儀器分析第五章 毛細(xì)管電泳

第五章毛細(xì)管電泳主要內(nèi)容Highperformancecapillaryelectrophoresis,HPCE5.1毛細(xì)管電泳的根本原理5.2毛細(xì)管電泳儀5.3毛細(xì)管電泳的別離模式5.4影響分辨率的因素及操作條件選擇5.5毛細(xì)管電泳的應(yīng)用5.1毛細(xì)管電泳的根本原理在電解質(zhì)溶液中，位于電場(chǎng)中的帶電離子在電場(chǎng)力的作用下，以不同的速度向其所帶電荷相反的電極方向遷移的現(xiàn)象，稱之為電泳。由于不同離子所帶電荷及性質(zhì)的不同，遷移速率不同，可實(shí)現(xiàn)別離。1937年，Tiselius(瑞典)將蛋白質(zhì)混合液放在兩段緩沖溶液之間，兩端施以電壓進(jìn)行自由溶液電泳，第一次將人血清提取的蛋白質(zhì)混合液別離出白蛋白和α、β、γ球蛋白；發(fā)現(xiàn)樣品的遷移速度和方向由其電荷和淌度決定；第一次的自由溶液電泳；第一臺(tái)電泳儀；1948年，獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)；5.1.1概述經(jīng)典電泳分析利用電泳現(xiàn)象對(duì)某些化學(xué)或生物物質(zhì)進(jìn)行別離分析的方法和技術(shù)叫電泳法或電泳技術(shù)。按形狀分類：U型管電泳、柱狀電泳、板電泳；按載體分類：濾紙電泳、瓊脂電泳、聚丙烯酰胺電泳、自由電泳；傳統(tǒng)電泳分析：操作煩瑣，別離效率低，定量困難，無法與其他分析相比。1981年，Jorgenson和Luckas，用75μm內(nèi)徑石英毛細(xì)管進(jìn)行電泳分析，柱效高達(dá)40萬/m，促進(jìn)電泳技術(shù)發(fā)生了根本變革，迅速開展成為可與GC、HPLC相媲美的嶄新的別離分析技術(shù)——高效毛細(xì)管電泳。高效毛細(xì)管電泳分析

highperformancecapillaryelectrophoresis高效毛細(xì)管電泳在技術(shù)上采取了兩項(xiàng)重要改進(jìn)：一是采用了0.05mm內(nèi)徑的毛細(xì)管,；二是采用了高達(dá)數(shù)千伏的電壓。毛細(xì)管的采用使產(chǎn)生的熱量能夠較快散發(fā)，大大減小了溫度效應(yīng)，使電場(chǎng)電壓可以很高。電壓升高，電場(chǎng)推動(dòng)力大，又可進(jìn)一步使柱徑變小，柱長(zhǎng)增加，高效毛細(xì)管電泳的柱效遠(yuǎn)高于高效液相色譜，理論塔板數(shù)高達(dá)幾十萬塊/米，特殊柱子可以到達(dá)數(shù)百萬。電壓：0～30kV；別離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；〔可檢測(cè)到：10-19～10-21mol/L〕高效毛細(xì)管電泳的特點(diǎn)〔書P144有6點(diǎn)〕1.儀器簡(jiǎn)單、易自動(dòng)化電源、毛細(xì)管、檢測(cè)器、溶液瓶2.分析速度快、別離效率高在3.1min內(nèi)別離36種無機(jī)及有機(jī)陰離子，4.1min內(nèi)別離了24種陽離子；別離柱效：105～107/m理論塔板數(shù)；3.操作方便、消耗少，本錢低進(jìn)樣量極少，水介質(zhì)中進(jìn)行；4.應(yīng)用范圍極廣有機(jī)物、無機(jī)物、生物、中性分子；生物大分子等；分子生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、藥學(xué)、化學(xué)、環(huán)境保護(hù)、材料等；5、高靈敏度。6、進(jìn)樣量少。5.1.2高效毛細(xì)管電泳(HPCE)根本原理

電泳是指帶電離子在電場(chǎng)中的定向移動(dòng)，不同離子具有不同的遷移速度，遷移速度與哪些因素有關(guān)？當(dāng)帶電離子以速度ν

在電場(chǎng)中移動(dòng)時(shí)，受到大小相等、方向相反的電場(chǎng)推動(dòng)力和平動(dòng)摩擦阻力的作用。電場(chǎng)力：FE=qE

阻力：F=fν故：qE=fνq—離子所帶的有效電荷；E—電場(chǎng)強(qiáng)度；ν—離子在電場(chǎng)中的遷移速度；f—平動(dòng)摩擦系數(shù)(對(duì)于球形離子：f=6πηγ；γ—離子的表觀液態(tài)動(dòng)力學(xué)半徑；η—介質(zhì)的粘度；)所以，遷移速度：〔球形離子〕物質(zhì)離子在電場(chǎng)中差速遷移是電泳別離的根底。淌度μ：?jiǎn)挝浑妶?chǎng)強(qiáng)度下的平均電泳速度。電滲現(xiàn)象與電滲流1.電滲流現(xiàn)象當(dāng)固體與液體接觸時(shí)，固體外表由于某種原因帶一種電荷，那么因靜電引力使其周圍液體帶有相反電荷，在液-固界面形成雙電層，二者之間存在電位差〔Zeta電位〕。當(dāng)液體兩端施加電壓時(shí)，就會(huì)發(fā)生液體相對(duì)于固體外表的移動(dòng)，這種液體相對(duì)于固體外表的移動(dòng)的現(xiàn)象叫電滲現(xiàn)象。電滲現(xiàn)象中整體移動(dòng)著的液體叫電滲流〔electroosmoticflow，簡(jiǎn)稱EOF〕。2.HPCE中的電滲現(xiàn)象與電滲流石英毛細(xì)管柱，內(nèi)充液pH>3時(shí)，外表電離成-SiO-,管內(nèi)壁帶負(fù)電荷，形成雙電層。在高電場(chǎng)的作用下，帶正電荷的溶液外表及擴(kuò)散層向陰極移動(dòng)，由于這些陽離子實(shí)際上是溶劑化的，故將引起柱中的溶液整體向負(fù)極移動(dòng)，速度ν電滲流。3.HPCE中電滲流的大小與方向電滲流的大小用電滲流速度ν電滲流表示，取決于電滲淌度μ和電場(chǎng)強(qiáng)度E。即ν電滲流=μE電滲淌度取決于電泳介質(zhì)及雙電層的Zeta電勢(shì)，即μ=ε0εξε0—真空介電常數(shù)；ε—介電常數(shù)；ξ—毛細(xì)管壁的Zeta電勢(shì)。ν電滲流=ε0εξE實(shí)際電泳分析，可在實(shí)驗(yàn)測(cè)定相應(yīng)參數(shù)后，按下式計(jì)算ν電滲流=Lef/teoLef—毛細(xì)管有效長(zhǎng)度；teo—電滲流標(biāo)記物〔中性物質(zhì)〕的遷移時(shí)間。HPCE中電滲流的方向電滲流的方向取決于毛細(xì)管內(nèi)外表電荷的性質(zhì)：內(nèi)外表帶負(fù)電荷，溶液帶正電荷，電滲流流向陰極；內(nèi)外表帶正負(fù)電荷，溶液帶負(fù)電荷，電滲流流向陽極；石英毛細(xì)管；帶負(fù)電荷，電滲流流向陰極；改變電滲流方向的方法：〔1〕毛細(xì)管改性外表鍵合陽離子基團(tuán)；〔2〕加電滲流反轉(zhuǎn)劑內(nèi)充液中參加大量的陽離子外表活性劑，將使石英毛細(xì)管壁帶正電荷，溶液外表帶負(fù)電荷。電滲流流向陽極。4.HPCE中電滲流的流形電荷均勻分布，整體移動(dòng)，電滲流的流動(dòng)為平流，塞式流動(dòng)〔譜帶展寬很小〕；液相色譜中的溶液流動(dòng)為層流，拋物線流型，管壁處流速為零，管中心處的速度為平均速度的2倍〔引起譜帶展寬較大〕。5.HPCE中電滲流的作用電滲流的速度約等于一般離子電泳速度的5～7倍；各種電性離子在毛細(xì)管柱中的遷移速度為：ν+=ν電滲流+ν+ef陽離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；ν-=ν電滲流-ν-ef陰離子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流相反；ν0=ν電滲流中性粒子運(yùn)動(dòng)方向與電滲流一致；〔1〕可一次完成陽離子、陰離子、中性粒子的別離；〔2〕改變電滲流的大小和方向可改變別離效率和選擇性，如同改變LC中的流速；〔3〕電滲流的微小變化影響結(jié)果的重現(xiàn)性；在HPCE中，控制電滲流非常重要。HPCE中影響電滲流的因素

factorsinfluencedelectroosmosis1.電場(chǎng)強(qiáng)度的影響

電滲流速度和電場(chǎng)強(qiáng)度成正比，當(dāng)毛細(xì)管長(zhǎng)度一定時(shí)，電滲流速度正比于工作電壓。2.毛細(xì)管材料的影響不同材料毛細(xì)管的外表電荷特性不同，產(chǎn)生的電滲流大小不同；3.電解質(zhì)溶液性質(zhì)的影響〔1〕溶液pH的影響對(duì)于石英毛細(xì)管，溶液pH增高時(shí)，外表電離多，電荷密度增加，管壁zeta電勢(shì)增大，電滲流增大，pH=7，到達(dá)最大；pH<3，完全被氫離子中和，外表電中性，電滲流為零。分析時(shí)，采用緩沖溶液來保持pH穩(wěn)定?！?〕陰離子的影響在其他條件相同，濃度相同而陰離子不同時(shí)，毛細(xì)管中的電流有較大差異，產(chǎn)生的焦耳熱不同。緩沖溶液離子強(qiáng)度，影響雙電層的厚度、溶液黏度和工作電流，明顯影響電滲流大小。緩沖溶液離子強(qiáng)度增加，電滲流下降。4.溫度的影響毛細(xì)管內(nèi)溫度的升高，使溶液的黏度下降，電滲流增大。溫度變化來自于“焦耳熱〞；焦耳熱：毛細(xì)管溶液中有電流通過時(shí)，產(chǎn)生的熱量；HPCE中的焦耳熱與背景電解質(zhì)的摩爾電導(dǎo)、濃度及電場(chǎng)強(qiáng)度成正比。溫度每變化1，將引起背景電解質(zhì)溶液黏度變化2%～3%；5.添加劑的影響〔1〕參加濃度較大的中性鹽，如K2SO4，溶液離子強(qiáng)度增大，使溶液的黏度增大，電滲流減小?！?〕參加外表活性劑，可改變電滲流的大小和方向；參加不同陽離子外表活性劑來控制電滲流。參加陰離子外表活性劑，如十二烷基硫酸鈉〔SDS〕，可以使壁外表負(fù)電荷增加，zeta電勢(shì)增大，電滲流增大；〔3〕參加有機(jī)溶劑如甲醇、乙腈，使電滲流增大。HPCE中的參數(shù)與關(guān)系式

1.遷移時(shí)間〔保存時(shí)間〕HPCE兼具有電化學(xué)的特性和色譜分析的特性。有關(guān)色譜理論也適用。V—外加電壓；L—毛細(xì)管總長(zhǎng)度；2.別離效率〔塔板數(shù)〕在HPCE中，僅存在縱向擴(kuò)散，σ2=2Dt擴(kuò)散系數(shù)小的溶質(zhì)比擴(kuò)散系數(shù)大的別離效率高，別離生物大分子的依據(jù)。3.別離度影響別離度的主要因素；工作電壓V；毛細(xì)管有效長(zhǎng)度與總長(zhǎng)度比；有效淌度差。別離度可按譜圖直接由下式計(jì)算：5.2高效毛細(xì)管電泳儀儀器流程與主要部件電壓：0～30kV；別離柱不涂敷任何固定液；紫外或激光誘導(dǎo)熒光檢測(cè)器；〔可檢測(cè)到：10-19～10-21mol/L〕1.高壓電源〔1〕0～30kV穩(wěn)定、連續(xù)可調(diào)的直流電源；〔2〕具有恒壓、恒流、恒功率輸出；〔3〕電場(chǎng)強(qiáng)度程序控制系統(tǒng)；〔4〕電壓穩(wěn)定性：0.1%；〔5〕電源極性易轉(zhuǎn)換；2.毛細(xì)管柱〔1〕材料：石英：各項(xiàng)性能好；玻璃：光學(xué)、機(jī)械性能差；〔2〕規(guī)格：內(nèi)徑20～75μm，外徑350～400μm；長(zhǎng)度≤1m3.緩沖液池

化學(xué)惰性，機(jī)械穩(wěn)定性好；4.檢測(cè)器

要求：具有極高靈敏度，可柱端檢測(cè)；檢測(cè)器、數(shù)據(jù)采集與計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)處理一體化；

類型檢測(cè)限/mol特點(diǎn)紫外-可見10-13～10-15加二極管陣列，光譜信息熒光10-15～10-17靈敏度高，樣品需衍生激光誘導(dǎo)熒光10-18～10-20靈敏度極高，樣品需衍生電導(dǎo)10-18～10-19離子靈敏，需專用的裝置；毛細(xì)管電泳的進(jìn)樣方式進(jìn)樣量：毛細(xì)管長(zhǎng)度的1%-2%；納升級(jí)、非常??；1.流體力學(xué)進(jìn)樣方式〔1〕進(jìn)樣端加壓〔2〕出口端抽真空〔3〕虹吸進(jìn)樣

毛細(xì)管一端插入樣品瓶，加電壓；2.電動(dòng)進(jìn)樣方式進(jìn)樣不均：電歧視現(xiàn)象，淌度大的離子比淌度大的進(jìn)樣量大；離子喪失：淌度大且與電滲流方向相反的離子可能進(jìn)不去；特別適合黏度大的試樣；3.擴(kuò)散進(jìn)樣試樣通過擴(kuò)散作用進(jìn)入別離柱端口處。5.3別離模式八種別離類型，介紹常用的幾種；根據(jù)試樣性質(zhì)不同，采用不同的別離類型；每種機(jī)理的選擇性不同；一、毛細(xì)管區(qū)帶電泳

capillaryzoneelectrophoresis，CZE

帶電粒子的遷移速度=電泳和電滲流速度的矢量和。

正離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向一致，在負(fù)極最先流出；中性粒子：無電泳現(xiàn)象，受電滲流影響，在陽離子后流出；陰離子：兩種效應(yīng)的運(yùn)動(dòng)方向相反；ν電滲流>ν電泳時(shí),陰離子在負(fù)極最后流出,在這種情況下,不但可以按類別離,同種類離子由于差速遷移被相互別離。最根本、應(yīng)用廣的別離模式；二、毛細(xì)管凝膠電泳

capillarygelelectrophoresis，CGE將聚丙烯酰胺等在毛細(xì)管柱內(nèi)交聯(lián)生成凝膠。其具有多孔性，類似分子篩的作用，試樣分子按大小別離。能夠有效減小組分?jǐn)U散，所得峰型鋒利，別離效率高。蛋白質(zhì)、DNA等的電荷/質(zhì)量比與分子大小無關(guān)，CZE模式很難別離，采用CGE能獲得良好別離。特點(diǎn)：抗對(duì)流性好，散熱性好，別離度極高。無膠篩分技術(shù)：采用低粘度的線性聚合物溶液代替高粘度交聯(lián)聚丙烯酰胺。柱廉價(jià)、易制備。1.緩沖溶液中參加離子型外表活性劑，其濃度到達(dá)臨界濃度，形成一疏水內(nèi)核、外部帶負(fù)電的膠束。三、膠束電動(dòng)毛細(xì)管色譜〔MECC，MEKC〕

micellarelectrokineticcapillarychromatography，MEKC

在電場(chǎng)力的作用下，膠束在柱中移動(dòng)。

2.電泳流和電滲流的方向相反，且ν電滲流>ν電泳，負(fù)電膠束以較慢的速度向負(fù)極移動(dòng)；5.色譜與電泳別離模式的結(jié)合。3.中性分子在膠束相和溶液〔水相〕間分配，疏水性強(qiáng)的組分與膠束結(jié)合的較牢，流出時(shí)間長(zhǎng)；4.可用來別離中性物質(zhì)，擴(kuò)展了高效毛細(xì)管電泳的應(yīng)用范圍；1.根據(jù)等電點(diǎn)差異別離生物大分子的高分辨率電泳技術(shù)；2.毛細(xì)管內(nèi)充有兩性電解質(zhì)〔合成的具有不同等電點(diǎn)范圍的脂肪族多胺基多羧酸混合物〕，當(dāng)施加直流電壓〔6～8V〕時(shí)，管內(nèi)將建立一個(gè)由陽極到陰極逐步升高的pH梯度；3.氨基酸、蛋白質(zhì)、多肽等的所帶電荷與溶液pH有關(guān)，在酸性溶液中帶正電荷，反之帶負(fù)電荷。在其等電點(diǎn)時(shí)，呈電中性，淌度為零；四、毛細(xì)管等電聚焦

capillaryisoelectricfocusing，CIEF4.聚焦：具有不同等電點(diǎn)的生物試樣在電場(chǎng)力的作用下遷移，分別到達(dá)滿足其等電點(diǎn)pH的位置時(shí)，呈電中性，停止移動(dòng)，形成窄溶質(zhì)帶而相互別離；5.陽極端裝稀磷酸溶液，陰極端裝稀NaOH溶液；6.加壓將毛細(xì)管內(nèi)別離后的溶液推出經(jīng)過檢測(cè)器檢測(cè)；7.電滲流在CIEF中不利，應(yīng)消除或減小。5.5毛細(xì)管電泳的應(yīng)用陽離子分析遷移方向和電滲流方向一致；4.5min內(nèi)別離了24種金屬離子；陽極進(jìn)樣，陰極檢測(cè)；具有很高的靈敏度；陰離子分析陰離子電泳方向和電滲流方向相反、速度接近，分析時(shí)間長(zhǎng)、效率低；質(zhì)量小、電荷密度大的離子如：SO4-2、Cl-、F-等，電泳速率大于電滲流，陽極端流出，在陰極端無法檢測(cè)；參加電滲流改性劑，十六烷基三甲基溴化胺等，使電泳方向和電滲流方向一致，可在3.1min內(nèi)別離36種陰離子；陰極進(jìn)樣，陽極檢測(cè)；離子價(jià)態(tài)及存在形態(tài)分析；藥物分析

analysisofpharmaceutics檢測(cè)體液或細(xì)胞中某些代謝產(chǎn)物的分析；尿液中的氨基酸含量作為臨床診斷糖尿病的輔助手段；采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳方式，在11m