分光光度法實(shí)驗(yàn)教學(xué)的思考

分光光度法實(shí)驗(yàn)教學(xué)的思考

生物學(xué)是一門以實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)的學(xué)科。實(shí)驗(yàn)教學(xué)是生物學(xué)教學(xué)的重要內(nèi)容和環(huán)節(jié)。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展,生物學(xué)研究也從定性研究向定量研究過(guò)渡。在眾多定量測(cè)定分析技術(shù)中,分光光度法的應(yīng)用最為普遍。因此,作為教學(xué)儀器,紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)也從大學(xué)課堂走向中學(xué)課堂。如何更好地使用分光光度計(jì),有效提高教學(xué)效果,培養(yǎng)學(xué)生的創(chuàng)新思維和動(dòng)手能力,是教師必須面對(duì)的問(wèn)題之一。1檢測(cè)系統(tǒng)組成在有關(guān)分光光度法的教學(xué)實(shí)驗(yàn)中,教學(xué)環(huán)節(jié)從介紹分光光度計(jì)原理入手,能起到舉一反三的效果。但應(yīng)注意的是在教學(xué)中不應(yīng)過(guò)多介紹Beer-Lambert光吸收定律及推導(dǎo)公式,重點(diǎn)在于分光光度計(jì)的組成和應(yīng)用。尤其是對(duì)物理、化學(xué)基礎(chǔ)較差的學(xué)生,過(guò)多的公式推導(dǎo)容易讓學(xué)生產(chǎn)生深?yuàn)W感而排斥學(xué)習(xí)。各種型號(hào)的紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì),不論何種形式,基本上都由五部分組成:光源、單色器、樣品、接受檢測(cè)放大系統(tǒng)、顯示或記錄器。前三部分構(gòu)成光學(xué)系統(tǒng),后兩部分構(gòu)成電學(xué)系統(tǒng)。兩個(gè)系統(tǒng)的組合把物質(zhì)的光吸收變化轉(zhuǎn)變成電流變化,從而定量分析物質(zhì)的含量。(1)光源分為可見(jiàn)光源和紫外光源。前者常用鎢燈,適用波長(zhǎng)范圍是400~760nm;后者常用氘燈,適用波長(zhǎng)范圍是195~400nm。(2)單色器是分光光度計(jì)的心臟部分,它的作用是把來(lái)自光源的混合光分解為單色光,并能通過(guò)調(diào)節(jié)波長(zhǎng)選擇所需入射光路中單色光的波長(zhǎng)。單色器中核心元件——色散元件也已從棱鏡向光柵等更精密的元件過(guò)渡。波長(zhǎng)的選擇和單色光質(zhì)量是分光光度法測(cè)量精確度的關(guān)鍵。(3)樣品室是放置待測(cè)樣品的位置。待測(cè)樣品一般盛在吸收池內(nèi)(即比色杯)。比色杯有普通光學(xué)玻璃和石英玻璃杯兩種。前者由于吸收紫外光,只能用于可見(jiàn)光波長(zhǎng)測(cè)定,適用波長(zhǎng)范圍是400~2000nm。后者可透過(guò)紫外光、可見(jiàn)光和紅外光,適用波長(zhǎng)范圍是180~3000nm。(4)接受檢測(cè)放大系統(tǒng)是接收透過(guò)比色杯的光強(qiáng),并以電信號(hào)顯示出來(lái),主要元件是光電轉(zhuǎn)換設(shè)備。常用的檢測(cè)器已從最初的光電管、光電信增管、光電二極管等轉(zhuǎn)換為電荷耦合器件(CCD)等,從而有更強(qiáng)的光電轉(zhuǎn)換效果。(5)顯示裝置是將光吸收值顯示出來(lái),早期是以電流表顯示,現(xiàn)已逐漸用數(shù)顯或計(jì)算機(jī)等所替代,從而減少讀數(shù)誤差。2測(cè)定樣品時(shí)注意使用比色杯在了解基本原理的基礎(chǔ)上,分光光度計(jì)的使用主要從以下幾個(gè)方面著手:(1)光源和波長(zhǎng)的選擇根據(jù)所測(cè)定的物質(zhì)的性質(zhì),選擇合適的光源和波長(zhǎng)。一般在可見(jiàn)光范圍選擇鎢燈,紫外選擇氫燈,但現(xiàn)在也有的紫外/可見(jiàn)分光光度計(jì)在設(shè)計(jì)上已取消光源選擇,只要一打開(kāi)機(jī)器,兩種光源都打開(kāi)。初學(xué)者常犯的錯(cuò)誤是忽視波長(zhǎng)的選擇,教學(xué)中常遇到的事情是學(xué)生把樣品測(cè)完了才發(fā)現(xiàn)波長(zhǎng)選錯(cuò)了,究其原因是沒(méi)有檢查波長(zhǎng)設(shè)置。因此,在教學(xué)中,我們經(jīng)常強(qiáng)調(diào)使用分光光度計(jì)時(shí),第一步是打開(kāi)電源,第二步就是檢查波長(zhǎng)。如果是繼續(xù)別人后使用儀器,則第一步就是檢查波長(zhǎng)。(2)樣品測(cè)定用于分光光度計(jì)測(cè)定樣品物質(zhì)含量的基本原理是,樣品在一定波長(zhǎng)下光吸收值的大小與樣品中該物質(zhì)濃度成正比。而最好的線性關(guān)系是在光吸收值為0.3~0.7時(shí)。因此,測(cè)定前要經(jīng)過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定合適的樣品濃度,讓反應(yīng)后的待測(cè)溶液的光吸收值位于這個(gè)范圍內(nèi)。否則,待測(cè)數(shù)據(jù)不能正確反映實(shí)際變化。學(xué)生常有的一個(gè)誤區(qū)是光吸收超過(guò)1.0以上時(shí),將待測(cè)液稀釋后測(cè)定。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明,這種做法是不正確的,樣品稀釋?xiě)?yīng)該在反應(yīng)前而不應(yīng)在反應(yīng)后。如果不同樣品之間濃度差異較大,則在測(cè)定時(shí)應(yīng)先測(cè)定低濃度(淺色),再定測(cè)高濃度(深色),這樣可以避免反復(fù)洗比色杯。不僅節(jié)省時(shí)間,還可以避免洗杯后潤(rùn)洗所造成的誤差。為了減少比色杯的光吸收誤差,除了測(cè)定前校正比色杯外,可以在測(cè)定中平行樣品間使用同一個(gè)比色杯測(cè)定。當(dāng)分光光度計(jì)使用時(shí),每次測(cè)定樣品時(shí)應(yīng)先用對(duì)照校正零點(diǎn)(機(jī)器和光吸收),然后再將待測(cè)樣品拉入光路進(jìn)行測(cè)定。實(shí)際操作時(shí)也可以只校正光吸收零點(diǎn),當(dāng)光吸收零點(diǎn)出現(xiàn)較大誤差時(shí),再全部校正。因?yàn)榉止夤舛确ㄊ且晕镔|(zhì)光吸收作為設(shè)計(jì)基礎(chǔ)的,一般測(cè)定時(shí)常以蒸餾水等作為參照調(diào)正儀器的零點(diǎn)和光吸收的零點(diǎn)。測(cè)定樣品得到的光吸收值減去空白管光吸收值,再去計(jì)算含量。但實(shí)際上,比較以空白管代替蒸餾水管來(lái)調(diào)儀器的零點(diǎn)和光吸收零點(diǎn),所測(cè)得的光吸收值和一般操作所測(cè)定的光吸收值是一樣的。但這樣做的結(jié)果不僅簡(jiǎn)便了實(shí)驗(yàn)操作,而且消除了試劑本身的光吸收值。(3)比色杯的使用如前所述,測(cè)定范圍在可見(jiàn)光時(shí)選用普通玻璃比色杯,石英比色杯則在紫外/可見(jiàn)光范圍使用,由于石英比色杯價(jià)格較貴,所以測(cè)可見(jiàn)光時(shí)盡量選用普通玻璃比色杯。拿比色杯時(shí)手指不能觸摸透光面,放入樣品室時(shí)應(yīng)讓光路穿過(guò)透光面,比色杯內(nèi)的樣品液應(yīng)達(dá)到比色杯體積的2/3高度,過(guò)高容易溢出損壞樣品室,過(guò)低不能覆蓋光路,影響測(cè)量數(shù)據(jù)精確性。傾倒測(cè)定后樣品時(shí),應(yīng)先將樣品倒回試管,并繼續(xù)保持比色杯口朝下?tīng)顟B(tài),然后將比色杯口扣到粗濾紙上,移動(dòng)2~3次,至濾紙上沒(méi)有液體痕跡為止。這樣可以將殘留液體吸到粗濾紙上,當(dāng)再次盛下個(gè)待測(cè)樣品時(shí),一方面杯子內(nèi)無(wú)殘留液;另一方面杯子外也不會(huì)有液體殘留。既避免了擦拭杯子,又節(jié)省了測(cè)定時(shí)間和擦鏡紙。倒回試管的樣品,在測(cè)定結(jié)束后確認(rèn)數(shù)據(jù)無(wú)誤時(shí),再倒掉,這樣可以避免發(fā)現(xiàn)數(shù)據(jù)有誤時(shí),樣品已倒掉的尷尬。擦拭比色杯時(shí)應(yīng)用擦鏡紙或綢布擦,不可用硬紙或布擦拭透光面。用擦鏡紙擦拭時(shí),可將大張紙剪成小張,每次用指肚頂著擦鏡紙,輕輕單向擦拭杯子。然后,再換紙的另一點(diǎn)再單向擦,不能來(lái)回擦,也不能用一點(diǎn)反復(fù)擦,簡(jiǎn)潔表達(dá)為“單點(diǎn)單面”,即擦鏡紙的每一點(diǎn)只能用一次,可以折疊也可以換面(生活中擦眼鏡也應(yīng)是同樣道理和方法)。學(xué)生在實(shí)驗(yàn)中往往記住了“單向”,忽略了“單點(diǎn)”,為了加深印象,教師應(yīng)給學(xué)生做示范如何擦拭比色杯。比色杯用后應(yīng)及時(shí)清洗,一般先用自