青年摩雜一代黃牛催乳素釋放肽的分布

青年摩雜一代黃牛催乳素釋放肽的分布

1998年，日本科學(xué)家hinama從牛的大腦提取物中分離出啟乳液（prl）。因?yàn)樗芴禺愋缘卮龠M(jìn)蛋白質(zhì)（prl）的釋放，因此被稱(chēng)為壓力釋放因子。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)PrRP不僅能促進(jìn)催乳素的釋放,還具有調(diào)節(jié)體溫、睡眠、攝食、循環(huán)系統(tǒng)等許多生理功能。至今,有關(guān)PrRP的分布研究主要集中在人、大鼠、綿羊和魚(yú)上。為了解PrRP在青年摩雜一代水牛下丘腦-垂體-卵巢(HPO)軸的分布情況,以進(jìn)一步為PrRP在青年摩雜一代水牛的生殖調(diào)控和泌乳中的作用提供形態(tài)學(xué)資料,筆者運(yùn)用免疫組化染色對(duì)青年摩雜一代水牛HPO軸上PrRP的分布進(jìn)行研究。1試驗(yàn)方法和儀器1.1試驗(yàn)動(dòng)物1～2歲的雌性青年摩雜一代水牛5頭[摩拉水牛(父本)與廣西當(dāng)?shù)厮?母本)雜交第1代,購(gòu)于廣西欽州市靈山縣文利鎮(zhèn)及廣州佛山市三水金盛菜牛定點(diǎn)屠宰肉聯(lián)廠有限公司],體重200～400kg。1.2樣本采集將摩拉雜交水牛頸動(dòng)脈放血致死后迅速取下牛頭,打開(kāi)顱骨取出完整的帶腦硬膜的水牛腦,立即采集下丘腦、腦垂體和卵巢,經(jīng)生理鹽水沖洗,用4%中性多聚甲醛(pH7.4)固定24～48h。1.3主要試劑一抗:人抗PrRP多克隆抗體,美國(guó)PhoenixPharmaceuticals公司生產(chǎn),工作濃度為1∶200;二抗:即用型HRPPloymer通用酶標(biāo)二抗,天津津脈基因測(cè)繪技術(shù)有限公司生產(chǎn);顯色劑:葡萄糖和四鹽酸3,3′-二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒,福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn);修復(fù)液:檸檬酸鹽抗原修復(fù)液(pH6.0,粉劑),福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司生產(chǎn);其他試劑:過(guò)氧化氫、甲苯胺藍(lán)、蘇木精、伊紅、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、甲醛、二甲苯、石蠟、中性樹(shù)膠等,購(gòu)于南寧科析儀器成套有限公司。1.4組織切片取5頭雌性廣西摩拉雜一代水牛的下丘腦、垂體、卵巢在梯度乙醇中脫水,二甲苯透明,石蠟包埋。做下丘腦的矢狀連續(xù)切片,片厚8μm,隔5片取3片,得到3套切片。第1套用于免疫組化染色;第2套作陰性對(duì)照,確定試驗(yàn)的特異性反應(yīng);第3套用于Nissl染色或HE染色。下丘腦的切片做Nissl染色,用于下丘腦的核團(tuán)定位;卵巢和垂體的切片做HE染色,用于PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞分布定位的對(duì)照。1.5免疫組化染色3%過(guò)氧化氫處理20min,用PBS沖洗3次,每次5min,封閉后滴加一抗,37℃恒溫箱孵育90min,PBS沖洗3次,每次5min;滴加通用酶標(biāo)二抗,37℃恒溫箱孵育30min,PBS沖洗3次,每次5min,DAB顯色(在顯微鏡下觀察)。再用水洗10min,蘇木精染色2～5min,自來(lái)水洗1min,1%鹽酸乙醇分化數(shù)秒,自來(lái)水洗1min,烘干后,中性樹(shù)脂封片。1.6圖像分析采用德國(guó)LEICA公司DMRXAQ550JMS型顯微鏡及其圖像分析系統(tǒng)掃描免疫組化染色切片。圖像放大400倍于電腦顯示屏幕后,用圖像分析軟件進(jìn)行分析。在每組免疫組化染色切片中相同核團(tuán)隨機(jī)選取5個(gè)不同部位,在光鏡(400倍)下選定標(biāo)準(zhǔn)面積59142.67μm2(以下稱(chēng)單位面積)進(jìn)行拍照,應(yīng)用圖像分析系統(tǒng),對(duì)不同組織采取不同的觀測(cè)指標(biāo)。對(duì)下丘腦和卵巢的免疫組化染色切片,測(cè)量每張切片不同的單位面積內(nèi)免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞灰度值(以下簡(jiǎn)稱(chēng)灰度值)、細(xì)胞大小(測(cè)量其長(zhǎng)軸和短軸)、免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞占單位面積內(nèi)細(xì)胞總數(shù)的比率(以下簡(jiǎn)稱(chēng)陽(yáng)性細(xì)胞率);對(duì)腦垂體的免疫組化染色切片,測(cè)量每張切片各單位面積內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞灰度值、細(xì)胞大小、陽(yáng)性著色的面積占單位面積內(nèi)背景面積的百分比(以下簡(jiǎn)稱(chēng)陽(yáng)性面積率)。1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±S)(xˉ±S)表示,數(shù)據(jù)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素分析(one-wayANOVA),再進(jìn)行組內(nèi)多重比較。2結(jié)果與分析2.1prrp在血清中的形態(tài)和分布應(yīng)用免疫組織化學(xué)染色結(jié)合DAB顯色的切片,正常細(xì)胞背景無(wú)色或淺棕黃色,PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物呈現(xiàn)棕黃、棕褐色,呈均質(zhì)狀分布于細(xì)胞質(zhì)中;細(xì)胞核不著色,呈空泡狀。PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)元呈現(xiàn)深淺不等的棕黃、棕褐色,大部分神經(jīng)元胞體輪廓清晰,形狀呈多邊形、橢圓形、梭形、菱形或不規(guī)則形等,有的神經(jīng)元偶見(jiàn)明顯突起。細(xì)胞核空泡狀或淺棕黃色,核仁清晰呈深藍(lán)色,位于中央或偏向一側(cè)。在下丘腦中,還可見(jiàn)免疫反應(yīng)陽(yáng)性纖維呈黑褐色,絲狀或束狀的不規(guī)則散在,在不同核團(tuán)的分布各異。PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物在下丘腦各核團(tuán)的分布結(jié)果見(jiàn)表1。PrRP在青年摩雜一代水牛的下丘腦中主要分布在視上核(圖1),在后核分布最少(圖2)。PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性纖維廣泛分布于下丘腦中,在室旁核高度密集(圖3),在弓狀核、乳頭體核免疫反應(yīng)陽(yáng)性纖維密集,在視前核、前核、視交叉上核、腹內(nèi)側(cè)核、腹外側(cè)核、背內(nèi)側(cè)核、背外側(cè)核有少量免疫反應(yīng)陽(yáng)性纖維,在視上核無(wú)免疫反應(yīng)陽(yáng)性纖維。2.2腺垂體免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞在腦垂體中,只在腺垂體部和神經(jīng)垂體發(fā)現(xiàn)免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物。在光鏡下觀察,腺垂體部PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞細(xì)胞排列緊密,大部分融合成片(圖4)。免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞輪廓模糊,陽(yáng)性產(chǎn)物呈均質(zhì)分布于細(xì)胞質(zhì)中,呈現(xiàn)深棕褐色;細(xì)胞核較清晰,為藍(lán)色。細(xì)胞形狀以橢圓形為主,有三角形、不規(guī)則形等多種形態(tài),有的免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞有突起。在神經(jīng)垂體的上部,陽(yáng)性神經(jīng)纖維平行排列;到下部纖維交織成網(wǎng)(圖5)。用圖像分析系統(tǒng)分析腺垂體中的免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞,其平均灰度值為154.52±11.34,細(xì)胞短軸為6.52～9.91μm,細(xì)胞長(zhǎng)軸為9.65～16.26μm,平均細(xì)胞大小為8.13μm×11.90μm,陽(yáng)性面積率為(16.47±0.04)%。經(jīng)統(tǒng)計(jì),長(zhǎng)軸在12～15μm的陽(yáng)性細(xì)胞有92%;12μm以下的有5%;15μm以上的有3%。2.3免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞質(zhì)的形態(tài)通過(guò)觀察大量青年摩雜一代水牛的卵巢免疫組化染色切片,在卵泡和間質(zhì)中未見(jiàn)免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物,僅在黃體中觀察到免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物。在光鏡下觀察黃體,根據(jù)PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)的著色深淺可分為強(qiáng)陽(yáng)性、中等陽(yáng)性和弱陽(yáng)性3種(圖6)。強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞胞質(zhì)呈現(xiàn)棕褐色,免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物在胞質(zhì)內(nèi)呈均質(zhì)狀或顆粒狀,細(xì)胞輪廓清晰,細(xì)胞核呈藍(lán)色;弱陽(yáng)性細(xì)胞著色淺,免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物在胞質(zhì)內(nèi)分布不均,有空泡,細(xì)胞輪廓不清晰,細(xì)胞核空泡狀呈藍(lán)色,核仁較清晰;中等陽(yáng)性細(xì)胞介于以上2種細(xì)胞之間。從分布上看,強(qiáng)陽(yáng)性細(xì)胞主要分布在黃體的周邊,中等和弱陽(yáng)性細(xì)胞分散在整個(gè)黃體組織,與HE染色片對(duì)照顯示,免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物主要出現(xiàn)在大黃體細(xì)胞。3prrp免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物的分布研究表明,PrRP在青年摩雜一代水牛下丘腦中主要分布在視上核,其次是弓狀核、背內(nèi)側(cè)核等,在后核分布最少。從PrRP在以上核團(tuán)的分布及各核團(tuán)的主要功能,可推測(cè)出PrRP與加壓素神經(jīng)元和催產(chǎn)素神經(jīng)元有密切的關(guān)系,從形態(tài)學(xué)上提示了PrRP可能參與動(dòng)物機(jī)體的水代謝、生長(zhǎng)、排乳、生殖內(nèi)分泌等多種功能調(diào)節(jié)。PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)纖維在下丘腦中主要分布在室旁核、乳頭體核、弓狀核等核團(tuán),與Satoh等報(bào)道的PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性纖維主要分布在大鼠下丘腦的室旁核、視上核的結(jié)果相似。該試驗(yàn)結(jié)果中,PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物在垂體的分布,與Tokita等報(bào)道的大鼠的垂體細(xì)胞對(duì)PrRP具有親和性及Maruyama等報(bào)道的大鼠PrRP的結(jié)合位點(diǎn)存在腦、垂體、心臟、腎、睪丸等組織中有相似的結(jié)果。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果和HE染色切片,發(fā)現(xiàn)PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性產(chǎn)物主要在腦垂體中的嗜酸性細(xì)胞中表達(dá),從而提示了PrRP與催乳素分泌細(xì)胞和生長(zhǎng)激素細(xì)胞有密切的關(guān)系,與Iijima等報(bào)道的關(guān)于PrRP對(duì)生長(zhǎng)激素的分泌調(diào)節(jié)以及Hinuma等報(bào)道的PrRP具有促進(jìn)催乳素釋放的結(jié)果相似。在該試驗(yàn)中,在腺垂體內(nèi)未發(fā)現(xiàn)PrRP陽(yáng)性纖維,與Kelly等報(bào)道的PrRP陽(yáng)性纖維在金魚(yú)垂體的催乳素分泌細(xì)胞周?chē)植加忻黠@差異。大量的PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性纖維在神經(jīng)垂體有表達(dá)。參考Morales等報(bào)道的結(jié)果,該試驗(yàn)的結(jié)果提示了PrRP合成后,可能沿神經(jīng)細(xì)胞的軸突經(jīng)漏斗柄運(yùn)至神經(jīng)垂體,并在神經(jīng)垂體貯存、釋放。根據(jù)PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性細(xì)胞的灰度值、細(xì)胞平均大小,并結(jié)合HE染色切片,可見(jiàn)PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性反應(yīng)主要出現(xiàn)在大黃體細(xì)胞中,這一結(jié)果提示了PrRP可能與孕酮及松弛素有密切的關(guān)系。PrRP存在于黃體的試驗(yàn)結(jié)果,也提示了與Ibata等報(bào)道的PrRP對(duì)黃體生成素的分泌有促進(jìn)作用。由于該試驗(yàn)提取的卵巢樣本中只有一個(gè)卵巢是有黃體的,而且目前尚缺乏PrRP在不同種屬動(dòng)物卵巢的研究資料,所以PrRP在黃體的分布有待進(jìn)一步研究。根據(jù)該試驗(yàn)的研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)PrRP在青年摩雜一代水牛的下丘腦中主要分布在視上核,在后核分布較少。Maruyama等報(bào)道的PrRP在大鼠下丘腦中主要分布在背內(nèi)側(cè)核,PrRP免疫反應(yīng)陽(yáng)性神經(jīng)纖維主要分布在大鼠下丘腦室旁核、視上核,同時(shí)在神經(jīng)垂體中也含有少量的PrRP神經(jīng)纖維。Cur