腦缺血缺氧后鈣穩(wěn)態(tài)失衡分子機(jī)制及防治進(jìn)展

腦缺血缺氧后鈣穩(wěn)態(tài)失衡分子機(jī)制及防治進(jìn)展

缺血性腦損傷的病理生理機(jī)制非常復(fù)雜，不同的內(nèi)源性氨基酸、自由基、鈣超標(biāo)和相關(guān)死亡基因的發(fā)現(xiàn)和炎癥反應(yīng)起到了重要作用。缺血后的神經(jīng)元死亡包括壞死和凋亡兩種方式,缺血核心區(qū)以壞死為主,而半暗帶內(nèi)的遲發(fā)性神經(jīng)元死亡則以凋亡為主。鈣超載是凋亡過程中的關(guān)鍵因素,也是各種有害因素致神經(jīng)元死亡的最后共同通路。鈣超載可以通過激活氧化應(yīng)激反應(yīng)產(chǎn)生氧自由基、引起線粒體損傷以及激活蛋白激酶等三種途徑引起神經(jīng)元死亡。本文擬對(duì)缺血性腦卒中鈣穩(wěn)態(tài)失衡分子機(jī)制和有關(guān)防治進(jìn)展作一綜述。一、特殊系統(tǒng)ca2+正常神經(jīng)元內(nèi)Ca2+含量與細(xì)胞液相近,細(xì)胞漿內(nèi)的靜息游離鈣離子濃度([Ca2+]i)僅在0.1μmol/L左右,細(xì)胞內(nèi)Ca2+庫可以吸收和釋放Ca2+,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)類Ca2+庫和線粒體。神經(jīng)元主要通過配體門控鈣通道、電壓依賴性鈣通道、胞內(nèi)細(xì)胞器上鈣通道、Ca2+-ATP酶和鈣受體蛋白等維持正常的Ca2+梯度。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Ca2+參與神經(jīng)元興奮性調(diào)節(jié)、神經(jīng)遞質(zhì)合成與釋放、神經(jīng)元營養(yǎng)和發(fā)育等多項(xiàng)功能活動(dòng)。缺血引起的胞漿[Ca2+]i的增加來自于細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流,細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+釋放以及胞漿Ca2+的外排能力下降。當(dāng)鈣內(nèi)流過多或胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣釋放過多,超出神經(jīng)元對(duì)Ca2+的調(diào)節(jié)能力時(shí),引起鈣超載。(一)三-三已藥物作用谷氨酸-鈣超載-興奮性毒性理論認(rèn)為腦缺血缺氧后能量代謝障礙,引起細(xì)胞膜Na+-K+ATP酶活性下降,胞外K+濃度顯著升高,神經(jīng)元去極化,谷氨酸大量釋放;由于Na+/K+跨膜梯度破壞和神經(jīng)元去極化,抑制細(xì)胞對(duì)谷氨酸的攝取,使細(xì)胞間隙谷氨酸大量積聚,激活細(xì)胞膜上的N-甲基-D-天門冬氨酸(NMDA)受體,使受體操縱的鈣通道病理性開放,大量Ca2+進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)引起鈣超載,谷氨酸主要通過鈣超載介導(dǎo)細(xì)胞損傷。但是在損傷前或后短時(shí)間內(nèi)立即施加一、二、三代谷氨酸受體拮抗劑的臨床試驗(yàn),結(jié)果未顯示神經(jīng)保護(hù)作用。谷氨酸還可激活代謝型紅藻氨酸/α-氨基-3-羥基-5-甲基異惡唑-4-丙酸(AMPA)受體,促進(jìn)Na+內(nèi)流和K+、Cl-外流,細(xì)胞膜持續(xù)去極化,啟動(dòng)電壓依賴性鈣通道開放,加重鈣超載。動(dòng)物試驗(yàn)證明AMPA受體拮抗劑如ZK200775的有效性,并通過健康志愿者的耐受性試驗(yàn),但是隨機(jī)、雙盲、安慰劑對(duì)照的多中心臨床研究,發(fā)現(xiàn)ZK200775具有明顯的鎮(zhèn)靜作用,連續(xù)使用引起短暫性神經(jīng)系統(tǒng)功能惡化,甚至木僵和昏迷,因而提前終止試驗(yàn)。NMDA受體是對(duì)Ca2+高度通透的配體門控離子通道,受谷氨酸競爭性激動(dòng)劑控制,還受多種內(nèi)源性物質(zhì)和藥物的影響,如甘氨酸變構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)。在低濃度甘氨酸存在時(shí),L-谷氨酸所產(chǎn)生的NMDA受體興奮性提高。研究顯示神經(jīng)元細(xì)胞外甘氨酸的濃集與腦缺血早期神經(jīng)元損傷有直接的相關(guān)性。甘氨酸主要有抑制神經(jīng)遞質(zhì)和調(diào)節(jié)NMDA受體的興奮性作用。作用于NMDA受體甘氨酸位點(diǎn)的非競爭性拮抗劑,能夠有效抑制某些腦區(qū)高水平神經(jīng)遞質(zhì)。如谷氨酸的影響,也能相對(duì)保持其他腦區(qū)神經(jīng)遞質(zhì)的正常傳遞,也無其他谷氨酸受體拮抗劑有關(guān)的細(xì)胞空泡現(xiàn)象,但是甘氨酸位點(diǎn)拮抗劑如SM31900的臨床研究,結(jié)果未顯示明顯防治神經(jīng)元缺血性損傷的效果。另外,研究發(fā)現(xiàn)高活性甘氨酸裂解酶系(theglycinecleavagemultienzymesystem,GCS)抑制細(xì)胞外甘氨酸濃集,低分子GCS增強(qiáng)劑也有望成為新型神經(jīng)保護(hù)藥物。(二)治療慢性腦缺血腦缺血后中心區(qū)立刻出現(xiàn)的神經(jīng)元死亡與Ca2+超載密切相關(guān),缺血早期Ca2+流入介導(dǎo)電壓敏感性Ca2+通道,缺血神經(jīng)元ATP耗竭使細(xì)胞膜上依賴ATP的Na+/K+泵失效,產(chǎn)生膜去極化,激發(fā)Ca2+通過電壓敏感性Ca2+通道流人細(xì)胞內(nèi),影響鈣激活性鉀通道、氯通道和非特異性陽離子通道,刺激大量鈣內(nèi)流。許多研究涉及二氫吡啶敏感的L型鈣通道,但是這些鈣通道拮抗劑用于急性缺血性卒中患者的效果不明顯。Hou等提出NMDA受體和L型電壓依賴性鈣通道共同作用,使腦缺血再灌注時(shí)神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)Ca2+增多致細(xì)胞死亡。Zhu等以鈣促鈣機(jī)制認(rèn)為腦缺血時(shí)神經(jīng)細(xì)胞膜上電壓敏感性鈣通道開放使胞內(nèi)Ca2+增加,經(jīng)過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上三磷酸肌醇(IP3)促鈣釋放。目前研制的鈣拮抗劑注重作用的多樣性,可阻斷神經(jīng)元死亡級(jí)聯(lián)反應(yīng)中的多個(gè)環(huán)節(jié),處于動(dòng)物試驗(yàn)階段,需進(jìn)一步臨床研究驗(yàn)證其療效。山豆根堿(dauricine)可阻斷N型電壓依賴性鈣通道,也可阻斷鈉通道和T型電壓依賴性鈣通道,保護(hù)神經(jīng)元免受多種有害刺激,也可阻斷神經(jīng)元P型電壓依賴性鈣通道,Li等發(fā)現(xiàn)缺血缺氧海馬腦片及大腦中動(dòng)脈阻塞模型中,山豆根堿可抑制Ca2+從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放和從胞外內(nèi)流,通過降低胞內(nèi)Ca2+濃度以降低線粒體膜通透性,防止神經(jīng)元損傷。力黎蘆醇(resveratrol,Res)直接作用于鈣通道,抑制電壓依賴性鈣通道介導(dǎo)的鈣超載,還有抗氧化作用以及下調(diào)天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶(caspase)等作用,防止神經(jīng)元細(xì)胞凋亡,動(dòng)物試驗(yàn)已證實(shí)其有效。雙苯氟嗪(dipfluzine,Dip)是桂利嗪類鈣拮抗劑,可有效減少鈣內(nèi)流,抑制海馬神經(jīng)元凋亡以及caspase-3的表達(dá),阻止正常神經(jīng)元的丟失,提高神經(jīng)元的存活率。(三)asic1是誘導(dǎo)心肌缺血神經(jīng)元的na+、ca2+內(nèi)流通道谷氨酸受體介導(dǎo)的鈣內(nèi)流僅見于缺血早期,而細(xì)胞膜上的某些蛋白質(zhì)能夠調(diào)控鈣內(nèi)流維持鈣穩(wěn)態(tài)。其中ASIC是上皮細(xì)胞Na+通道相關(guān)家族的成員,是由細(xì)胞外酸性環(huán)境直接激活的陽離子通道,ASIC在pH值低于7.0時(shí)開始激活,在6.0左右(缺血梗死區(qū)的pH值)半數(shù)被激活,可引起鈣依賴性磷酸脂酶激活,產(chǎn)生鈣內(nèi)流。在電壓依賴性鈣通道和谷氨酸受體阻斷劑存在的情況下,ASIC的激活能產(chǎn)生鈣內(nèi)流增加和時(shí)間依賴性神經(jīng)元死亡。研究發(fā)現(xiàn)與多數(shù)介導(dǎo)鈣內(nèi)流的受體通道如煙堿乙酰膽堿受體和谷氨酸受體不同,受體操縱性鈣通道在pH值降低時(shí)被抑制。觀察ASICla亞基(對(duì)酸高敏感但失活很快)滅活的鼠,顯示能夠減輕誘導(dǎo)的腦缺血神經(jīng)細(xì)胞的損害,目前認(rèn)為ASIC1是介導(dǎo)缺血區(qū)神經(jīng)元Na+、Ca2+內(nèi)流的主要通道。動(dòng)物腦缺血模型研究腦室內(nèi)預(yù)注射ASICla阻斷劑阿米洛利(amiloride)和特立尼達(dá)狼蛛毒液(tarantulatoxinpsalmotoxin)與敲除ASICla基因的實(shí)驗(yàn)一樣,可阻止缺血的發(fā)生,并可保護(hù)神經(jīng)元。(四)u3000病理組織學(xué)觀察TRPM在中樞神經(jīng)系統(tǒng)高度表達(dá),在非選擇性陽離子通道周圍。TRPM7易受氧化應(yīng)激激活,腦缺血缺氧時(shí),TRPM7激活使鈣通道開放,鈣離子大量內(nèi)流。TRPM7抑制時(shí)可減少鈣內(nèi)流,減少一氧化氮合酶(NOS)和活性氧(ROS)生成,防止神經(jīng)元變性壞死。TRPM電位也能被酸中毒激發(fā)。研究提示TRPM7能消除抗細(xì)胞毒療法對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用。匹諾卡蘭(Pinokalant)是異喹啉生物堿衍生物,為非特異性陽離子通道阻斷劑,部分作用于TRPM通道。研究大腦中動(dòng)脈阻塞6h后,用匹諾卡蘭組的局部腦血流量明顯增加,磁共振成像觀察梗死面積縮小60%～70%。目前尚無特異性阻斷TRPM7的藥物。1.5Na+/Ca2+交換劑(Na-/Ca2+exchanger,NCX)激活的TRPM7和ASIC1是介導(dǎo)腦缺血神經(jīng)元損傷的有害因素,而NCX卻是一種保護(hù)因素。NCX是神經(jīng)細(xì)胞膜上介導(dǎo)Na+、Ca2+流動(dòng)的反向轉(zhuǎn)運(yùn)體,維持胞漿Na+、Ca2+的穩(wěn)態(tài)。正常情況下NCX作用方式是排出一個(gè)Ca2+伴隨攝入三個(gè)Na+。腦缺血早期神經(jīng)細(xì)胞膜Na+/K+ATP酶失活,大量鈉內(nèi)流致細(xì)胞內(nèi)鈉超載,激活NCX,將鈉排出和鈣攝入,以免鈉超載損害神經(jīng)元,但使胞漿的鈣離子濃度增高。相反,腦缺血后期細(xì)胞內(nèi)鈣超載時(shí),NCX又反向轉(zhuǎn)運(yùn),排出鈣和攝入鈉,以免鈣超載損害神經(jīng)元。NCX有三個(gè)亞型:NCX1、NCX2和NCX3。其中NCX3在腦缺血中心區(qū)表達(dá),是唯一能在細(xì)胞內(nèi)ATP完全缺乏時(shí)也能發(fā)揮保護(hù)作用的亞型轉(zhuǎn)運(yùn)體。NCX下調(diào)致大量鈣超載和神經(jīng)元死亡。鈣蛋白酶(calpain)能裂解NCX3,腦缺血后細(xì)胞內(nèi)鈣超載可激活calpain,再通過裂解NCX3致神經(jīng)元壞死或凋亡,在缺血性腦損傷中起重要作用。鈣蛋白酶抑制劑能夠阻止這種裂解,防止鈣超載引起的神經(jīng)元死亡。Calpeptin是一種人工合成的高效、具有細(xì)胞滲透性的calpain抑制劑,對(duì)大鼠海馬腦片缺氧無糖損傷具有明顯的神經(jīng)保護(hù)作用。Ca2+ATP酶(PMCA)在NCX3裂解后失活,促使鈣離子的反向調(diào)節(jié),支持NCX在神經(jīng)元死亡中的重要作用。二、細(xì)胞內(nèi)鈣超載激活A(yù)nnunziato指出用興奮性毒性理論來解釋腦缺血時(shí)的鈣穩(wěn)態(tài)紊亂過于簡單,應(yīng)從神經(jīng)元缺血死亡的分子機(jī)制及病理生理機(jī)制等方面綜合認(rèn)識(shí)。(一)ATP合成減少使Na+/K+ATP酶功能降低,大量Na+內(nèi)流和K+外流,細(xì)胞膜電位下降產(chǎn)生去極化,導(dǎo)致電壓依賴性鈣通道開放,大量Ca2+內(nèi)流。(二)鈣內(nèi)流刺激谷氨酸釋放,導(dǎo)致谷氨酸受體亞型的NMDA受體通道開放,大量Ca2+內(nèi)流。(三)胞外Ca2+濃度的降低激活了TRPM7促使更多鈣內(nèi)流。(四)細(xì)胞內(nèi)無氧糖酵解使乳酸堆積和細(xì)胞外酸化。(五)細(xì)胞外pH值的降低激活A(yù)SIC1,促使更多鈣內(nèi)流。以上因素引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載使NOS、ROS生成增加,又以正反饋方式增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度,并通過氧化應(yīng)激進(jìn)一步激活TRPM7促使鈣內(nèi)流。保護(hù)基因NCX具有抑制TRPM7、ASICs和NMDA受體操縱的鈣通道作用,能在細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高和氧化應(yīng)激時(shí)被迅速激活。細(xì)胞膜上磷脂酰肌醇二磷酸(PIP3,肌醇三磷脂前體)能夠同時(shí)調(diào)節(jié)NCX和TRPM的活動(dòng),保護(hù)神經(jīng)元。但腦缺血時(shí)PIP3在有些腦區(qū)的量會(huì)變化,使調(diào)節(jié)NCX和TRPM的作用不明顯。鈣對(duì)細(xì)胞的信號(hào)傳導(dǎo)和存活很重要,但細(xì)胞內(nèi)鈣超載在缺血性神經(jīng)元壞死或凋亡的發(fā)生中起關(guān)鍵作用。緊密的離子穩(wěn)態(tài)機(jī)制使鈣介導(dǎo)的多樣化信號(hào)級(jí)聯(lián)放大效應(yīng),在同一個(gè)細(xì)胞內(nèi)可以各自獨(dú)立發(fā)生。過多的鈣內(nèi)流、細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣的釋放和鈣外排機(jī)制受損,能使鈣調(diào)節(jié)機(jī)制失效,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。鈣信號(hào)還能增強(qiáng)不依賴鈣調(diào)節(jié)的死亡子程序。細(xì)胞內(nèi)儲(chǔ)存鈣的重新分配放大了細(xì)胞凋亡信號(hào),也激活鈣蛋白酶執(zhí)行的細(xì)胞死亡,鈣超載可通過蛋白激酶C、蛋白酶SI和Ⅱ、磷脂酶A2、磷脂酶C、Ca2+鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ、核酸內(nèi)切酶、中性蛋白酶等作用而導(dǎo)致神經(jīng)元壞死或凋亡。Ca2+的升高參與了凋亡早期階段的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞凋亡早期線粒體出現(xiàn)內(nèi)膜通透性增加、Ca2+攝入增加、跨膜電位降低、細(xì)胞色素C和