葡萄糖氧化酶（glucoseoxidaseGOD）試劑盒說明書

第第頁(yè)葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）試劑盒說明書葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）試劑盒說明書微量法100管/48樣注意：正式測(cè)定前取23個(gè)預(yù)期差別較大的樣本做猜測(cè)定測(cè)定意義：GOD（EC1.1.3.4）廣泛存在于動(dòng)物和植物中，催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸，并產(chǎn)生H2O2，是生物體中產(chǎn)生活性氧的代謝途徑之一、測(cè)定原理：GOD催化產(chǎn)生H2O2，過氧化物酶催化H2O2氧化4氨基安替比林偶聯(lián)酚，生成有色化合物，在500nm有特征汲取峰，顏色深淺與GOD活性成線性關(guān)系。試驗(yàn)中所需的儀器和設(shè)備：可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研缽、冰、蒸餾水試劑的構(gòu)成和配制：提取液：液體100mL×1瓶，4℃保管；緩沖液：液體30mL×1瓶，4℃保管；試劑一：粉劑×1瓶，20℃保管；臨用前加入10mL緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑4℃保管一個(gè)月；試劑二：粉劑×1瓶，20℃保管；臨用前加入10mL緩沖液充分溶解待用；用不完的試劑4℃保管一個(gè)月；樣品測(cè)定的準(zhǔn)備：1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；依照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：提取液體積（mL）為500～1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波碎裂細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。組織：依照組織質(zhì)量（g）：提取液體積（mL）為1：5～10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。測(cè)定步驟：1、分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)整波長(zhǎng)至500nm，蒸餾水調(diào)零。2、試劑一和試劑二的配制：參見試劑的構(gòu)成和配制。3、煮沸樣本的準(zhǔn)備：取200μL樣本至新的EP管中，95℃水浴10min，冷卻至室溫后，8000g4℃離心10min，取上清作為對(duì)照管的煮沸樣本待測(cè)。4、測(cè)定操作表試劑（μL）對(duì)照管測(cè)定管樣本50煮沸樣本50試劑一7575試劑二7575混勻，35C保溫15min后，于500nm波優(yōu)點(diǎn)讀取吸光度。ΔA=A測(cè)定管A對(duì)照管。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。GOD活力單位的計(jì)算：a.用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下回歸方程為y=2.8348x0.0169；x為H2O2標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為ΔA。1、血清（漿）GOD活力的計(jì)算單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2為一個(gè)酶活力單位。GOD（nmol/min/mL）=（ΔA+0.0169）÷2.8348×V反總÷V樣÷T×1000=58.8×（ΔA+0.0169）2、細(xì)菌、細(xì)胞或組織GOD活力的計(jì)算（1）按蛋白濃度計(jì)算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2為一個(gè)酶活力單位。GOD（nmol/min/mgprot）=（ΔA+0.0169）÷2.8348×V反總÷（V樣×Cpr）×1000÷T=58.8×（ΔA+0.0169）÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2為一個(gè)酶活力單位。GOD（nmol/min/g鮮重）=（ΔA+0.0169）÷2.8348×V反總÷（W×V樣÷V樣總）×1000÷T=58.8×（ΔA+0.0169）÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2為一個(gè)酶活力單位。GOD（nmol/min/104cell）=（ΔA+0.0169）÷2.8348×V反總÷（500×V樣÷V樣總）×1000÷T=0.118×（ΔA+0.0169）V反總：反應(yīng)體系總體積，0.125mL；V樣：加入樣本體積，0.05mL；V樣總：加入提取液體積，1mL；T：反應(yīng)時(shí)間，15min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)，500萬。b.用96孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下回歸方程為y=1.4174x0.0169；x為H2O2標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y為ΔA。1、血清（漿）GOD活力的計(jì)算單位定義：每mL血清（漿）每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2為一個(gè)酶活力單位。GOD（nmol/min/mL）=（ΔA+0.0169）÷1.4174×V反總÷V樣÷T×1000=118×（ΔA+0.0169）2、細(xì)菌、細(xì)胞或組織GOD活力的計(jì)算（1）按蛋白濃度計(jì)算單位定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2為一個(gè)酶活力單位。GOD（nmol/min/mgprot）=（ΔA+0.0169）÷1.4174×V反總÷（V樣×Cpr）×1000÷T=118×（ΔA+0.0169）÷Cpr（2）按樣本鮮重計(jì)算單位定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2為一個(gè)酶活力單位。GOD（nmol/min/g鮮重）=（ΔA+0.0169）÷1.4174×V反總÷（W×V樣÷V樣總）×1000÷T=118×（ΔA+0.0169）÷W（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算單位定義：每一萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1nmolH2O2為一個(gè)酶活力單位。GOD（nmol/min/104cell）=（ΔA+0.0169）÷1.4174×V反總÷（500×V樣÷V樣總）×1000÷T=0.235×（ΔA