大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)觀察

大鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞的免疫組織化學(xué)觀察

應(yīng)激反應(yīng)打破相關(guān)意識(shí)，并將大腦中的許多部位（例如，環(huán)狀神經(jīng)末梢、大腦室側(cè)神經(jīng)末梢、視力神經(jīng)末梢、弓狀神經(jīng)末梢、中腦導(dǎo)水管周圍的灰質(zhì)、蘭氏神經(jīng)末梢、，延髓質(zhì)和a2級(jí)神經(jīng)末梢。有關(guān)這些部位神經(jīng)元的反應(yīng)已有報(bào)道。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)重要成分之一,它的數(shù)量最多、分布廣泛、機(jī)能重要。已有研究證明星形膠質(zhì)細(xì)胞能敏感地對(duì)多種刺激(如外傷、疼痛、滲透壓的變化等)起反應(yīng)。但星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)束縛應(yīng)激刺激是否起反應(yīng),反應(yīng)有何特點(diǎn),目前尚未見詳細(xì)報(bào)道。本文用抗膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP,星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)記物)的免疫組織化學(xué)ABC法,對(duì)大鼠被束縛1、3或6h后,腦內(nèi)GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的反應(yīng)變化進(jìn)行了觀察。材料和方法1.飼養(yǎng)環(huán)境中h成年SD大鼠17只,體重240～300g,安靜、溫暖(20℃)、避強(qiáng)光的環(huán)境中飼養(yǎng)48h。隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組(n=15)和對(duì)照組(n=2)。前者束縛于小的塑料桶內(nèi)1,3或6h(n=5/每時(shí)點(diǎn)),塑料桶內(nèi)表面光滑,鼠頭可伸出。后者自由活動(dòng)。2.室至升主動(dòng)脈插管束縛的動(dòng)物解束30min后用過量1%戊巴比妥鈉(>40mg/kg,i.p.)麻醉,迅速開胸經(jīng)左心室至升主動(dòng)脈插管,先以100ml生理鹽水洗去血液,隨后用冷的(4C)含4%多聚甲醛的0.1mol/L磷酸緩沖液(PB,pH7.4)先快后慢灌流固定2h,然后取腦置于含30%蔗糖的PB液中(4℃)直至組織沉底。冰凍切片機(jī)連續(xù)冠狀切片,片厚30μm,切片分二套,置于0.01mol/LPBS中存放。3.羊抗兔的免疫與理化鑒定取1套切片在0.01mol/LPBS中漂洗后,入含0.3%TritonX-100的0.01mol/LPBS中浸泡30min(室溫)。然后入:(1)兔抗glialfibrillaryacidicprotein(GFAP)的抗體稀釋液(1:3000,Dako),孵育24h(室溫);(2)生物素標(biāo)記羊抗兔IgG(1:500,Sigma)放置2～4h(室溫);(3)生物素-卵白素-HRP復(fù)合物(ABC,1:500,Sigma)浸泡2—4h(室溫)。然后用葡萄糖氧化酶-DAB-硫酸鎳銨法呈色,陽性產(chǎn)物呈藍(lán)色。結(jié)束染色的切片經(jīng)漂洗后裱片、晾干、脫水、透明,封固后在光鏡下觀察并采集圖象。取實(shí)驗(yàn)組另1套切片,用0.01mol/LPBS替代兔抗免疫GFAP抗體的稀釋液,按ABC法進(jìn)行免疫組化染色,結(jié)果為陰性。5.對(duì)照組正常大鼠同時(shí)灌流固定、取材、進(jìn)行免疫組織化學(xué)反應(yīng)。結(jié)果1.gfap陽性反應(yīng)發(fā)生率低在正常大鼠孤束核(NTS)內(nèi)星形膠質(zhì)細(xì)胞其靜止型的特點(diǎn)是胞體小、突起細(xì)、數(shù)量少,GFAP陽性反應(yīng)較淺(Fig.A);束縛后星形膠質(zhì)細(xì)胞呈反應(yīng)型,GFAP陽性細(xì)胞的數(shù)量明顯增加,細(xì)胞體積增大、突起多而粗大、GFAP陽性反應(yīng)加深、硫酸鎳銨加強(qiáng)的免疫組織化學(xué)顯色為藍(lán)黑色(Fig.B)。2.細(xì)胞數(shù)量增加且呈反應(yīng)型對(duì)照組少量靜止型的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞散在分布于皮層、海馬、下丘腦的弓狀核、橋腦的藍(lán)斑、延髓的延髓內(nèi)臟帶(MVZ)等處。束縛組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加且呈反應(yīng)型,主要分布于:(1)前腦的扣帶回(Fig.C)、皮質(zhì)、隔外側(cè)核(Fig.D)、海馬、齒狀回、杏仁中央核(Fig.E);(2)丘腦和下丘腦:視上核和室旁核(Fig.F)、第三腦室室周區(qū)、弓狀核、丘腦室旁核、外側(cè)膝狀體、內(nèi)側(cè)膝狀體;(3)腦干:中腦的上丘淺層、下丘的皮質(zhì)部、中腦中央灰質(zhì)腹外側(cè)區(qū),橋腦的外側(cè)臂旁核和藍(lán)斑(Fig.G)、橋腦室周圍灰質(zhì)、A5區(qū)、中縫大核;延髓的耳蝸核、MVZ(Fig.H)等處。3.gfap陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的分布束縛1h解束后30min的大鼠,上述部位的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞表達(dá)最多。在束縛3h解束后30min的大鼠,上述部位的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量逐漸下降。另外如穹隆下器、下丘腦視上核、室旁核、第三腦室室周區(qū),中腦上丘、中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì),其分布也有變化。中腦上丘的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞由淺層轉(zhuǎn)移到丘系層,中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)內(nèi)的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞則主要分布于腹外側(cè)區(qū)。束縛6h解束后30min的大鼠,上述部位的GFAP陽性星形膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)一步下降。星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)元自由基因的影響應(yīng)激反應(yīng)(stressresponse)是機(jī)體對(duì)外界刺激(特別是傷害性刺激)的一種保護(hù)性反應(yīng)。應(yīng)激刺激的種類繁多,有機(jī)械、化學(xué)、電、生物、心理或精神性的,機(jī)體的應(yīng)激反應(yīng)各不相同,腦內(nèi)的反應(yīng)調(diào)節(jié)部位也不一致。據(jù)報(bào)道腦內(nèi)參與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)的區(qū)域主要是扣帶回,外側(cè)膈核,海馬和齒狀回,杏仁核簇,下丘腦→垂體→腎上腺軸(即HPA軸),其中下丘腦主要是室旁核、視上核、弓狀核等,中腦導(dǎo)水管周圍灰質(zhì)(PAG)、藍(lán)斑、A5區(qū)以及延髓內(nèi)臟帶等。許多神經(jīng)遞質(zhì)或神經(jīng)調(diào)質(zhì),如兒茶酚胺類、組織胺、5-羥色胺、Vasopressin、NeuropeptideY、CRF、ACTH、白細(xì)胞介素等參與應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)。星形膠質(zhì)細(xì)胞是腦內(nèi)數(shù)量最多,分布廣泛、機(jī)能復(fù)雜的一種細(xì)胞。以往的研究證明,星形膠質(zhì)細(xì)胞能對(duì)各種刺激起反應(yīng),參與腦機(jī)能的調(diào)節(jié)。本文觀察到束縛刺激后,腦內(nèi)上述部位的星形膠質(zhì)細(xì)胞起反應(yīng),成為反應(yīng)型星形膠質(zhì)細(xì)胞,具有胞體變大、突起變粗、抗GFAP染色較深的形態(tài)特點(diǎn)。它們與反應(yīng)型神經(jīng)元(另文報(bào)道)位于同一部位。這說明星形膠質(zhì)細(xì)胞可能參與束縛應(yīng)激反應(yīng)的調(diào)節(jié)。近20年來神經(jīng)生物學(xué)最重要的成果之一是發(fā)現(xiàn)腦內(nèi)存在廣泛分布的神經(jīng)元一膠質(zhì)細(xì)胞之間的信息網(wǎng),實(shí)現(xiàn)相互間的信息交流,膠質(zhì)細(xì)胞通過此網(wǎng)主動(dòng)參與腦內(nèi)機(jī)能的調(diào)節(jié)。本研究組在其他實(shí)驗(yàn)中觀察到星形膠質(zhì)細(xì)胞與神經(jīng)元之間特殊的超微結(jié)構(gòu)聯(lián)系,Connexi