TEM)觀察結果見圖2。納米雄黃近球型,分布均勻。3.3體體晶體有微觀晶峰XRD試驗結果見圖3,納米雄黃的結晶衍射峰明顯,2種物理混合物亦出現(xiàn)微弱衍射峰,固體分散體的結晶衍射峰均消失或減弱,峰形和載體基本一致,提示在形成固體分散體以后,由于載體對藥物的抑晶作用,使藥物以無定形狀態(tài)高度分散在載體材料中,還有一小部分可能是以微晶狀態(tài)存在。3.4peg關注納米雄黃與載體材料的混合顯微觀察結果見圖4,納米雄黃為棕黃色微晶,PEG6000為不規(guī)則形狀的結晶粉末,F68為球狀或不規(guī)則顆粒,在PEG6000及F68與納米雄黃的物理混合物中分別見到納米雄黃與載體材料只是簡單混合,未發(fā)生變化。納米雄黃固體分散體均為干燥后研碎獲得的粉末,因此呈現(xiàn)不規(guī)則的塊狀,在光學顯微鏡下可以清楚地看到納米雄黃的棕黃色微晶分散在無色透明的載體當中,納米雄黃與載體材料均勻地融合在一起,納米雄黃可能以無定形式分散于載體材料中。3.5納米雄黃的粒徑納米雄黃粒徑穩(wěn)定性考察結果表明,隨著時間的推移,納米雄黃粒徑有逐漸增大的趨勢,10d后平均粒徑(218.5±4.2)nm,已達到原來的2倍以上,證明納米雄黃在儲藏過程中具有團聚現(xiàn)象。3.6納米雄黃固體分散體中as2o3含量的測定各組雄黃As2O3含量穩(wěn)定性結果見表1,結果表明納米雄黃中As2O3含量在7d內較其他3組明顯增加,納米雄黃固體分散體中As2O3的含量在7d內與納米雄黃組和雄黃粗粉組相比較為穩(wěn)定。證明雄黃納米化后容易發(fā)生氧化現(xiàn)象,通過固體分散體技術將納米雄黃包裹后可以避免納米雄黃直接暴露于空氣和光照中,從而起到增加穩(wěn)定性的作用,而用F68制備的固體分散體能更好地提高納米雄黃的抗氧化性,增加納米雄黃的穩(wěn)定性。3.7雄黃納米化前后砷溶出量的變化雄黃粗粉、納米雄黃和納米雄黃固體分散體中As2S2溶出量的結果見表2,結果表明將雄黃納米化后砷溶出量可達常規(guī)雄黃粗粉中砷溶出量的7.7倍,納米雄黃的PEG6000,F68固體分散體中砷溶出量顯著增加,納米雄黃的F68固體分散體的砷溶出量增加更為明顯。3.8不同固體分散體對納米雄黃砷溶出量的影響雄黃粗粉、納米雄黃及其固體分散體中As2S2溶出曲線見圖5。雄黃粗粉中As2S2的溶出速度較慢,20min前幾乎沒有溶出,80min累積溶出量勉強達到0.1mg·g-1。與雄黃粗粉相比,納米雄黃中As2S2的溶出速度較快,10min時溶出量即超過0.1mg·g-1,80min累積溶出量為雄黃粗粉的9.4倍。而2種固體分散體均可大大提高納米雄黃的砷溶出量,F68固體分散體的效果更好,在80min時PEG固體分散體和F68固體分散體的砷溶出量分別達到4.347,7.354mg·g-1,是納米雄黃的5.0,8.5倍,表明固體分散體可以顯著提高納米雄黃的砷溶出量;而在5min時2種固體分散體的砷溶出量已達0.371,0.594mg·g-1,分別是納米雄黃的4.3,6.9倍,表明本試驗制備的固體分散體不僅提高了納米雄黃的砷溶出量,還提高了初期的溶出速度,證明固體分散技術確是提高難溶性藥物溶出度的有效手段。4納米雄黃體外溶出條件的確定目前,國內有很多專家開展了納米雄黃的研究。通過納米化,可改善雄黃的溶出性能,提高其生物利用度,從而增加其臨床療效。但是對于納米雄黃的研究過程中忽略了2個比較重要的方面:在球磨的過程中,機械力傳輸了大量的動能給納米雄黃,導致納米雄黃具有二次團聚的可能;雄黃被納米化后理化性質發(fā)生改變,尤其是粒徑大幅減小,暴露于空氣或光照中的雄黃粒子表面積會明顯增加,這就會導致雄黃主要成分As2S2容易氧化成As2O3