視網(wǎng)膜道的免疫組織化學(xué)研究

視網(wǎng)膜道的免疫組織化學(xué)研究

視覺損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重的視覺損傷和昏迷。視力損傷的病理基礎(chǔ)突出于視網(wǎng)膜圖像的損傷。以往的研究主要集中在延長節(jié)細(xì)胞的死亡，防止軸突變形，改善節(jié)細(xì)胞的生存，促進(jìn)視覺再生。斷端移植自體坐骨神經(jīng)后可觀察到視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞(retinalganglioncell,RGC)軸突與上丘重新建立有效的突觸聯(lián)系并恢復(fù)瞳孔對光反射,但精細(xì)視覺恢復(fù)不理想。這提示視覺功能恢復(fù)除注意節(jié)細(xì)胞與其下一級神經(jīng)元之間的突觸聯(lián)系外,視網(wǎng)膜內(nèi)部各神經(jīng)元之間的突觸聯(lián)系的完整性也可能有著重要作用。因此,本實(shí)驗(yàn)擬觀察視神經(jīng)切斷后視網(wǎng)膜內(nèi)部的突觸是否出現(xiàn)變化,選取視網(wǎng)膜雙極細(xì)胞作為研究對象,以Alpha蛋白激酶(PKC-α)和recoverin標(biāo)記不同類型雙極細(xì)胞,通過觀察雙極細(xì)胞及其軸突終末在視神經(jīng)損傷后的形態(tài)變化來探討視神經(jīng)損傷后在雙極細(xì)胞與RGC之間是否存在突觸可塑性變化。材料和方法1.動(dòng)物嘴唇要求健康成年SD大鼠41只,雌雄不限,由中南大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。要求動(dòng)物雙眼等大,角膜透明,瞳孔規(guī)則。隨機(jī)分為正常組(5只)、假手術(shù)組(6只)及實(shí)驗(yàn)組(30只)。實(shí)驗(yàn)組行右側(cè)眶內(nèi)視神經(jīng)切斷術(shù),術(shù)后分別存活3、5、7、14、21、28d,共6組,每組5只。2.視網(wǎng)膜電泳圖大鼠用10%水合氯醛腹腔注射(0.5ml/100g)麻醉。將其頭部固定于腦立體定位儀上,用0.25%氯霉素眼藥水滴眼,顯微鏡下暴露視神經(jīng),劃開視神經(jīng)鞘,于球后2mm處切斷視神經(jīng),切斷前預(yù)置一絲線于視神經(jīng)下方,切斷后將絲線從兩斷端間拉出以確證其已完全切斷,此時(shí)可見動(dòng)物瞳孔極度擴(kuò)大,注意避免損傷視網(wǎng)膜中央動(dòng)脈,術(shù)后用0.25%氯霉素眼藥水滴眼,動(dòng)物分別存活3、5、7、14、21、28d。假手術(shù)組除不切斷右眼視神經(jīng)外,其余步驟與實(shí)驗(yàn)組相同,動(dòng)物存活7d。3.蔗糖與pb液的耦合存活相應(yīng)時(shí)間后,斷頸法處死動(dòng)物,取雙側(cè)眼杯立即放入含4%多聚甲醛的PB液中4℃冰箱中固定24h,之后分別浸入含15%、30%蔗糖的0.1mol/L的PB中,pH7.4,ShanDon冰凍切片機(jī)切片(片厚15μm)。4.兔抗的合成切片用3%過氧化氫-甲醇室溫下孵育10min,0.01mol/LPBS清洗后,5%BSA37℃封閉1h后置于一抗(兔抗PKC-α1∶1000,SantaCruz或兔抗recoverin1∶1000,Chemicon)4℃冰箱中過夜,0.01mol/LPBS清洗后加入生物素化羊抗兔IgG,37℃孵育2h,PBS清洗后入1∶200ABC液,室溫下1h,0.05%DAB呈色,PBS終止反應(yīng),常規(guī)脫水、透明、中性樹膠封片。5.視網(wǎng)膜免疫組化每只動(dòng)物各取3張染色切片,每張切片上在Motic顯微鏡40倍物鏡下以視神經(jīng)為中心對稱取6個(gè)部位,用Motic公司imagesadvanced3.2圖像采集系統(tǒng)采集視網(wǎng)膜圖像,計(jì)數(shù)內(nèi)核層(innernuclearlayer,INL)的雙極細(xì)胞及內(nèi)網(wǎng)層(innerplexiformlayer,IPL)的免疫陽性位點(diǎn)。各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,并選擇單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,以P<0.05視為顯著性差異。結(jié)果1.pkc-陽性雙極細(xì)胞數(shù)目fig正常視網(wǎng)膜內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)層及節(jié)細(xì)胞層均呈PKC-α免疫陽性反應(yīng)。位于內(nèi)核層外側(cè)的PKC-α陽性細(xì)胞胞體呈錐形,排列密集,有分叉狀樹突伸向外網(wǎng)層,另有一長軸突伸向內(nèi)網(wǎng)層內(nèi)帶,終末為橢圓形的粗大顆粒狀結(jié)構(gòu),油鏡下觀察這些顆粒狀結(jié)構(gòu)與軸突相連,橢圓形,境界清晰,可判斷為軸突終扣(Fig.1)。對內(nèi)網(wǎng)層的PKC-α陽性產(chǎn)物計(jì)數(shù)并統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)切斷后5d內(nèi)網(wǎng)層陽性反應(yīng)軸突終扣數(shù)目開始明顯增多,14d時(shí)達(dá)到峰值,21、28d又逐漸減少。以上時(shí)間組PKC-α陽性軸突終扣數(shù)與正常組和假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01,表1),而內(nèi)核層外側(cè)PKC-α陽性雙極細(xì)胞數(shù)目各實(shí)驗(yàn)組與正常組間無明顯差異。組織切片行蘇木素復(fù)染后,節(jié)細(xì)胞計(jì)數(shù)顯示視神經(jīng)切斷后5d節(jié)細(xì)胞開始減少,這種趨勢一直持續(xù)到28d(數(shù)據(jù)未列出)。2.抗炎性軸突終扣正常視網(wǎng)膜外核層、內(nèi)核層、內(nèi)網(wǎng)層及節(jié)細(xì)胞層均有recoverin陽性產(chǎn)物表達(dá),表現(xiàn)為胞漿濃染,胞體境界清楚。內(nèi)核層陽性細(xì)胞胞體呈橢圓型,有樹突伸向外網(wǎng)層,另有一長的軸突伸向內(nèi)網(wǎng)層,末端膨大終止于內(nèi)網(wǎng)層的內(nèi)側(cè),表現(xiàn)為兩條平行顆粒狀條帶。油鏡下這些陽性顆粒與軸突末端相連,圓形或橢圓形,邊界清晰,可判斷為軸突終扣(Fig.2)。對內(nèi)核層的recoverin陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)并進(jìn)行單因素方差分析顯示:recoverin陽性細(xì)胞數(shù)在視神經(jīng)損傷后7d時(shí)開始減少,以后各時(shí)間點(diǎn)逐漸減少,與正常組比較差異均有顯著性(P<0.01)。內(nèi)網(wǎng)層可觀察到免疫陽性條帶在損傷早期逐漸增厚,21d及28d厚度逐漸變薄,其中的軸突終扣排列出現(xiàn)紊亂,兩條陽性條帶的界限逐漸模糊,甚至融合(Fig.2)。內(nèi)網(wǎng)層的recoverin陽性反應(yīng)軸突終扣在視神經(jīng)切斷后5d內(nèi)網(wǎng)層a、b亞層的軸突終扣數(shù)增多明顯,14d達(dá)到峰值,21d后開始減少,統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示各實(shí)驗(yàn)組陽性軸突終扣數(shù)目與正常組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,表2)。視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞突變PKC-α和recoverin能標(biāo)記雙極細(xì)胞中大部分類型,被廣泛地用作雙極細(xì)胞的標(biāo)記物,它們的表達(dá)變化可作為雙極細(xì)胞數(shù)目、功能變化的指標(biāo)。正常視網(wǎng)膜中PKC-α主要分布在ON-視桿型雙極細(xì)胞的樹突、胞體和與節(jié)細(xì)胞形成突觸的突觸前終末上,同時(shí)根據(jù)ON-雙極細(xì)胞的胞體位于內(nèi)核層的外半部分的特征判斷,本實(shí)驗(yàn)中位于視網(wǎng)膜內(nèi)核層外側(cè),排列緊湊,胞體呈錐形的細(xì)胞應(yīng)為ON型視桿型雙極細(xì)胞。正常視網(wǎng)膜中recoverin及其mRNA主要表達(dá)在外核層的視錐視桿細(xì)胞、ON型和OFF型視錐型雙極細(xì)胞及節(jié)細(xì)胞層中。視錐型雙極細(xì)胞的軸突終末分別在內(nèi)網(wǎng)層的a、b亞層與視網(wǎng)膜節(jié)細(xì)胞形成突觸,故在內(nèi)網(wǎng)層表現(xiàn)為兩條平行的顆粒帶。Recoverin可標(biāo)記大部分OFF型雙極細(xì)胞,這類雙極細(xì)胞的減少可能與它們和節(jié)細(xì)胞有直接突觸聯(lián)系相關(guān)。許多研究結(jié)果和本實(shí)驗(yàn)均表明視神經(jīng)切斷后5d節(jié)細(xì)胞開始大量死亡,7d和14d為兩個(gè)死亡高峰。而當(dāng)節(jié)細(xì)胞因視神經(jīng)切斷損傷大量死亡后,OFF型雙極細(xì)胞與節(jié)細(xì)胞的突觸聯(lián)系受到影響進(jìn)而中斷,導(dǎo)致細(xì)胞間的信息及神經(jīng)營養(yǎng)因子的來源受阻,因而recoverin表達(dá)下調(diào)。本實(shí)驗(yàn)中recoverin的表達(dá)下降模式進(jìn)一步說明了其受節(jié)細(xì)胞影響的可能性。視神經(jīng)損傷后PKC-α陽性雙極細(xì)胞數(shù)量變化不明顯,而recoverin陽性雙極細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,這兩種對視神經(jīng)損傷的不同應(yīng)答提示我們,視神經(jīng)損傷后,與節(jié)細(xì)胞形成直接突觸聯(lián)系的OFF型雙極細(xì)胞可能更容易發(fā)生跨神經(jīng)元的逆行性潰變,這尚需進(jìn)一步研究加以證實(shí)。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)視神經(jīng)切斷早期視網(wǎng)膜內(nèi)、外網(wǎng)層突觸發(fā)生標(biāo)記物synaptophysin的蛋白及mRNA表達(dá)增多,細(xì)胞色素氧化酶活性增高,但隨著動(dòng)物存活時(shí)間的延長,synaptophysin等物質(zhì)表達(dá)減少,細(xì)胞色素氧化酶活性下降。在本實(shí)驗(yàn)中,我們觀察到內(nèi)網(wǎng)層中PKC-α及recoverin的陽性產(chǎn)物在視神經(jīng)損傷早期增加,14d達(dá)到峰值后表達(dá)開始減少。雙極細(xì)胞在內(nèi)網(wǎng)層軸突終扣的分布也有改變,尤其以recoverin陽性雙極細(xì)胞的軸突終扣變化最為明顯。視神經(jīng)損傷后21d,內(nèi)網(wǎng)層