粉防己堿的生物活性及對肝纖維化及腸易激綜合征的影響

粉防己堿的生物活性及對肝纖維化及腸易激綜合征的影響

防止承認堿是千金藤科植物防止秘密行為的主要活性成分，化學結(jié)構(gòu)屬于異羥色胺類化合物。近年來,國內(nèi)外對其藥理作用機制進行了較為廣泛的研究。資料表明,Tet具有多種生物學效應,在治療纖維化、門靜脈和肺動脈高壓,免疫機能調(diào)節(jié)及腫瘤防治等方面具有很好的應用前景。1基本藥物機制1.1tet的調(diào)節(jié)作用Ca2+信號傳導異常,細胞漿Ca2+濃度升高是多種疾病的病理生理基礎。Tet通過抑制細胞外Ca2+內(nèi)流,干預細胞內(nèi)Ca2+分布,維持細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài),從而阻斷有關(guān)病理過程。利用膜片鉗記錄技術(shù)表明Tet可劑量和時間依賴性地阻滯嗜鉻細胞膜電壓依賴性Ca2+通道,較高濃度Tet(1×10-4mol·L-1)可抑制誘生肌醇三磷酸(inositoltrisphosphate,IP3)藥物引起的大鼠嗜鉻細胞瘤PC12細胞內(nèi)Ca2+動員;而在較低濃度時(1×10-5mol·L-1)即可阻滯高濃度K+(3×10-2mol·L-1)誘導的細胞漿Ca2+濃度持續(xù)性升高和部分抑制緩激肽誘導的細胞漿Ca2+升高。我們研究結(jié)果表明Tet在阻斷肝細胞外Ca2+內(nèi)流的同時,還可促進線粒體對Ca2+的攝取、抑制線粒體Ca2+動員;但在維持肝細胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)過程中,阻斷Ca2+內(nèi)流起著主要作用。Tet對于靜止期神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞漿內(nèi)Ca2+濃度無明顯影響,但可劑量和時間依賴性地抑制毒胡蘿卜素(bombesin)及鈴蟾肽(thapsigargin,TG)導致IP3積聚和細胞內(nèi)Ca2+動員,降低Ca2+濃度升高峰值和持續(xù)時間。Bickmeyer等研究發(fā)現(xiàn)5×10-2mol·L-1KCl處理1min可使神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系108-15細胞內(nèi)Ca2+濃度一過性升高,1×10-4mol·L-1Tet預處理7min后再給予同樣濃度的K+以去極化,Ca2+內(nèi)流則被阻斷。緩激肽可通過激活第二信使IP3誘導細胞內(nèi)儲存Ca2+釋放,1×10-4mol·L-1Tet預處理7min可顯著下調(diào)NG108-15細胞對緩激肽的反應,Tet還能夠顯著抑制血管緊張素Ⅱ誘導細胞內(nèi)IP3生成及Ca2+釋放,提示Tet除阻滯細胞膜電壓門控通道介導的Ca2+內(nèi)流外,還可通過阻滯受體門控通道干預細胞內(nèi)Ca2+分布。1×10-4mol·L-1Tet能夠阻滯毒胡蘿卜素誘導NIH/3T3纖維母細胞和腮腺腺泡細胞Ca2+內(nèi)流,但不能抑制抗CD3抗體OKT3或TG誘導白血病T細胞Ca2+內(nèi)流;能夠阻斷HL-60細胞非電壓門控Ca2+通道的激活,但可誘導細胞內(nèi)Ca2+動員。Xuan等用熒光指示劑Fura-2/AM觀察到谷氨酸鹽、血清素及組織胺可劑量依賴性的誘導視網(wǎng)膜細胞外Ca2+內(nèi)流,3×10-5mol·L-1Tet可使上述3種物質(zhì)誘導Ca2+內(nèi)流分別減少28%、46.8%和29%;但在無Ca2+培養(yǎng)液中,Tet不能阻滯血清素和組織胺誘導的視網(wǎng)膜細胞內(nèi)Ca2+升高,結(jié)果說明Tet可通過N-甲酰D-門冬氨酸、血清素及組織胺(H1)受體調(diào)控的Ca2+通道阻滯Ca2+內(nèi)流,但對視網(wǎng)膜細胞內(nèi)Ca2+釋放無明顯影響。由此可見,Tet對不同組織類型細胞Ca2+通道阻滯的作用機制不同,可分別或同時阻滯電壓門控通道和受體門控通道,且可激發(fā)某些腫瘤細胞內(nèi)Ca2+動員,升高細胞內(nèi)Ca2+濃度。1.2小鼠骨髓中nf-b的表達臨床上,植物粉防己常被用于治療類風濕關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病,其主要生物活性成分Tet具有很強的免疫調(diào)節(jié)功能。研究表明Tet通過下調(diào)T細胞蛋白激酶C信號轉(zhuǎn)導通路,抑制T細胞增殖,減少IL-2的分泌及下調(diào)T細胞激活抗原CD71的表達,這一作用與Ca2+通道阻滯無關(guān)。Shen等發(fā)現(xiàn)10-7～10-5mol·L-1Tet可顯著抑制N-甲酰基蛋氨酰亮氨酰苯丙氨酸(N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanine)、氟波醇豆蔻酸鹽乙酸酯(phorbol-myristate-acetate,PMA)誘導嗜中性白細胞巨噬細胞趨化蛋白-1表達上調(diào)、自由基聚集及對纖維蛋白原粘附。10-7～10-4mol·L-1Tet可劑量和時間依賴性地引起小鼠腹腔巨噬細胞、豚鼠肺巨噬細胞和小鼠巨噬細胞樣細胞系J774細胞活性喪失;能夠抑制巨噬細胞呼吸爆發(fā),減少氧自由基的生成,下調(diào)多種炎性細胞因子的合成與釋放。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的激活與致炎因子的表達呈正相關(guān)。Tet可劑量依賴性抑制內(nèi)毒素、PMA及二氧化硅誘導肺泡巨噬細胞NF-κB的激活及NF-κB依賴報告基因(reportergene)的表達,但對核轉(zhuǎn)錄因子Sp-1的DNA結(jié)合活性及Sp-1依賴報告基因的表達無影響,這一作用與抑制IκB降解的某些信號轉(zhuǎn)導通路、清除羥自由基有關(guān)。1.3tet的誘導Lai等發(fā)現(xiàn)Tet時間和劑量依賴性抑制人白血病細胞系U937增殖及細胞克隆形成,其最適濃度為2.5×10-6mol·L-1。光鏡下可見細胞形態(tài)具有凋亡特征,凝膠電泳見DNA梯形條帶,同時流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)U937細胞具有磷脂酰絲氨酸外翻。結(jié)果提示Tet可通過非Ca2+依賴途徑誘導U937細胞凋亡。Tet可劑量依賴性地抑制人白血病HL-60細胞增殖。鏡下見細胞膜皺縮,凋亡小體形成;凝膠電泳可見清晰的DNA梯形條帶。Tet處理BM13674細胞8h后即可見細胞凋亡形態(tài)特征和典型DNA梯形條帶形成,作用較糖皮質(zhì)激素更加迅速?？杀涣字岷铣擅敢种苿锼?okadaicacid)所阻斷;表明其作用機制可能為轉(zhuǎn)錄后蛋白質(zhì)修飾。1.4tet的糖活腫瘤細胞MDR是影響癌癥化學治療效果的關(guān)鍵所在,其主要機制之一是細胞膜P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)過度表達。P-gp是一種細胞膜轉(zhuǎn)運蛋白,可把抗癌藥物泵出腫瘤細胞,降低細胞內(nèi)藥物濃度;最終導致抗腫瘤藥物的細胞毒性下降。研究表明非細胞毒濃度的Tet可以增加阿霉素(doxorubicin,Dox)對三尖杉酯(harringtonine)耐受HL-60細胞生長的抑制,集落形成抑制率增加300倍,阻滯于G2M期的細胞比率增多,細胞內(nèi)Dox聚集增加;但Tet不能增加Dox敏感HL-60的細胞毒性。Choi等發(fā)現(xiàn)3×10-6mol·L-1Tet可使paclitaxel對P-gp陽性HCT15細胞的半數(shù)抑制濃度下降3100倍,Dox的半數(shù)抑制濃度下降36倍;但對P-gp陰性的SK-OV-3細胞,Tet不能增加上述藥物的細胞毒性。上述資料提示Tet可通過調(diào)節(jié)P-gp增強MDR相關(guān)性藥物的細胞毒性。此外,Tet還可抑制血小板聚集及釋放血小板因子,抑制血栓素TXB2的形成及磷脂酶A2激活,從而減少血栓的形成;阻斷血小板衍生生長因子(platelet-derivedgrowthfactor,PDGF)促細胞增殖,抑制DNA合成,同時可使抑癌基因p53的表達增強,可能是一種誘導分化劑。2預防和控制dea的疾病2.1tet的表達Chen等觀察了Tet對四氯化碳(carbontetrachloride,CCl4)致肝細胞損傷的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn),與對照組相比,1×10-9～1×10-6mol·L-1Tet可使肝細胞膜的流動性增加71%～89%,乳酸脫氫酶釋放和丙二醛(malondialdehyde,MDA)形成顯著減少;細胞內(nèi)Ca2+濃度降低,提示Tet可能通過阻斷Ca2+內(nèi)流、清除自由基達到保護肝細胞作用。給予大鼠硫唑嘌呤(azathioprine,Aza)25mg·kg-1·d-1,靜脈注射2wk,可使血清轉(zhuǎn)氨酶(alanineaminotransferase,ALT)、堿性磷酸酶(alkalinephospahatase,AKP)、MDA顯著增高;還原型谷光甘肽(reductiveglutathione,GSH)、超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)降低;肝組織病理變化顯著。在給予Aza同時給予Tet30mg·kg-1·d-1,治療組動物血清ALT、AKP、MDA、GSH、SOD與正常對照組無明顯差異,病理組織學變化輕微。我們采用流式細胞技術(shù)觀察1×10-5～6×10-5mol·L-1Tet對大鼠肝細胞生長的影響,結(jié)果表明Tet呈濃度依賴性促進G1期向S期轉(zhuǎn)化,S期DNA含量及G1、G2期細胞蛋白質(zhì)含量顯著增加;不同濃度的Ca2+及ATP可促進或抑制肝細胞生長,加入外源性Ca2+及ATP對Tet促肝細胞增值無顯著影響,提示Tet促進肝細胞增殖作用與阻斷Ca2+內(nèi)流無關(guān)。2.2肝組織病理學檢測Tet能夠顯著減輕CCl4誘導大鼠實驗性肝纖維化程度,降低纖維化大鼠血清ALT、透明質(zhì)酸(hyaluronicacid,HA)、Ⅲ型前膠原(procollagenⅢpeptide,PⅢP)含量,改善肝功能,減輕肝病理損害程度,抑制肝細胞外基質(zhì)(extracellularmatrix,ECM)形成,膠原沉積減少。Tet治療組大鼠肝組織中星狀細胞(hepaticstellatecell,HSC)的增殖、轉(zhuǎn)化下調(diào),結(jié)蛋白陽性細胞數(shù)減少,圖像分析表明單位面積肝組織膠原沉積比例明顯低于模型組,效果與陽性對照藥物秋水仙堿相似。HSC為寄居于肝竇Diss間隙的間質(zhì)細胞。生理條件下,HSC處于相對靜止狀態(tài),其主要功能是維持ECM動態(tài)平衡和貯存維生素A。病理狀態(tài)下,多種因素(尤其是各種細胞因子)誘導HSC激活、增殖、轉(zhuǎn)化為肌成纖維樣細胞,合成和分泌大量膠原,ECM的成分和數(shù)量發(fā)生改變。此病理過程是肝纖維化發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵。體外研究表明Tet可顯著抑制常規(guī)培養(yǎng)HSC的激活,減少DNA及膠原合成,下調(diào)Ⅰ型及Ⅲ型膠原mRNA表達;阻斷PDGF促HSC增殖及膠原合成作用;減少HSC激活過程中PDGF、PDGF受體β(PDGF-Rβ)及轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforminggrowthfactor,TGFβ1)的自分泌;下調(diào)PDGF、PDGF-Rβ、TGFβ1及平滑肌肌動蛋白(α-smoothmuscleactin,α-SMA)的mRNA表達水平,提示Tet可能通過阻滯細胞外Ca2+內(nèi)流、抑制脂質(zhì)過氧化、干預細胞因子表達及減輕炎癥反應等途徑阻斷肝纖維化的發(fā)生發(fā)展。臨床研究顯示肝硬化患者口服Tet3mon后,靜脈色氨酸耐量實驗明顯改善;服藥6～18mon后,血清PⅢP、HA含量顯著下降;肝、腎功能不同程度得以改善;肝組織穿刺活檢發(fā)現(xiàn)治療前后患者肝組織炎性細胞浸潤明顯減輕或消失,膠原纖維沉積減少,Ⅰ型及Ⅲ型膠原含量顯著下降,療效明顯優(yōu)于肝泰樂治療組,提示具有一定的臨床應用前景。2.3tet的應用門靜脈高壓是各種原因所致肝硬化的主要臨床表現(xiàn),由此導致上消化道出血等并發(fā)癥而常為肝硬化患者的主要死亡原因。給予實驗性肝硬化大鼠分別靜脈注射Tet2.0、6.0、20mg·kg-1·d-1,發(fā)現(xiàn)Tet可劑量依賴性降低門靜脈壓力和門靜脈血流量、平均動脈壓及外周阻力。Huang等給予門靜脈部分結(jié)扎致門靜脈高壓模型大鼠20mg·d-1灌胃,每日2次,連續(xù)8d,能夠顯著減低門靜脈壓力,同時能夠降低正常大鼠的平均動脈壓和外周阻力,但對腹腔臟器及腎臟血流動力學無明顯影響。我們臨床研究表明Tet能夠顯著減低肝硬化患者門靜脈壓力,減少門靜脈血流量,降低食管曲張靜脈壓力;連續(xù)用藥患者2年內(nèi)無再次出血率達87.6%,療效顯著顯著優(yōu)于安慰劑、硝苯地平及維拉帕米。對628例肝硬化并發(fā)食管曲張靜脈破裂出血患者隨訪1～9年,發(fā)現(xiàn)口服Tet加硬化劑注射組較單純硬化劑注射組的曲張靜脈閉塞率高,再出血發(fā)生率及死亡率降低。Tet減低門靜脈壓力可能與阻滯血管平滑肌細胞電壓依賴性及受體依賴性Ca2+內(nèi)流和細胞內(nèi)Ca2+動員,擴張外周血管,減少回心血量有關(guān)。Tet在降低肝硬化大鼠門靜脈壓力的同時,還可明顯增加胃粘膜前列腺素E2的含量,改善胃粘膜的屏障功能,對門脈高壓性胃病具有防治作用。3tet的應用肺纖維化及肺動脈高壓是多種慢性肺部炎癥病變的最終轉(zhuǎn)歸。1×10-7～1×10-4mol·L-1Tet可劑量和時間依賴性抑制內(nèi)毒素及干擾素-γ誘導肺泡巨噬細胞環(huán)氧化酶-2(cyclo-ocygenase,COX-2)和誘生型一氧化氮合酶(induciblenitricoxidesynthase,iNOS)產(chǎn)生和促炎因子釋放。顯著抑制人血清或血清加PDGF、表皮生長因子及TNF誘導體外培養(yǎng)肺成纖維母細胞增殖,下調(diào)3H標記胸腺嘧啶3H-TdRDNA參入,減少膠原合成。Tet可降低石英塵吸入大鼠的全肺干重,Ⅰ型及Ⅲ型膠原含量顯著低于模型組,還使其mRNA水平下調(diào),提示Tet可在轉(zhuǎn)錄水平抑制膠原合成;Tet單獨或與羥基磷酸哌喹聯(lián)合應用治療矽肺,患者呼吸系統(tǒng)癥狀緩解率為55.7%～66.0%,X線胸片好轉(zhuǎn)率為3.3%～13.3%,療效明顯高于肺灌洗及安慰劑組。Tet50、100、150mg·kg-1·d-1灌胃3wk,可劑量依賴性降低實驗性炎性肺動脈高壓大鼠肺動脈壓力及右心指數(shù),對全身動脈壓無明顯影響;用Verhoff膠原染色和計算機圖象分析系統(tǒng)進行組織學檢查發(fā)現(xiàn)100mg·kg-1·d-1Tet可顯著降低纖維間隔厚度和面積,可使肺動脈高壓大鼠肺腺泡內(nèi)動脈中膜厚度、中膜厚度占血管外徑百分比、肌型動脈數(shù)及部分肌型動脈數(shù)分別減少16.4%、30.5%、24.3%和16.4%,并使無肌型動脈數(shù)增加24.7%,肺腺泡動脈內(nèi)