姜黃素對脊髓鉗夾損傷大鼠組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

姜黃素對脊髓鉗夾損傷大鼠組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

脊柱損傷（pci）可導致不同程度的感覺、運動、括約肌和反射障礙，這在損傷平面以下的神經(jīng)控制下是不同的。國內(nèi)外科學家進行了大量的臨床和實驗研究，但仍缺乏確定的治療方法。目前甲基強的松龍(methylprednisolone,MP)沖擊療法治療脊髓損傷被認為有效,但大劑量MP可產(chǎn)生急性類固醇性肌病、消化道出血、傷口感染等副反應,使用也有嚴格的時間和劑量限制,在安全性和有效性方面存在質(zhì)疑。傳統(tǒng)中藥姜黃是姜科姜黃屬多年生草本植物姜黃(curcumalongaL.)干燥梗莖的提取物,主要含姜黃素類包括姜黃素(curcumin,CUR)、脫甲氧基姜黃素(desmethoxycurcumin)和雙脫甲氧基姜黃素(bisdesmethoxycurcumin)等,其中姜黃素是其最重要的活性成分,具有抗炎、抗菌、抗氧化、清除自由基、抗腫瘤等多種生物學效應,被用于癌癥、自身免疫疾病、糖尿病、動脈粥樣硬化、卒中、代謝性疾病等的治療。本實驗應用姜黃素治療脊髓鉗夾損傷大鼠模型,觀察大鼠脊髓損傷后組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的變化以及運動功能的恢復情況,探討其對SCI修復的作用,為臨床應用提供實驗依據(jù)。1材料和方法1.1動物組和材料1.1.1體質(zhì)量測定健康SPF級2月齡雌性Wistar大鼠72只(購自第三軍醫(yī)大學實驗動物中心)。體質(zhì)量(200±20)g。按隨機數(shù)字表法分為6組:單純損傷(SCI)組、姜黃素預處理(CUR+SCI)組、姜黃素(大、中、小)劑量(SCI+CUR300、SCI+CUR100、SCI+CUR30)組、甲強龍(SCI+MP)組。1.1.2合成工藝-設(shè)備姜黃素(Sigma),DMSO二甲基亞砜(Amresco),注射用甲基強地松龍(methylprednisolone,MP),規(guī)格40mg/支(天津藥業(yè)焦作有限公司,批號09032801)。注射用青霉素鈉,80萬U/支;0.9%生理鹽水250ml/瓶(西南藥業(yè)有限公司生產(chǎn),批號:10020005);氫氧化鈉、多聚甲醛、蔗糖、中性樹膠等為國產(chǎn)分析純試劑。1.1.3凍離心電鏡美國BeckmanANANTITM高速低溫冷凍離心機,恒冷冰凍切片機(GermanyLeicaCM900),手術(shù)顯微鏡(德國Leica),BX51顯微鏡(日本OLYMPUS公司)。1.2脊柱鉗傷口模型的生產(chǎn)1.2.1小骨肉質(zhì)瘤t9t10各組大鼠以4%水合氯醛(6ml/kg)經(jīng)腹腔注射麻醉,8%硫化鈉大鼠背部脫毛,無菌條件下俯臥位固定于立體定位儀上,以胸椎T9棘突為中心,背部正中切口,長3～5cm,鈍性分離皮下組織及肌肉,暴露T8～T10棘突和椎板,以用特制蚊式鉗小心咬除椎板,暴露硬脊膜,將寬度為1.0mm的動脈瘤夾(標定力量為50g)壓迫T9～T10脊髓1min,大鼠迅速出現(xiàn)擺尾反射,雙后肢及軀體回縮撲動后雙后肢癱瘓,提示造模成功。仔細止血并鹽水沖洗切口后,用絲線分層縫合肌肉及皮膚,模型制作完成。1.2.2動物治療及飼養(yǎng)大鼠適應性飼養(yǎng)1周后造模并給藥處理,姜黃素以少量DMSO助溶,用生理鹽水分別制備成300、100、30mg/kg的溶液。給藥:①SCI組:在脊髓損傷后,尾靜脈和腹腔注射給予等量生理鹽水,連續(xù)7d;②CUR+SCI組:脊髓損傷前30min腹腔緩慢推注CUR300mg/kg;③～⑤SCI+CUR治療組(大、中、小劑量):術(shù)后30min內(nèi)開始每天分別腹腔緩慢推注CUR300、100、30mg/kg,連續(xù)7d;⑥SCI+MP治療組:術(shù)后30min內(nèi)經(jīng)尾靜脈給予MP30mg/kg,此后5.4mg/(kg·h),持續(xù)23h,腹腔注射給予等量生理鹽水。所有動物在安靜、通風、清潔環(huán)境下由專業(yè)人員單籠飼養(yǎng)。動物飼養(yǎng)環(huán)境溫度22～25℃,相對濕度在40%～70%,明暗周期12h(6am～6pm),自由飲食,食物為商用大鼠顆粒飼料。每日定時膀胱區(qū)按壓排尿2次:分別在8:00、20:00。術(shù)后3d給予青霉素4萬U/只。實驗過程中對動物處置符合科學技術(shù)部《關(guān)于善待實驗動物的指導性意見》要求。1.3實驗方法受損脊髓組織病理學觀察;采用BBB評分法、斜板試驗測定后肢運動功能。1.3.1骨髓的內(nèi)標片制作造模后8周,各組隨機取6只,4%水合氯醛按300mg/kg體質(zhì)量腹腔注射麻醉后開胸,經(jīng)左心耳心臟插管,快速灌注生理鹽水200ml后待右心房溢出無色透明液體后改用4℃4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液(pH7.2～7.4)400ml灌流固定。解剖椎管取出損傷段脊髓,置于4%多聚甲醛液內(nèi)后固定12～24h,再依次置入20%、30%蔗糖(溶于0.1mol/L的PB中,pH7.2～7.4)脫水至組織塊沉入容器底時用OTC包埋取距夾傷處頭、尾各0.5cm范圍的脊髓,LeicaCM900冰凍切片機作縱行連續(xù)切片,貼于涂有多聚賴氨酸的蓋玻片上,片厚20μm,每隔6張取1張,每份標本制作8套切片,每套10張,-20℃保存。取1套行蘇木精-伊紅(HE)染色,以損傷嚴重段脊髓為中心取視野,光鏡下觀察病理學變化。1.3.2動物損傷前、后的損傷評分采用BBB(basso,beattieandbresnahan,BBB)評分法和斜板評分法分別在損傷前,損傷后1d、1～8周各周對實驗動物進行測定。1.3.2.術(shù)后運動情況分別將各組大鼠放置于直徑為2m的圓形平臺上,連續(xù)4min觀察其后肢運動情況。根據(jù)關(guān)節(jié)活動、前后肢協(xié)調(diào)運動、體質(zhì)量支撐、軀干及尾的位置等情況打分0～21分。0分代表后肢無活動,21分表示后肢活動正常。1.3.2.對大鼠的功能評價采用Rivlin法,將各組大鼠置于1塊有紋理的斜板上,當傾斜度由零度緩慢上升至大鼠停留原有位置而不跌落5s時讀取斜板度數(shù),每只大鼠重復測試3次取平均值。所有動物在術(shù)前進行功能評價,取得正常值范圍。評價前所有動物應檢查膀胱,防止因過度充盈而影響功能活動,動物盡量保持在活動范圍的中心區(qū)域活動。BBB評分結(jié)束30min后,再進行斜板實驗。觀察者均為對評分標準十分熟悉的非本組實驗人員,采用雙盲、雙人獨立評分,最后取均值。1.4x1顯微鏡下特殊組織學觀察HE染色切片在OLYMPUSBX51顯微鏡下以損傷段脊髓為中心取視野觀察病理學變化并拍照,應用全自動圖像處理及分析程序計算空洞面積。1.5統(tǒng)計處理實驗數(shù)據(jù)采用ˉx±s表示,多組數(shù)據(jù)間比較用單因素方差分析,兩組間比較采用t檢驗。使用SPSS13.0統(tǒng)計軟件統(tǒng)計分析。2結(jié)果2.1背側(cè)硬膜與周圍粘連大體標本見到脊髓損傷后8周,各組損傷處脊髓縮窄,以瘢痕連接,背側(cè)硬膜與周圍軟組織有明顯粘連。其中,SCI組粘連與縮窄最為明顯,SCI+CUR300黏連不明顯,縮窄最輕。其余各組介于兩者之間。2.2姜黃素治療髓內(nèi)損傷的臨床效果采用HE染色法在光學顯微鏡下觀察各組脊髓損傷的形態(tài)學改變,結(jié)果發(fā)現(xiàn):傷后2周,脊髓失去典型形態(tài),神經(jīng)元固縮、溶解、壞死,病變處出現(xiàn)軟化灶,炎癥反應重,髓鞘腫脹,大量空泡;損傷中心長梭形成纖維細胞樣細胞密度增加。姜黃素治療后,神經(jīng)元變性壞死減輕,中性粒細胞浸潤較少。提示姜黃素治療組較單純損傷組病變、炎癥反應輕,可以減輕繼發(fā)性脊髓損傷(圖1)。脊髓損傷后8周(圖2),光鏡下可見脊髓組織破壞,正常結(jié)構(gòu)喪失,多數(shù)神經(jīng)元胞核溶解,胞漿混濁,尼氏體不可見。紊亂的膠質(zhì)瘢痕攣縮,形成較大空腔。應用姜黃素后脊髓組織結(jié)構(gòu)比較清晰,較多的正常神經(jīng)元,細胞核稍濃聚,核膜完整,胞漿內(nèi)尼氏體可見,膠質(zhì)瘢痕較規(guī)則,組織空洞小于單純損傷組(P<0.05)(表1)。2.2各組大鼠術(shù)后運動功能及臨界角度的變化表2所示術(shù)前所有大鼠后肢BBB評分均為21分,損傷后1d時各組完全性后肢癱瘓,評分均為0分,傷后1周大鼠后肢BBB評分有所上升,但各組無顯著差異,術(shù)后第2周,姜黃素治療組、甲強龍治療組及姜黃素預處理組大鼠逐漸恢復后肢運動功能,此后各組評分姜黃素治療組均明顯高于甲強龍治療組,尤以大劑量組效果最好。姜黃素預處理組從4周開始恢復好于單純損傷組(P<0.05)。正常大鼠斜板實驗可達70°～75°,SCI后大鼠斜板實驗角度降低至20°提示造模成功。傷后7d開始各組大鼠的臨界角度均有所上升,姜黃素治療組、甲強龍治療組均高于單純損傷組,差異有顯著性意義(P<0.05),并且隨時間變化,各實驗組斜板實驗角度逐漸增加(表3)。與甲強龍治療組相比,姜黃素尤其是大劑量組后肢運動功能恢復更好。3姜黃素治療中的髓傷作用影響脊髓損傷后軸突再生的因素除了神經(jīng)元自身生長能力有限,缺乏有益的促進因素如雪旺細胞、神經(jīng)干細胞、營養(yǎng)因子等,還有抑制環(huán)境如脊髓繼發(fā)性損傷及膠質(zhì)瘢痕、空洞形成以及各種抑制再生的因子的存在。SCI的原發(fā)性損傷主要因機械壓迫、出血引起軸突斷裂,神經(jīng)元和膠質(zhì)細胞凋亡和微脈管系統(tǒng)的紊亂,隨后的幾小時至幾天出現(xiàn)血管和生物化學改變,出血性壞死,炎癥反應和延遲的脫髓鞘等繼發(fā)性損傷,最終導致脊髓缺血、變性、壞死,損傷處脊髓軟化和囊腔空洞形成。姜黃素在腫瘤、心臟、血管、肝臟等疾病動物實驗或細胞模型中有明顯的預防和治療效果,而對脊髓損傷的研究較為缺乏。鑒于臨床尚無有效治療藥物,且脊髓損傷在不同時間內(nèi)發(fā)生機制復雜,而姜黃素具有多時程、多靶點、多途徑,嘗試將其用于治療脊髓損傷。甲強龍是唯一被臨床Ⅲ期證明具有脊髓損傷神經(jīng)保護作用的藥物。本課題用不同劑量的姜黃素治療組與單純損傷組、姜黃素預處理組以及甲強龍治療組做比較,探討姜黃素對脊髓損傷后病理學的變化和神經(jīng)功能恢復的影響。本研究發(fā)現(xiàn),病理學上,傷后2周,繼發(fā)反應嚴重,應用姜黃素治療后壞死減輕,炎癥反應減弱。傷后8周,大體觀察粘連縮窄均不如單純損傷組明顯。光鏡下壞死組織降解液化形成空洞,周圍環(huán)繞致密的膠質(zhì)瘢痕,姜黃素治療組空洞明顯縮小。這提示姜黃素可抑制炎癥反應,減少SCI后組織壞死,縮小空洞范圍,有利于軸突的再生。行為學上,各組斜板實驗角度和相應BBB評分增長趨勢一致,但斜板評分在姜黃素干預后其角度在4周以前上升較平緩,4周后升高幅度加大,說明控制體位的能力在損傷前期恢復稍差,損傷后期恢復好。而姜黃素治療后BBB評分在2～4周上升較快,此時大鼠已可以行走以及支撐體質(zhì)量,前后肢的協(xié)調(diào)運動逐漸恢復。4周后評分升高趨于緩慢,說明精細運動的恢復是一個長期、緩慢的過程。通過對比發(fā)現(xiàn)姜黃素預處理和姜黃素治療均有較好的抑制空洞形成,促進脊髓損傷恢復的作用。表現(xiàn)為明顯的減少空洞面積和行為學評分的升高。姜黃素在神經(jīng)保護的作用優(yōu)于甲強龍,且效果隨藥物劑量增加而更加明顯。由于姜黃素的安全劑量大,人體實驗中以12g/d連續(xù)應用3個月被證實安全,無明顯不良反應。故認為本實驗的藥物濃度在姜黃素的安全劑量范圍之內(nèi)。新近有報道對姜黃素在脊髓損傷中的作用進行了探討,Lin等建立脊髓半橫斷傷模型,觀察到姜黃素對SCI后7d的功能有改善。Cemil等在用70g力的動脈瘤夾鉗夾脊髓1min后應用姜黃素,24h后檢測組織中酶類變化,行BBB評分,觀察到姜黃素能引起生物化學變化,改善脊髓損傷后的早期(24h)功能。由于80%的脊髓損傷是由挫傷而非橫斷傷引起,本課題采用的動脈瘤鉗夾損傷法可以模擬臨床骨折脫位或爆裂性壓縮骨折等造成的脊髓擠壓傷,組織病理學上兼具挫傷擠壓傷的特點,且可保持硬脊膜的完整性,更接近臨床。與Cemil等的結(jié)果不同,我們以50g力的動脈瘤夾造成的損傷在1d時各組大鼠后肢均完全癱瘓,BBB評分均為0分,至1周時間點略有改善,但各組無統(tǒng)計學差異。我們的行為學和形態(tài)學觀察的時間點涉及脊髓損傷后的急性期(1d、1周)和亞急性期(2～8周),對評價藥物對脊髓損傷動物的功能恢復更有說服力。本課題組長期致力于脊髓損傷的研究,已對膠質(zhì)瘢痕在損傷修復中的作用、血漿白蛋白對小膠質(zhì)細胞分泌前炎癥因子的作用、補體對膠質(zhì)瘢痕形的作用等進行了系列探討,本實驗是在以往研究的基礎(chǔ)上的進一步深化。姜黃素在動物實驗中被應用于包括阿爾茨海默病、癡呆、遲發(fā)性運動障礙、嚴重抑郁、癲癇等神經(jīng)變性和神經(jīng)精神疾病的研究,并被證實有效。我們前期的研究表明炎癥反應、補體