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文檔簡介
大鼠脊髓損傷后脊髓前角運動神經元的變化
在過去的20年里,通過各種骨髓損傷(ic)模型的出現(xiàn),對髓傷的研究也取得了很大進展。神經系統(tǒng)損傷修復后運動功能的恢復最終要依賴于運動終板結構的保存及其生理功能的恢復,由于周圍神經是由脊髓神經元、神經干、外周靶器官三者組成的統(tǒng)一整體,那么脊髓運動神經元中必然存在具有維持外周靶肌肉形態(tài)、發(fā)揮運動終板功能的神經調制質。許多研究已經證實,降鈣素基因相關肽(calcitoningene-relatedpeptide,CGRP)和乙酰膽堿酯酶(acetylcholineesterase,AChE)在該周圍神經環(huán)路中發(fā)揮著及其重要的作用。1材料和方法1.1小鼠來源及免疫雌性Wistar大鼠由首都醫(yī)科大學實驗動物中心提供,體重225~250g,隨機分成假手術組(A組,n=8)、切割型脊髓損傷組(B組,n=26)和撞擊型脊髓損傷組(C組,n=26)。小鼠來源抗人CGRP多克隆抗體、碘化乙酰硫代膽堿:Sigma公司;生物素化抗鼠IgG、辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素:中杉試劑公司。1.2方法1.2.1髓組織損傷模型大鼠用6%水合氯醛6ml/kg腹腔注射麻醉,俯臥位固定于鼠板上,顯微鏡下暴露T8、T9脊髓。①切割型脊髓損傷模型:將脊髓硬脊膜打開,使用顯微外科剪刀將一段長約3mm脊髓全部切除,然后用吸引器于軟膜下吸斷未橫斷的脊髓組織,確認此段無組織殘留;術中采用壓迫和電凝進行止血,9/0顯微縫合線縫合硬脊膜,分層縫合肌肉、皮膚,碘酒消毒切口。②撞擊型脊髓損傷模型:采用NYU(北京軍區(qū)總醫(yī)院全軍骨科中心實驗室進行)脊髓打擊器,沖擊重物為圓柱形,橫斷面直徑2.5mm,質量10g,從距離T9表面60mm高度自由下落造成重度撞擊傷模型。③假手術組模型:暴露T9段脊髓而不造成脊髓損傷。術后給予青霉素2×105U/次,2次/d,按摩膀胱2~3次/d,防止泌尿系統(tǒng)及其他并發(fā)癥的發(fā)生。1.2.2常規(guī)精-伊紅染色損傷組大鼠手術1周后,經4%多聚甲醛溶液灌注固定,取脊髓損傷處組織作常規(guī)石蠟包埋,縱行連續(xù)切片,片厚8μm,進行常規(guī)蘇木精-伊紅染色。1.2.3恒冷箱-20骨髓0.4重組切片采用Karnovsky-Roots直接法染色。術后1周、2周、4周、10周,B、C組大鼠各取6只灌注固定,取L2~L4脊髓節(jié)段進行恒冷箱(-20℃)脊髓橫行冰凍切片,片厚30μm。切片入AChE孵育液[含醋酸緩沖液(pH=6.3)6.5ml、碘化硫代乙酰膽堿5mg、0.1mol/L枸櫞酸鈉0.5ml、30mmol/L無水硫酸銅1.0ml、雙蒸水1.0ml、5mmol/L高鐵氰化鉀(GR及AR級)1.0ml],37℃孵育1.5~2h。蒸餾水洗3次,脫水,透明,樹膠封片。1.2.4免疫組化處理術后1周、2周、4周、10周,B、C組大鼠各取6只灌注固定,取L2~L4脊髓節(jié)段進行脊髓橫行冰凍切片,片厚30μm。0.01mol/LPBS-0.3%Triton-X100浸洗切片3次,每次5min,蒸餾水浸洗3遍,共10min。3%H2O2室溫孵育15min。0.1mol/LPBS-0.3%Triton-X100浸洗切片3次,共10min。5%山羊血清室溫孵育30min,直接入兔來源的CGRP多克隆抗體(1∶2000),4℃過夜。0.1mol/LPBS浸洗3遍,共10min。加入生物素化的山羊抗兔IgG(1∶300),室溫孵育3h。0.1mol/LPBS浸洗3遍,共10min。加入辣根過氧化物酶標記鏈霉卵白素(1∶300),室溫孵育3h。DAB顯色,室溫20min。DW終止顯色。蘇木素復染細胞核。脫水,透明,樹膠封片。1.2.5運動功能恢復情況采用聯(lián)合均分(averagecombinedscores,ACOS)神經行為學評定觀察大鼠后肢運動功能的恢復情況。大鼠術前適應行為學觀察場地,每周評分1次,評分時間為1min,固定于晚間7:00進行。1.2.6角運動神經元的形態(tài)人類學觀察和形態(tài)分析法應用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)測量AChE和CGRP陽性染色部位的透光度值。1.3統(tǒng)計方法數(shù)值以(xˉ±s)(xˉ±s)表示,采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析。2結果2.1術后1周后術后運動情況各組大鼠ACOS評分術前無顯著性差異(P>0.05),總分均可達到310分左右。A組大鼠術后評分無明顯變化;B組大鼠術后1周內后肢呈弛緩性癱瘓,爬行運動完全靠前肢帶動;2周后部分大鼠出現(xiàn)后肢單或雙關節(jié)的運動恢復;C組大鼠后肢在術后1周已經開始出現(xiàn)2個以上關節(jié)的大幅度運動。在隨后的觀察時間內,兩組大鼠均出現(xiàn)明顯的后肢運動功能恢復,C組大鼠ACOS評分始終高于B組,10周內每周評分結果兩兩比較均有非常顯著性差異(P<0.01)(圖1)。2.2髓組織損傷B組大鼠損傷處組織行HE染色,均證實為脊髓完全橫斷,切片上可見脊髓無明顯腫脹,切口較整齊,脊髓組織在損傷處直徑略微變細。在C組大鼠脊髓切片上,損傷處腹側可見軟脊膜完整,有約0.1~0.2mm厚正常白質結構殘留。2.3各組大鼠ache陽性染色部位的比較正常L2~L4脊髓的前角AChE陽性反應明顯,著色較深,可清晰看到前角運動神經元和部分神經元的突起(封三彩圖2.1)。術后1周,B、C組大鼠前角運動神經元AChE著色與正常組無明顯差異;術后4周,B組明顯變淺(封三彩圖2.2),C組稍有變淺(封三彩圖2.3);術后10周,B組大鼠前角運動神經元AChE著色仍較淺,但C組大鼠與4周時相比有了明顯的恢復。應用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)分析,B、C組術后1周其AChE陽性染色部位的透光度與正常組相比無顯著性差異(P>0.05);術后4周B、C組與正常組相比透光度明顯增加(P<0.01),B、C組間相比也有顯著性差異(P<0.05);術后10周C組大鼠雖然與B組相比有了明顯的恢復,但與正常大鼠相比仍有非常顯著性差異(P<0.01)(圖2)。2.4免疫組化染色正常大鼠于L2~L4節(jié)段染色可見前角運動神經元胞漿被清晰標記,輪廓清晰,染色較深(封三彩圖2.4)。B、C組大鼠術后1周CGRP免疫組化染色與正常組相比均明顯變淺(封三彩圖2.5、圖2.6);術后4周時,B組CGRP陽性染色仍較淺,C組CGRP免疫組化染色與1周時相比明顯加深;術后10周時,B組大鼠陽性染色神經元輪廓仍不清晰,且陽性標記的運動神經元變少,但C組陽性染色神經元輪廓較清晰,與正常組相比無明顯差異。應用LeicaQwin圖像分析系統(tǒng)分析,B、C組大鼠損傷1周后CGRP陽性染色部位的透光度值較正常組大鼠明顯增大(P<0.01),B、C兩組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05);術后4周及10周時,B組與正常時相比透光度明顯增加(P<0.01),而C組與正常組相比無統(tǒng)計學差異,B、C兩組間相比有顯著性差異(P<0.05)(圖3)。3c組不同處理治療股骨損傷后的前角運動神經元檢測大鼠胸髓完全橫斷未接受任何干預措施的情況下,仍存在后肢運動功能的自發(fā)性恢復。這種自發(fā)恢復的機制與損傷部位以下腰骶段脊髓內的低級步行控制中樞——中樞模式發(fā)生器(centralpatterngenerator,CPG)有關。許多動物的脊髓都存在CPG,由脊髓中間神經元組成,之間有神經信號通訊,其所構成的網絡可使脊髓在完全失去下行運動神經支配和上行感覺傳入的情況下產生一些節(jié)律性運動。2005年,Guertin提出了對胸髓損傷大鼠后肢運動功能進行半定量評價的ACOS評分,將大鼠后肢的運動分為交替和非交替兩種類型,關節(jié)的運動幅度分為3個等級,觀察大鼠在1min內交替和非交替運動的次數(shù),然后將以上指標整合起來進而得到一個數(shù)值,從而對脊髓損傷后大鼠的運動行為進行半定量分析。該方法與傳統(tǒng)的BBB評分相比,能從量上體現(xiàn)功能的細小恢復變化,且BBB定性評分法主要是為存在白質纖維殘留的不完全脊髓損傷而設計,對于評價脊髓完全橫斷損傷后的自發(fā)恢復不夠敏感,而ACOS評分對所有類型脊髓損傷均適用。通過評分發(fā)現(xiàn),兩種脊髓損傷后,后肢運動功能均出現(xiàn)一定的自發(fā)性恢復,損傷4周以內恢復較快,以后逐漸趨于穩(wěn)定,C組大鼠由于殘留纖維及CPG的雙重作用,后肢功能的恢復要明顯優(yōu)于B組。脊髓損傷后運動功能出現(xiàn)不同程度的自發(fā)性恢復,作為脊髓重要結構之一的前角運動神經元一定起著十分重要的作用。Nakamura研究表明,大鼠頸髓不完全性損傷后,前角運動神經元內AChE活性變化與運動功能恢復具有較強的相關性。AChE主要來源于運動神經元胞體,通過軸突快速運輸?shù)竭_神經終末,各種形式的AChE都能在脊髓運動神經元和骨骼肌細胞中找到;AChE活性的強弱可反映運動神經元的功能狀態(tài)。脊髓損傷后由于繼發(fā)的缺血、缺氧,導致了前角運動神經元內AChE的活性減弱。朱悅等研究發(fā)現(xiàn),脊髓不完全性損傷后脊髓前角運動神經元內的AChE活性減弱,但隨著時間的延長而有所回升。Krikorian發(fā)現(xiàn),大鼠脊髓橫斷傷后運動神經元胞體和纖維中AChE活性于術后14個月內持續(xù)減少,認為這種變化可能與脊髓損傷的程度較重有關。CGRP與脊髓損傷大鼠后肢運動功能的恢復也有著密切的關系。它在神經細胞胞體合成,在感覺和運動神經纖維中經逆行和順行軸漿運輸在神經元和神經末梢之間進行傳遞。CGRP能調節(jié)中樞神經系統(tǒng)及周圍神經系統(tǒng)的突觸傳遞。Marlier等觀察到,大鼠脊髓橫斷后,前角運動神經元中CGRP隨時間推移(2d~5個月)而減少,并且推測可能是由于脊髓橫斷后導致前角運動神經元失去了上運動神經元對其CGRP合成的促進信號,從而使得CGRP含量減少。本實驗顯示,在術后1周,損傷平面以下運動神經元CGRP免疫組化染色陽性部位的著色明顯變淺,這與前人報道基本相符。然而,我們還發(fā)現(xiàn),C組大鼠由于損傷的不完全性,術后4周CGRP在前角運動神經元的含量有了明顯的提高,與正常時相比無顯著性差異;脊髓損傷后早期損傷平面以下運動神經
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