登革熱病毒檢測方法的研究進(jìn)展

登革熱病毒檢測方法的研究進(jìn)展

綠色植物是由登甲病毒（daguevius，dv）引起的一套害蟲傳播性傳染病。傳播媒體主要是埃及寄生蟲。病毒感染后可發(fā)生登革熱、登革出血熱、登革休克綜合征。DV引起的感染廣泛流行于全球熱帶和亞熱帶地區(qū),特別是東南亞、西太平洋、中南美洲和非洲的100多個國家和地區(qū)。世界衛(wèi)生組織估計(jì),全世界25億人受到登革熱的威脅,每年約有500~1000萬人感染DV,25~50萬人的DHF病例,2.4萬人死亡,登革熱已成為全球范圍內(nèi)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,此外,登革熱病毒還是重要的生物戰(zhàn)劑。登革熱的臨床癥狀與許多病毒性、細(xì)菌性和寄生蟲感染疾病在臨床上難以區(qū)別。因此,建立快速、簡便、特異的登革病毒實(shí)驗(yàn)室檢測方法對及時進(jìn)行臨床救治、流行病學(xué)調(diào)查和生物戰(zhàn)劑的快速檢測,最終控制其傳播流行具有重要意義。1提高檢測敏感性和減少檢測需要盡管病毒的RT-PCR快速檢測方法逐漸取代傳統(tǒng)方法,但病毒的細(xì)胞培養(yǎng)和蚊蟲分離依然是病毒鑒定的金牌標(biāo)準(zhǔn)。由于應(yīng)用間接免疫熒光或特異性單克隆抗體鑒定分離的病毒敏感性低、時間長。如果將RT-PCR檢測方法和細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)合起來,不僅可以提高檢測的敏感性,也可以減少檢測需要的時間。以104接種細(xì)胞培養(yǎng),結(jié)合RT-PCR方法可以在1d內(nèi)得到檢測結(jié)果,而間接免疫熒光檢測則需要4d時間。登革熱病毒的分離對大多數(shù)從事基礎(chǔ)病毒學(xué)、分子生態(tài)學(xué)、分子流行病學(xué)和病原體研究的實(shí)驗(yàn)室是必不可少的。臨床樣品的病毒分離需要的細(xì)胞主要包括AP-61、Tra-284、C6/36、AP64、CLA-1蚊蟲細(xì)胞和LLCMK2、Vero、BHK21等哺乳動物細(xì)胞,由于蟲蚊病毒培養(yǎng)對登革熱病毒具有高度的敏感性,因此可作為從致死病人尸體和嚴(yán)重出血性病人中分離病毒的首選技術(shù)。白蚊伊蚊、巨蚊屬是登革熱病毒復(fù)壯的良好宿主,來自白蚊伊蚊的C6/36通常作為從登革熱急性期病人的血液中分離病毒的選擇細(xì)胞。2實(shí)時定量pcr檢測分子生物學(xué)的進(jìn)步為病原體的檢測和特性分析提供了快速、可靠的技術(shù)手段,登革熱病毒的傳統(tǒng)診斷方法對急性期血清的病毒檢測,由于敏感性、可靠性方面的缺點(diǎn),使得其在臨床治療、病原性調(diào)查和傳染病控制方面意義不大。應(yīng)用于登革熱病毒的快速鑒定和定型的各種RT-PCR檢測方法已在許多實(shí)驗(yàn)室被建立。用于登革熱病毒檢測的RT-PCR擴(kuò)增的靶序列是膜前蛋白基因。不同的血清型PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小不同。因此,可以用于不同血清型的登革熱病毒的檢測,也可以選擇等溫RNA特異性擴(kuò)增用于臨床樣品的病毒和細(xì)菌檢測。在NASBA進(jìn)行登革熱病毒的流行病學(xué)研究中,41℃的操作溫度具有高度的特異性和敏感性。最近,用于急性感染期血清樣品檢測登革熱病毒的實(shí)時PCR檢測方法也已經(jīng)建立。實(shí)時定量PCR方法測定的是血液中病毒核酸的含量,因此不必等到病人體內(nèi)產(chǎn)生抗體,同時,由于其靈敏度與Elisa相比不可同日而語,在病毒感染的早期,即血液中病毒含量很低時就可以測定。與PCR和反轉(zhuǎn)錄PCR相比,實(shí)時PCR檢測方法具有更快速、敏感、特異、低污染和易標(biāo)準(zhǔn)化等更多的優(yōu)點(diǎn)。因此,實(shí)時PCR已經(jīng)逐漸取代傳統(tǒng)PCR成為登革熱病毒急性感染期快速診斷的“金牌標(biāo)準(zhǔn)”。實(shí)時PCR過程中,主要應(yīng)用5種成分,包括熒光標(biāo)記的DNA、5′核酸酶、相鄰線性寡聚核苷酸探針、發(fā)卡狀寡聚核苷酸探針和自發(fā)光集團(tuán),其中應(yīng)用最廣泛的是5′-3′寡聚核苷酸探針。由于探針的特異性序列雜交,使得TaqMan實(shí)時PCR具有高度的特異性。隨著熒光集團(tuán)、核酸標(biāo)記化學(xué)技術(shù)和檢測儀器的發(fā)展,在單管內(nèi)加入4種熒光基團(tuán)的多重PCR更具發(fā)展?jié)摿ΑＲ虼?含有4種顏色的多重TaqMan實(shí)時RT-PCR能夠檢測和鑒定4種血清型的登革熱病毒。但是,應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是每次應(yīng)用的引物和探針不一定能檢測所有的登革熱病毒株,其敏感性取決于引物和探針與病毒靶向序列的同源性。因此,在檢測操作過程中,對不同的基因序列區(qū)域用多條引物和探針以避免不同毒株和潛在突變引起基因序列變化導(dǎo)致的假陰性結(jié)果。選擇合適的實(shí)時定量PCR相關(guān)試劑需要進(jìn)行多方面的考慮,包括特異性、成本及整體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案。用DNA雙鏈特異結(jié)合的熒光染料例如SYBRGREENI(SGⅠ)時僅需要一對擴(kuò)增引物。用SGⅠ實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)簡單,成本低廉,可用于多種目標(biāo)基因的檢測。然而SGⅠ能夠非特異的結(jié)合于所有雙鏈DNA,會導(dǎo)致較高的熒光背景和低特異性。Shu等人成功建立了一步RT-PCR能夠檢測包括登革熱病毒、日本乙型腦炎病毒、黃熱病毒和西尼羅河病毒在內(nèi)的幾種黃病毒科的病毒。避免假陽性出現(xiàn)尤其要注意操作過程中樣品和試劑的污染。3多種黃病毒的鑒別登革熱病毒感染的血清學(xué)診斷困難主要是由于下列原因。(1)缺乏交叉保護(hù)的中和抗體而導(dǎo)致的4型登革熱病毒多重感染和繼發(fā)感染;(2)由于預(yù)存抗體和最初感染抗原的記憶細(xì)胞存在使得對多種黃病毒感染的鑒別更加困難;(3)高滴度的IgG抗體與同源和異源的黃病毒抗原發(fā)生交叉反應(yīng);(4)由于感染登革熱病毒病人的IgG抗體的長期存在(特異性IgG捕獲ELISA檢測證實(shí)300d以上),許多二次感染登革熱病毒的病人的血清學(xué)診斷就更為困難。但各種分析復(fù)雜病毒抗原和抗體應(yīng)答方法的快速進(jìn)展,為登革熱病毒不同的結(jié)構(gòu)蛋白和非結(jié)構(gòu)蛋白的血清學(xué)診斷和血清流行病學(xué)調(diào)查開辟了通路。3.1急性登革熱感染ns1、ss1的臨床診斷由于二次感染登革熱病毒病人體內(nèi)存在的病毒IgG免疫復(fù)合物,二次感染登革熱病毒病人急性期血清樣品的檢測敏感性低。但最近對病毒E/M抗原和NS1抗原的ELISA和dotblot檢測證實(shí),在初次感染和二次感染發(fā)病9d后病人血清中可以檢測到以免疫復(fù)合物形式存在的高濃度的E/M和NS1病毒抗原。Koraka等通過dotblot免疫測定法檢測登革熱急性感染期病人的血清中的NS1抗原,結(jié)果表明,初次感染和二次感染登革熱病毒抗原陽性病人數(shù)量要遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于RT-PCR檢測的陽性數(shù)量。因此,NS1抗原檢測是急性登革熱病毒感染具有潛力的血清學(xué)診斷方法,同時也表明RT-PCR檢測結(jié)果低估了登革熱病毒感染病人的數(shù)量。另外,急性期血清RT-PCR檢測陽性的樣品,病毒NS1抗原檢測卻呈現(xiàn)陰性,因此,RT-PCR檢測和病毒NS1抗原檢測對急性登革熱病毒感染的早期診斷的敏感性和特異性評價(jià)和分析還需要進(jìn)一步研究。盡管如此,病毒NS1抗原檢測仍不失登革熱病毒感染早期診斷的潛力。3.2傳統(tǒng)血清學(xué)法檢測igm和iggelisa登革熱病毒特異性抗體的檢測方法主要包括血凝抑制試驗(yàn)(HI)、中和試驗(yàn)、間接免疫熒光抗體試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合反應(yīng)、dotblotting、Westernblotting和快速免疫層折法。其中,捕獲IgM和/或IgGELISA、抗原包被間接IgM和/或IgGELISA和血凝抑制試驗(yàn)是登革熱病毒感染常規(guī)診斷最常用的血清學(xué)方法。HI由于其敏感、簡便和重復(fù)性好而通常被用于初次感染和二次感染。當(dāng)病人血清的HI檢測滴度高于或等于1:2,560時,被認(rèn)為是二次感染,小于1:2,560是初次感染。由于HI內(nèi)在的缺陷,逐漸被E/M特異性捕獲IgM和IgGELISA取代。與HI相比,E/M特異性捕獲IgM和IgGELISA具有更高的敏感性、特異性、操作更簡便和可行的高通量自動化而成為登革熱病毒感染抗體血清學(xué)診斷最有潛力的檢測方法。3.2.1次感染的檢測制備的初次感染和二次感染的登革熱病毒的IgM抗體用于抗體檢測具有良好的敏感性和特異性,已經(jīng)被用于商業(yè)化的試劑盒。初次感染登革熱病毒的病人產(chǎn)生IgM抗體的速度很快,半數(shù)住院發(fā)病3~5dIgM抗體即可達(dá)到可檢測到的水平?？贵w應(yīng)答動力學(xué)研究表明,抗登革熱病毒IgM的最高峰是在感染后的2周,隨后逐漸降低,2~3個月后降至檢測不到的水平,而后登革熱病毒的IgG才逐漸產(chǎn)生。二次感染登革熱病毒病人的IgM動力學(xué)與初次感染的病人類似,只是IgM水平較低?？沟歉餆岵《綢gM在感染后的2周后達(dá)到峰值,在出現(xiàn)癥狀后的60d時,仍然有30%的病人還能夠檢測到抗體的存在。與初次感染相反,二次感染導(dǎo)致在IgM應(yīng)答同時或之前即可產(chǎn)生高滴度的IgG交叉抗體。通過確定IgM和IgG抗體的比例即可確定是初次感染還是二次感染。因此,初次感染登革熱病毒急性期血清IgM/IgG比例高,而二次感染的IgM/IgG比例較低。這對于分析感染登革熱病毒病人的免疫狀態(tài)很有幫助。通過E/M特異性捕獲IgMELISA檢測IgM抗體,可以證實(shí)急性感染或近期感染。證明感染登革熱病毒最可靠的指標(biāo)是IgM和/或IgG抗體滴度的顯著增高(4倍或更高)。E/M特異性捕獲IgMELISA檢測IgM抗體和E/M包被間接IgGELISA檢測IgG抗體是分析血清樣品中抗體滴度的最好方法。急性感染期的病人IgM和/或IgG很低,隨著病情的發(fā)展逐漸增高,恢復(fù)期達(dá)到最高。因此,在登革熱病毒高發(fā)區(qū),由于許多二次感染登革熱病毒病人體內(nèi)IgG的長期存在,用此方法將急性感染期和恢復(fù)期的雙份血清檢測分析,可以避免假陽性。通過E/M抗原包被間接IgGELISA檢測登革熱病毒特異IgG抗體比E/M特異性捕獲IgGELISA檢測具有更高的敏感性,而常取代HI試驗(yàn)被用于鑒別初次感染和二次感染。值得強(qiáng)調(diào)的是,盡管E/M特異性IgG抗體在二次免疫應(yīng)答期間各種黃病毒呈現(xiàn)高度的交叉反應(yīng),但E/M和NS1特異性抗登革熱病毒IgM抗體的交叉反應(yīng)則很有限。因此,少數(shù)登革熱病毒感染的病人體內(nèi)檢測到登革熱特異性IgM抗體的交叉反應(yīng)恰恰證明病人感染了其它的黃病毒。應(yīng)用幾種病毒抗原檢測IgM抗體能夠成功的診斷黃病毒的急性和近期感染。以感染病毒的細(xì)胞培養(yǎng)上清為病毒抗原,黃病毒E/M特異性單克隆抗體為二抗的特異性捕獲IgM和IgGELISA鑒別乙型腦炎、登革熱、黃熱病病毒和西尼羅河病毒的效果非?？煽?。3.2.2關(guān)于iga的特異性許多學(xué)者對登革熱病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性IgA和IgE進(jìn)行了研究,通過IgA和IgM特異性捕獲ELISA檢測證明,病毒誘導(dǎo)產(chǎn)生的IgM比IgA迅速,在體內(nèi)存在的時間持久,IgA只維持40d左右,而IgM可達(dá)40~60d。因此,IgA特異性捕獲ELISA與IgM特異性捕獲ELISA有助于理解登革熱病毒感染的血清學(xué)特征。Balmaseda等通過檢測病人血清和唾液中的IgM和IgA抗體顯示,登革熱病毒特異性IgA可以作為潛在的診斷目標(biāo)抗體。Koraka等通過捕獲ELISA檢測機(jī)體的所有抗體應(yīng)答和IgE應(yīng)答水平得出結(jié)論:登革熱休克綜合征病人和登革出血熱病人的登革熱病毒特異性IgE應(yīng)答水平比單純的登革熱病毒感染者要高得多。所以,登革熱病毒IgEELISA檢測分析對理解登革熱病毒的致病性是很有幫助的。3.2.3登革熱病毒的血清型鑒定病毒非結(jié)構(gòu)蛋白中的NS1、NS3和NS5都可作為誘導(dǎo)登革熱病毒特異性抗體應(yīng)答的免疫抗原。NS1抗體應(yīng)答主要通過合成多肽、重組蛋白和來自病毒接種的鼠腦或病毒感染的細(xì)胞上清制備的天然抗原進(jìn)行免疫獲得。NS1同型ELISA和血清型特異性ELISA對鑒別乙型腦炎病毒和登革熱病毒、乙型腦炎病毒感染和疫苗免疫、登革熱病毒初次感染和二次感染以及初次感染登革熱病毒的血清型鑒定都是簡便可靠的手段。近年來,通過從世界各地收集的血清進(jìn)行的回顧性流行病學(xué)研究證明,NS1型特異性IgGELISA可以用于替代中和試驗(yàn)用于鑒別日本乙型腦炎病毒和登革熱病毒感染的血清流行病學(xué)研究以及登革熱病毒初次感染的血清型鑒定。此外,從繼發(fā)感染急性期的血清中可以檢測到最初呈現(xiàn)的是NS1特異性IgG免疫應(yīng)答,而第3次和第4次感染則呈現(xiàn)強(qiáng)烈的IgG免疫應(yīng)答。因此,NS1型特異性IgGELISA也可以用于多次登革熱病毒感染的早期診斷。許多以免疫層折法為基礎(chǔ)的快速檢測登革熱病毒的試劑盒已經(jīng)商品化,大多數(shù)試劑盒都可以在5~30min內(nèi)從病人的全血、血清和血漿中同時檢測IgM和IgG抗體,有些試劑盒還可以區(qū)別登革熱病毒的初次和繼發(fā)感染。多數(shù)試劑盒檢測IgG的敏感性都很高,但檢測IgM則相對較低,其特異性均比E/M特異性捕獲IgM和IgGELISA要高。盡管這些試劑盒具有簡便、快速的優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用于臨床樣品的篩選,但由于在登革熱病毒地方性流行地區(qū)的普通人群中長期存在黃病毒交叉反應(yīng)的IgG。因此,高度敏感性的IgG檢測方法并不適合登革熱的公共衛(wèi)生學(xué)監(jiān)督和血清學(xué)調(diào)查。4ns1型特異性捕獲iggelisa登革熱病毒的血清型分析對流行病學(xué)調(diào)查和致病性研究具有重要意義。常用的分析方法有型特異性單克隆抗體免疫熒光染色、中和試驗(yàn)和RT-PCR。至于E/M特異性捕獲IgM和IgGELISA能否用于定型檢測,目前尚存爭論。最近,Shu等以感染4型病毒的Vero細(xì)胞上清為抗原對感染登革熱病毒病人恢復(fù)期的血清進(jìn)行E/M和NS1血清型特異捕獲IgMELISAs檢測,結(jié)果表明其陽性血清型特異性分別為98.6%和61.9%。必須強(qiáng)調(diào)的是,為了獲得可靠的結(jié)果,微量滴定孔中加入每型病毒抗原的量應(yīng)該相同。此外,NS1型特異性捕獲IgGELISA也可以用于初次感染登革熱病毒病人恢復(fù)期的血清和二次感染急性期血清樣品的病毒血清型分析。Ludolfs等應(yīng)用在大腸桿菌中重組的登革熱1-4型病毒抗原對來自初次感染和