黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns3的研究進展

黃病毒非結(jié)構(gòu)蛋白ns3的研究進展

黃病毒屬病毒是一種非分布的正常病毒。整個重組時間約為11k。5端有一個ii型帽子結(jié)構(gòu)（m7dppp頁）和五個非翻譯區(qū)域，3端有一個非翻譯區(qū)域，但沒有一個頭銜（a）結(jié)構(gòu)。大多數(shù)黃色病毒組只有一個開放的代碼框架。編碼長度約為3000-3500個氨基酸殘基的多聚蛋白質(zhì)的前體，依次為nh2-c-prm-e-ns1-ns2a-ns3-ns4a-ns4b-ns5-cooh。前體蛋白在宿主信號肽酶和病毒絲氨酸蛋白酶的催化下切割成為三種結(jié)構(gòu)蛋白(C,prM,E)和至少七種非結(jié)構(gòu)蛋白(NS1,NS2A,NS2B,NS3,NS4A,NS4B和NS5)。黃病毒屬病毒能引起人類多種疾病,其中以出血熱和病毒性腦炎危害最大。NS3是一個具有多種酶活性的蛋白,其酶功能與病毒基因組的復制以及病毒多聚蛋白前體的加工緊密聯(lián)系。在黃病毒屬中,登革病毒NS3的研究最為充分,因此本文介紹時以登革病毒NS3的研究情況為主,輔以其它黃病毒屬成員NS3的研究情況。一、非典型(一)ns3pro切割登革病毒NS3蛋白酶結(jié)構(gòu)域(NS3proteasedomain,以下簡稱NS3pro)由其N端180個左右氨基酸殘基組成,在病毒前體蛋白的加工過程中發(fā)揮重要功能。宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的信號肽酶催化C/prM,prM/E,E/NS1,NS4A/4B之間的切割。而NS3pro則負責NS2A/2B,NS2B/3,NS3/4A,NS4B/5之間的切割,NS3pro還能內(nèi)部切割C、NS2A、NS4A、NS3等蛋白。NS3pro屬于絲氨酸蛋白酶家族,切割點的P2-P1位殘基通常為Lys-Arg,Arg-Arg,Arg-Lys,在少數(shù)情況下為Gln-Arg。P1′位的殘基常為短側(cè)鏈的Gly、Ala或者Ser。(切割產(chǎn)生的N端片段距切割點最近的殘基稱P1,其次近的為P2,產(chǎn)生的C端片段距切割點最近的殘基稱P1′,依次類推。最早由Schechter等于1967年提出這種命名法)NS3pro具有絲氨酸蛋白酶中常見的催化中心結(jié)構(gòu),這一催化部位由His51,Asp75和Ser135構(gòu)成。Ser135γ羥基上的氫原子被His75強烈吸引,使Ser135成為一個很強的親核試劑,能攻擊底物肽鍵的羰基碳。根據(jù)X射線衍射所得到的DEN2NS3pro晶體結(jié)構(gòu),L115、S131、S135、G136、Y150和S163構(gòu)成結(jié)合底物P1殘基側(cè)鏈的S1口袋(pocket),H51、D75、G151、N152和G153構(gòu)成S2口袋,Q35、I36、H51、V52和S135構(gòu)成S1′口袋,Q35、I36、P132和G133構(gòu)成S2′口袋。(二)ns2b是ns3-pro基因組織的最小單位黃病毒屬NS3pro需要輔助因子NS2B的結(jié)合才能顯示蛋白酶活性。登革病毒NS2B由一個約40個殘基的親水結(jié)構(gòu)域和三個疏水區(qū)構(gòu)成。兩個疏水區(qū)位于N端,另一個位于C端。體外實驗證明,全長的NS2B只有在其疏水區(qū)插入膜結(jié)構(gòu)中后才能激活NS3pro,而僅依靠NS2B的親水結(jié)構(gòu)域即能激活NS3pro。因此NS2B可能在插入膜中后構(gòu)象發(fā)生了變化,從而使其親水結(jié)構(gòu)域與NS3pro發(fā)生作用。NS2B與膜的結(jié)合可能使NS3定位在膜上,并有可能通過NS3-NS5相互作用將NS5富集到膜結(jié)構(gòu)上,以形成病毒RNA復制酶復合體。在登革病毒中,NS2B親水結(jié)構(gòu)域(53-92AAs,以下簡稱ΔNS2B)是已知能激活NS3pro的最小單位。L53的刪除使ΔNS2B完全喪失激活功能,E89EEE92(DEN2)每個Glu的刪除都導致ΔNS2B激活能力的減弱,T92(DEN4)的刪除使ΔNS2B失去激活能力。在DEN2病毒中的突變分析發(fā)現(xiàn),L75A、I77A和I79A降低了NS2B激活NS3pro的能力,而W62A和L75A/I79A雙突變使NS2B激活NS3pro的能力基本消失。這一結(jié)果揭示了NS2B保守的W62、L75和L79殘基對于激活NS3蛋白酶的關(guān)鍵作用。(三)s1、s13pe和ns3pro的激活ΔNS2B核心區(qū)13個殘基組成的疏水肽段(S69GSSPILSITISE81)不能激活NS3pro。鑒于HCVNS3pro能被來源于其NS4A的14殘基疏水肽段激活,人們認為登革病毒和HCVNS3pro的激活機制是不同的。晶體結(jié)構(gòu)表明,登革病毒NS3pro的構(gòu)象更類似于HCVNS3pro-NS4A復合體中NS3pro的構(gòu)象,而不是HCVNS3pro自身的構(gòu)象。Yusof等發(fā)現(xiàn),在NS2B不存在時,NS3pro不能切割由P1、P2位的殘基(Arg-Arg)和熒光基團構(gòu)成的小分子底物,但是NS3pro卻能獨自切割只包含P1位Arg的小分子底物BAPNA(見圖1),NS2B/NS3pro也能切割BAPNA,但特異性不如NS3pro?？赡艿脑蚴荖S2B的結(jié)合使NS3pro底物結(jié)合部位的構(gòu)象發(fā)生改變。根據(jù)已有的結(jié)構(gòu)模型和他們的實驗數(shù)據(jù),Yusof等提出了NS2B激活NS3pro的模型(見圖2):NS3pro單獨存在時,只有S1能與P1的側(cè)鏈結(jié)合(圖2a),NS2B使NS3pro構(gòu)象改變,S2、S3、S1′和S2′分別與底物上相應(yīng)部位結(jié)合(圖2b、c)圖二b、c是兩種可能的機制,b:NS2B的殘基直接參與了與底物殘基側(cè)鏈的結(jié)合;c:只有NS3pro提供與底物結(jié)合的部位。目前這一模型尚沒有實驗證據(jù)支持。RohanaYusof等,于2000年提出Chappell等根據(jù)登革病毒NS3pro的晶體結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)預(yù)測了西尼羅病毒NS3pro的結(jié)構(gòu),并根據(jù)所預(yù)測的結(jié)構(gòu)構(gòu)建了一系列西尼羅病毒NS3pro的突變體,體外實驗測定蛋白酶活性,發(fā)現(xiàn)D129A/E/N,Y150A/F,S160A,S163A和N152A的突變均不同程度降低了NS3蛋白酶活性。而這些殘基在預(yù)測的結(jié)構(gòu)中與底物結(jié)合有關(guān)。這也證明了NS3pro在黃病毒屬內(nèi)結(jié)構(gòu)是相近的,因此筆者認為登革病毒NS3pro的晶體結(jié)構(gòu)也可以用于其它黃病毒NS3pro的結(jié)構(gòu)預(yù)測。二、苷三磷酸酶活性在黃病毒科三個屬成員的NS3蛋白中都有解旋酶活性和核苷三磷酸酶活性的發(fā)現(xiàn)。例如:登革病毒、日本腦炎病毒、西尼羅病毒、牛病毒性腹瀉-粘膜病毒、丙肝病毒(HCV)等。NS3解旋酶活性可能與復制中間體的解鏈有關(guān)。(一)基序gxgkt登革病毒NS3解旋酶/核苷三磷酸酶位于NS3C端同一結(jié)構(gòu)域中。這一結(jié)構(gòu)域具有七個保守基序,從N端到C端依次為:基序Ⅰ,Ⅰa,Ⅱ,Ⅲ,Ⅳ,Ⅴ和Ⅵ?；颌?GxGKT)負責結(jié)合NTP的β和γ磷酸基團?；颌?DExH或DEAD或DEAH),可能能夠結(jié)合Mg2+并使其與NTP的γ磷酸基團形成復合物?；颌笥址Q鉸鏈區(qū),負責連結(jié)上下游的不同結(jié)構(gòu)域?；颌雠cRNA結(jié)合有關(guān)。據(jù)推測以下殘基和基序可能參與了NTP水解和RNA解旋的偶聯(lián),它們是:基序Ⅱ的組氨酸殘基,基序Ⅲ(TATbox),以及基序Ⅵ([Q/x]RxGRxxR)的谷氨酰胺和精氨酸殘基。(二)登革病毒ns3的缺失造成了4.2酶活性的變化與大多數(shù)解旋酶/核苷三磷酸酶不同,NS3能催化DNA/DNA雙鏈,RNA/RNA雙鏈以及RNA/DNA雙鏈的解螺旋,這是因為DNA或RNA底物與酶分子相互作用的部位不是堿基或者戊糖分子而是磷酸基團。NS3解旋酶/核苷三磷酸酶活性依賴于二價金屬離子。當不存在二價金屬離子時NS3不具備解旋酶/核苷三磷酸酶活性。適當?shù)逆V離子濃度能刺激NS3核苷三磷酸酶和解旋酶的活性提高。但當鎂離子濃度過高時,會降低NS3核苷三磷酸酶和解旋酶的活性,對于登革病毒NS3來說,在poly(A)存在的條件下,最適的鎂離子濃度為1~2.5mM。而在日本腦炎病毒中有著類似的結(jié)果,鎂離子濃度為1~3mM時其解旋酶活性最高。有報道稱,poly(A)的加入可以增強登革病毒NS3的核苷三磷酸酶活性,而其它核酸均聚物也能對登革病毒NS3的核苷三磷酸酶活性起到一定程度上的增強作用。因此,登革病毒NS3的核苷三磷酸酶是核酸增強性的(nucleicacid-stimulated)。Li等發(fā)現(xiàn)登革病毒NS3的160~180之間的氨基酸殘基與核苷三磷酸酶活性有關(guān)。這20個氨基酸的缺失導致NS3在poly(A)存在和不存在的情況下均呈現(xiàn)很低的核苷三磷酸酶活性。而R184KRK187→Q184NGN187的突變(“→”表示“突變?yōu)椤?即其前面的序列是未突變的,其后面是突變后的序列,以下同)則增強了在poly(A)不存在時NS3的核苷三磷酸酶活性,而且同時降低了poly(A)存在時NS3的核苷三磷酸酶活性。因此Li等認為,R184KRK187可能是NS3解旋酶/核苷三磷酸酶結(jié)構(gòu)域的一個新的基序。最近的研究證實,R184KRK187這一基序和NS3與RNA的結(jié)合有關(guān),這可能是它對于NS3核酸增強性核苷三磷酸酶活性具有調(diào)節(jié)作用的原因。(三)小鼠血清中ns3的變化解旋酶斷開核酸雙鏈間的氫鍵是一個需要能量的過程,而核苷三磷酸酶水解NTP的高能磷酸鍵恰好能提供能量,又因為NS3解旋酶與核苷三磷酸酶位于同一結(jié)構(gòu)域中,人們曾經(jīng)認為NS3解旋酶與核苷三磷酸酶存在著直接的偶聯(lián)關(guān)系,但近年來許多實驗證據(jù)并不支持這一觀點。Matusan等在登革2型病毒NS3解旋酶的保守基序內(nèi)部以及保守基序之間的帶電氨基酸富集區(qū)引入了若干突變,將未突變及突變后的蛋白在大腸桿菌中表達,純化后測定各自的解旋酶和核苷三磷酸酶活性,結(jié)果分為五類:①兩種酶活性都消失;②兩種酶活性增強;③核苷三磷酸酶活性降低,解旋酶活性消失;④兩種酶活性都降低;⑤核苷三磷酸酶活性降低,解旋酶活性增強(M283突變?yōu)镕)。盡管目前對于第五種結(jié)果沒有合理的解釋,但它提示我們,兩種酶活性并非直接偶聯(lián)的。Borowski等在西尼羅病毒中的研究發(fā)現(xiàn),三氮唑核苷-5′-三磷酸對西尼羅病毒NS3核苷三磷酸酶活性的影響(激活或者抑制)并不直接導致其解旋酶活性的改變;使用鳥嘌呤及O6-苯基鳥嘌呤衍生物進行實驗發(fā)現(xiàn),西尼羅病毒NS3的核苷三磷酸酶和解旋酶活性均能獨立地被調(diào)節(jié),給不引起另一種酶活性的改變。這一實驗結(jié)果再次提示,黃病毒NS3核苷三磷酸酶/解旋酶可能不是直接偶聯(lián)的,而是有可能需要其它因子的參與?？梢?對于NS3解旋酶與核苷三磷酸酶的偶聯(lián)機制還需要進一步深入的研究。(四)ns3基因表達純化及突變黃病毒NS3的RNA5′三磷酸酶活性可能與病毒基因組5′的加帽反應(yīng)有關(guān),因為加帽的第一步反應(yīng)是RNA5′端γ磷酸基團的水解。Bartelma等首先證實了登革病毒NS3的RNA5′三磷酸酶活性。Bartelma還發(fā)現(xiàn),ATP對NS3的RNA5′三磷酸酶活性具有抑制作用。Benarroch等將登革2型病毒NS3的C端54KD的片段(ΔNS3)在原核系統(tǒng)中表達純化,通過活性測定,發(fā)現(xiàn)ΔNS3具有解旋酶/核苷三磷酸酶/RNA5′三磷酸酶三種活性,并且發(fā)現(xiàn)RNA5′三磷酸酶活性是Mg2+依賴的。這與Bartelma等的結(jié)論相反。但是Benarroch等發(fā)現(xiàn)GTP能抑制ΔNS3的RNA5′三磷酸酶活性,這與Bartelma的結(jié)果一致。ΔNS3的突變分析表明,K199(位于基序Ⅰ內(nèi))、D284、E285(位于基序Ⅱ內(nèi))突變?yōu)锳時,蛋白的RNA5′三磷酸酶和核苷三磷酸酶活性減弱或者消失,ΔNS3(D284A)的解旋酶活性也被測定,發(fā)現(xiàn)其解旋酶活性消失。而位于ΔNS3C端的R513突變?yōu)锳則同時使ΔNS3三種酶活性減弱或者消失。根據(jù)這些實驗結(jié)果,他們認為,登革NS3的解旋酶/核苷三磷酸酶/RNA5′三磷酸酶可能共用了一些活性部位,其中包括基序Ⅱ以及位于蛋白C端一些尚不清楚的元件。三、hcv的ns3抑制劑在黃病毒cDNA的Ns3基因適當位置引入突變,再經(jīng)體外反轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)染細胞,可以得到毒力減弱的毒株。這些減毒株可用于重組疫苗的研究。Matusan等在登革病毒NS3pro催化基團以及底物結(jié)合基團之外的位置引入突變,希望能通過影響NS2B與NS3的相互作用而達到減弱蛋白酶活性和病毒復制的目的。結(jié)果,他們得到了包含K63RIE66→A63AIA66和E179DD181→A179AA181的兩株減毒株。通過設(shè)計特異性酶抑制劑作為治療病毒病的藥物,是一種抗病毒的新策略。在HCV和HIV中已經(jīng)取得了很大的進展,已經(jīng)有HCV的NS3抑制劑類藥物處在臨床試驗階段。Leung等根據(jù)登革2型病毒NS3pro的底物序列設(shè)計了數(shù)種底物結(jié)構(gòu)類似物,這些底物結(jié)構(gòu)類似物具有切割位點P6-P2′或P6-P4′位的殘基,但是在P1位和P1′位之間有一個羰基基團(或者僅具有P6-P1位的殘基,P1′位由一個醛基代替),故能與