二氫青蒿素對牛型纖維蛋白誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎的影響

二氫青蒿素對牛型纖維蛋白誘導(dǎo)的大鼠關(guān)節(jié)炎的影響

風(fēng)疹炎（ra）是最常見的自身免疫性疾病之一。全世界人口的ra患兒達(dá)到1%。病變緩慢而異質(zhì)，并繼續(xù)惡化。本病主要累及外周小關(guān)節(jié),病變關(guān)節(jié)滑膜組織持續(xù)性增生、炎性細(xì)胞浸潤,引起關(guān)節(jié)軟骨和骨的破壞,導(dǎo)致關(guān)節(jié)畸形,引起功能障礙。RA的動(dòng)物模型為研究RA的病因、發(fā)病機(jī)制和治療方法提供了有力的工具。Ⅱ型膠原性關(guān)節(jié)炎與免疫反應(yīng)密切相關(guān),早在1977年Trentham等就檢測到患者的血清及關(guān)節(jié)滑液中存在Ⅱ型膠原抗體,并用牛Ⅱ型膠原成功誘導(dǎo)大鼠關(guān)節(jié)炎模型。研究表明,青蒿素類衍生物在多種疾病動(dòng)物模型上具有抗炎和免疫抑制活性的作用,對各類紅斑狼瘡以及過敏性接觸性皮炎有一定的療效。為了研究和獲得免疫抑制活性更高的化合物,一系列經(jīng)過結(jié)構(gòu)改造后合成的新型青蒿素類化合物相繼被報(bào)道。但到目前為止,有關(guān)青蒿素類衍生物免疫抑制活性的作用機(jī)制尚不完全清楚。二氫青蒿素是青蒿素類衍生物中的一種。本實(shí)驗(yàn)通過給易感的Wistar大鼠皮內(nèi)注射用弗氏完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原,誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型,隨后用二氫青蒿素對關(guān)節(jié)炎模型進(jìn)行干預(yù),觀察有無治療效果,以期為RA提供新的治療措施。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境雄性Wistar大鼠,體質(zhì)量170～189g,8周齡,24只[來源于四川大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(川)2009-09;實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證:SYXK(川)2009-45]。一級飼養(yǎng)環(huán)境,普通飼料喂養(yǎng),自由取食,飲水(自來水)。牛Ⅱ型膠原(collagenfrombovinenasalseptum,c7806,5mg,Sigma公司);弗氏完全佐劑(Freund’scompleteadjuvant,F-5881,10mL,Sigma公司);二氫青蒿素(四川省寄生蟲研究所門診部治療用藥)。1.2實(shí)驗(yàn)方法1.2.1皮內(nèi)注射免疫法ndf在無菌條件下,以0.1mol/L醋酸充分溶解牛Ⅱ型膠原(BCⅡ),配制濃度為2mg/mL,與等體積的弗氏完全佐劑充分混勻乳化(即每1mL含1mgBCⅡ)。免疫方法參考文獻(xiàn)并略加修改:于模型組大鼠尾根部分3～5點(diǎn)行皮內(nèi)注射免疫(0.3mL/只),首次免疫14d后(即第15d)以上述方法和劑量加強(qiáng)免疫;正常對照組以生理鹽水按同樣的方法和劑量注射。1.2.2動(dòng)物分組及藥物干預(yù)將24只大鼠分為2組,正常對照組5只,模型組19只。首次免疫后第52d按照關(guān)節(jié)炎指數(shù)將模型組分為模型空白組(7只)、二氫青蒿素組(12只)。按其分組分別進(jìn)行如下藥物干預(yù):正常對照組和模型空白組大鼠均以生理鹽水1.5mL/(kg·d)灌胃;而二氫青蒿素組以1.5mL/(kg·d)(即每1mL含20mg二氫青蒿素)灌胃。1.2.3大鼠膝關(guān)節(jié)畸形手術(shù)首次免疫后第52d開始給藥治療,治療28d后(即首次免疫后第80d)取材。大鼠以3%戊巴比妥1.33mL/kg腹腔麻醉,沿后肢正中縱行切開皮膚直至暴露出膝關(guān)節(jié),可見膝關(guān)節(jié)囊和髕骨,從膝關(guān)節(jié)囊上緣上1cm處剪斷下肢,分離剝除肌肉,迅速放入約為20倍標(biāo)本體積的10%中性福爾馬林固定,按照大鼠標(biāo)號標(biāo)記固定瓶,左、右肢體分開固定。1.2.4液體浸泡時(shí)間固定好的膝關(guān)節(jié)用約20倍標(biāo)本體積的10%依地酸鈉(EDTA)液浸泡,1～2d更換液體1次,時(shí)間2周。脫鈣完全標(biāo)準(zhǔn):大頭針能刺入標(biāo)本上下緣骨密質(zhì),感覺松軟無阻力。1.2.5觀察指標(biāo)1.2.5.1關(guān)節(jié)的x線攝影在藥物干預(yù)前將正常大鼠及模型組大鼠后肢關(guān)節(jié)在口腔科專用的小型X線攝像機(jī)上進(jìn)行放射學(xué)檢查。1.2.5.關(guān)節(jié)鏡結(jié)果在藥物干預(yù)前和干預(yù)后(即處死大鼠前)分別對大鼠的關(guān)節(jié)炎觀察評分,評定依據(jù)關(guān)節(jié)紅腫程度和范圍以及關(guān)節(jié)腫大變形情況。關(guān)節(jié)炎病變程度通常采用關(guān)節(jié)評分法:0分,沒有關(guān)節(jié)受累;1分,一個(gè)關(guān)節(jié)或一個(gè)關(guān)節(jié)區(qū)受累(出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫);2分,兩個(gè)關(guān)節(jié)或兩個(gè)關(guān)節(jié)區(qū)受累;3分,兩個(gè)以上關(guān)節(jié)區(qū)受累;4分,整個(gè)肢體受累。4個(gè)肢體評分相加得到每只大鼠在0～16范圍的關(guān)節(jié)炎總分。不同的關(guān)節(jié)分區(qū)為趾骨關(guān)節(jié)、跗骨間關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)。1.2.5.各級病變x型肉芽炎反應(yīng)關(guān)節(jié)經(jīng)過固定脫鈣,石蠟包埋,切片后行HE染色,顯微鏡下關(guān)節(jié)病理按照Masakazu分級法分為5級:0級,無關(guān)節(jié)炎;Ⅰ級,纖維素滲出為主伴滑膜內(nèi)皮細(xì)胞層次增多及少量小圓細(xì)胞浸潤;Ⅱ級,滑膜上皮增生,肉芽形成,成纖維細(xì)胞和毛細(xì)管增生明顯;Ⅲ級,肉芽組織增生明顯,破壞關(guān)節(jié)軟骨和骨組織;Ⅳ級,關(guān)節(jié)軟骨和骨被嚴(yán)重破壞或由纖維結(jié)締組織替代,伴隨關(guān)節(jié)腔的狹窄,纖維關(guān)節(jié)強(qiáng)直。1.3統(tǒng)計(jì)方法采用t檢驗(yàn)和秩和檢驗(yàn),α=0.05。2結(jié)果2.1不同次氫青蒿素干預(yù)前后大鼠并發(fā)癥的變化模型組大鼠體質(zhì)量增加、毛發(fā)光澤較正常對照組差,模型組初次注射BCⅡ后第3～5d注射部位針眼處出現(xiàn)小潰瘍,第7～10d可自愈。隨著模型的發(fā)展,初次免疫后第20d左右小關(guān)節(jié)開始出現(xiàn)輕度腫脹伴紅腫,第25d部分大鼠關(guān)節(jié)炎明顯且不能負(fù)重,50d左右關(guān)節(jié)炎達(dá)到高峰,部分關(guān)節(jié)呈急性炎癥表現(xiàn),表面皮膚充血粉紅發(fā)亮,活動(dòng)受限。關(guān)節(jié)炎呈對稱性,以后肢更明顯。二氫青蒿素干預(yù)后,大鼠關(guān)節(jié)炎有不同程度減輕;而模型空白組無改善。2.2術(shù)中的術(shù)中線性關(guān)節(jié)間隙,皮質(zhì)邊緣清晰正常對照組大鼠軟組織無腫脹陰影,踝關(guān)節(jié)、足跖趾關(guān)節(jié)及趾間關(guān)節(jié)間隙清晰可見,骨質(zhì)邊緣清晰(圖1A)。模型組大鼠見軟組織腫脹影,踝關(guān)節(jié)呈膨脹性破壞,足跖趾關(guān)節(jié)及趾間小關(guān)節(jié)間隙變窄模糊不清,骨質(zhì)破壞邊緣不清(圖1B)。2.3藥物干預(yù)前后的麻黃病大鼠自動(dòng)農(nóng)業(yè)保險(xiǎn)指標(biāo)比較正常對照組前后肢關(guān)節(jié)無紅腫,指/趾細(xì)長,掌背/足背肌腱清晰可見;藥物干預(yù)前模型組前后肢外露部分的關(guān)節(jié)包括指/趾間關(guān)節(jié)、掌指/跖趾關(guān)節(jié)、腕關(guān)節(jié)、踝關(guān)節(jié)明顯紅腫增粗,可見梭型腫脹,前掌及足背增厚,活動(dòng)受限。藥物干預(yù)后,二氫青蒿素組大鼠關(guān)節(jié)炎有不同程度的減輕;而模型空白組無改善。3組大鼠藥物干預(yù)前后的關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分見表1。模型空白組大鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分隨時(shí)間延長而增加(P<0.05);而二氫青蒿素組治療后關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分較治療前雖有所增加,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.4氫青蒿素組的病理學(xué)基礎(chǔ)正常對照組大鼠關(guān)節(jié)前滑膜細(xì)胞僅有1～2層,無增生,滑膜下未見炎性細(xì)胞浸潤,無血管增生,關(guān)節(jié)軟骨表面光滑,關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨質(zhì)無破壞,關(guān)節(jié)間隙正常。與正常對照組相比,模型空白組膝關(guān)節(jié)滑膜上皮細(xì)胞水腫,明顯增生有3～7層,并且形成許多小絨毛狀突起伸向關(guān)節(jié)腔?；は陆M織見大量炎性細(xì)胞(淋巴細(xì)胞)浸潤,纖維結(jié)締組織和血管增生,取代正常的滑膜下脂肪組織,毛細(xì)血管增生形成的血管翳破壞關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨質(zhì),關(guān)節(jié)腔變窄,關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)被破壞。二氫青蒿素組上述病變均不同程度減輕,主要表現(xiàn)在炎性細(xì)胞減少,少量纖維結(jié)締組織和毛細(xì)血管增生,關(guān)節(jié)腔較干凈,沒有骨質(zhì)破壞。見圖2。由表2可見,3組大鼠關(guān)節(jié)炎的病理分級差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),其中模型空白組、二氫青蒿素組與正常對照組比較,關(guān)節(jié)炎病理分級更高(P<0.05),二氫青蒿素組與模型空白組比較,病理分級則有所下降(P<0.05)。3青蒿素衍生物治療慢性熱炎的臨床研究RA是一種慢性致殘性疾病,主要通過滑膜組織的過度異常增殖、大量炎性細(xì)胞的浸潤、血管翳生成,對軟骨、骨和韌帶等關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)進(jìn)行性破壞,病變還可以引發(fā)關(guān)節(jié)外臟器病變。在整個(gè)病程中出現(xiàn)滑膜組織增生、炎癥、自身免疫等病理生理過程,且它們之間相互作用、相互關(guān)聯(lián),貫穿于RA的發(fā)病機(jī)制之中,形成了一個(gè)錯(cuò)綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)。膠原蛋白誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(CIA)模型的建立為深入認(rèn)識RA的發(fā)病機(jī)制提供了重要的手段,也為新的治療藥物的研究開發(fā)提供了載體。本實(shí)驗(yàn)通過弗氏完全佐劑乳化的牛Ⅱ型膠原免疫接種易感的Wistar雄性大鼠,誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型成功。從大鼠的關(guān)節(jié)紅腫及變形現(xiàn)象以及其后的關(guān)節(jié)X片、組織病理切片可以看到,大鼠關(guān)節(jié)炎癥明顯,關(guān)節(jié)滑膜增生,滑膜細(xì)胞由正常的1層增加到3～7層,同時(shí)有較多單個(gè)核細(xì)胞浸潤,并且出現(xiàn)關(guān)節(jié)軟骨及軟骨下骨的侵蝕破壞。大鼠的關(guān)節(jié)表現(xiàn)與人類的RA非常相似,符合科學(xué)研究的疾病模型要求。青蒿素是我國科研工作者在1971年從菊科植物黃花蒿葉中提取分離到的一種具有過氧橋的倍半萜內(nèi)酯類化合物。二氫青蒿素是在青蒿素基礎(chǔ)上又開發(fā)的衍生物,由于其毒副作用小,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于瘧疾的治療;并且它們還具有抗孕、抗纖維化、抗血吸蟲、抗弓形蟲、抗心律失常和腫瘤細(xì)胞毒性等作用。李菌等還發(fā)現(xiàn)二氫青蒿素可以顯著下調(diào)K562細(xì)胞的血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(VEGF)的表達(dá),并能抑制其誘導(dǎo)的血管新生,從而有抗血管生成的作用。有研究者報(bào)道青蒿素和它的衍生物有強(qiáng)力的免疫抑制活性。通過對一個(gè)新的水溶性青蒿素衍生物的體內(nèi)與體外實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)它對T淋巴細(xì)胞有抑制作用,強(qiáng)力抑制對伴刀豆球蛋白A引起的脾淋巴細(xì)胞增殖和混合淋巴細(xì)胞反應(yīng),體外實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞毒性低。在卵蛋白免疫小鼠中,口服青蒿素衍生物顯示劑量依賴性的針對卵蛋白的T細(xì)胞增殖反應(yīng),通過T細(xì)胞抑制抗卵蛋白抗體導(dǎo)致的白介素2與干擾素γ的產(chǎn)生。研究顯示青蒿素衍生物抑制CD3+細(xì)胞T細(xì)胞受體與CD28分子介導(dǎo)的幼稚T細(xì)胞增殖與白介素2和干擾素γ的產(chǎn)生;對有絲分裂原激活蛋白激酶(MAPK)磷酸化有突出的抑制作用,達(dá)到對Ras系統(tǒng)活化的抑制。研究結(jié)果顯示青蒿素衍生物具有成為治療T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫性疾病的藥物的潛力。本研究采用二氫青蒿素對CIA模型進(jìn)行干預(yù)治療。