大鼠椎間盤析出模型脊髓血流量的電針效應(yīng)

大鼠椎間盤析出模型脊髓血流量的電針效應(yīng)

椎間盤取出引起的運(yùn)動(dòng)機(jī)械障礙是人類和動(dòng)物健康的重要疾病。以電針為主的針灸療法在醫(yī)學(xué)臨床應(yīng)用廣泛,近來隨著寵物醫(yī)療的發(fā)展,在運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙性疾病,尤其是犬重癥椎間盤脫出/突出(intervertebraldiscextrusion/protrusion)也顯示出了良好的治療效果。電針療法對(duì)犬椎間盤病雖然療效顯著,但有關(guān)作用機(jī)理的研究鮮見報(bào)道。犬椎間盤脫出病的實(shí)質(zhì)是脊髓受椎間盤壓迫損傷,神經(jīng)傳導(dǎo)功能障礙。目前雖有關(guān)于脊髓損傷動(dòng)物模型的報(bào)道,但是這些模型難以準(zhǔn)確模擬臨床犬重癥椎間盤脫出/突出,且有關(guān)電針機(jī)理的研究以脊髓的形態(tài)學(xué)及神經(jīng)細(xì)胞損傷與修復(fù)相關(guān)基因的變化等為主。然而,隨著研究的深入,國(guó)內(nèi)外學(xué)者越來越關(guān)注脊髓損傷與修復(fù)過程中微血管所起的重要作用;另外從中國(guó)傳統(tǒng)獸醫(yī)學(xué)分析,氣血不足或氣滯血瘀是伴隨著犬椎間盤病各個(gè)階段的普遍現(xiàn)象,有待現(xiàn)代微觀指標(biāo)的進(jìn)一步驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)以大鼠制作椎間盤脫出模型模擬臨床急性發(fā)病犬,采用激光多普勒血流儀,研究該病脊髓的“氣、血”微觀指標(biāo)變化規(guī)律,進(jìn)而觀察電針對(duì)其的影響,為進(jìn)一步揭示動(dòng)物椎間盤脫出/突出的“氣、血”異常本質(zhì)與針灸理氣活血的效應(yīng)和機(jī)理積累資料。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房[scxk-軍清潔級(jí)SD雄性大鼠37只,體重為200~250g,來源于中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK-(軍)2007-004】,飼養(yǎng)于北京農(nóng)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房[SYXK(京)2010-0003]。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為空白對(duì)照組、對(duì)照組和電針組,每組數(shù)量分別為:9、14和14只。對(duì)照組和電針組制作椎間盤脫出模型,電針組接受電針治療,空白對(duì)照組只通過手術(shù)暴露脊髓,不進(jìn)行脊髓壓迫,也不施以任何治療。1.2治療方法與儀器激光散斑血流監(jiān)測(cè)視頻系統(tǒng)(PeriCamPSISystem,Perimed,Sweden),儀器相關(guān)參數(shù)設(shè)定:監(jiān)測(cè)激光與大鼠L1段脊髓垂直,探頭與L1段脊髓背側(cè)的監(jiān)測(cè)距離設(shè)定為15cm,分辨率為0.42mm,監(jiān)測(cè)區(qū)域設(shè)定面積為3.5mm2的圓,圓心位于L1段脊髓背側(cè)的中心,采樣頻率:每秒3幀圖像;東華牌電針治療儀(WQ-6F);毫針(蘇州天協(xié)針灸器械有限公司,規(guī)格0.2×25mm);微型擺鋸(surgicXT,NSK,Japan);戊巴比妥鈉(北京化學(xué)試劑公司,德國(guó)進(jìn)口分裝);注射用青霉素鉀、注射用硫酸鏈霉素(河北遠(yuǎn)征藥業(yè)有限公司);自制硅膠墊片(見圖1:一端呈楔形,長(zhǎng)4mm、寬2mm、厚1mm,取材于8Fr無菌雙腔導(dǎo)尿管,CreateMedicCo.,Ltd.,Japan)。1.3骨髓細(xì)胞的分離和模型大鼠的再分離大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉40mg/(kg·bw),麻醉后,俯臥保定,以胸腰段椎體為中心備皮、消毒。手術(shù)嚴(yán)格無菌操作,以第一腰椎(L1)為中心,在背正中線處切開皮膚,切口長(zhǎng)約2cm,常規(guī)方法暴露L1的棘突、椎板和左側(cè)關(guān)節(jié)突,用微型擺鋸打磨L1背側(cè)及左側(cè)椎板,再用眼科有齒鑷小心去除整個(gè)背側(cè)椎板及左側(cè)關(guān)節(jié)突,充分暴露L1段脊髓背側(cè);模型大鼠用自制的硅膠片從L1的左側(cè)將之填塞入T13段脊髓的左腹側(cè)位(如圖1所示),空白對(duì)照組大鼠同樣暴露脊髓不進(jìn)行壓迫,血流檢測(cè)完后分層縫合切口。術(shù)后每只大鼠肌內(nèi)注射青霉素鉀3萬U/(kg·bw),2次/日,連用3d。同時(shí)注射硫酸鏈霉素15mg/(kg.bw),2次/日,連用3d,單獨(dú)分籠飼養(yǎng),飲水和飼料正常供給。1.4病例普遍穴位的治療將28只椎間盤脫出模型大鼠隨機(jī)平分為對(duì)照組和電針組。參考課題組多年電針治療犬胸腰段椎間盤脫出病例常用的穴位并考慮動(dòng)物模型實(shí)際情況,選用足三里穴和趾間穴。毫針刺入穴位后,兩側(cè)的穴位上下為一組分別接通電針儀進(jìn)行治療(強(qiáng)度以大鼠能夠忍受為宜)。每日上午治療1次,每次20min。因臨床病例通常在電針治療2周后即有明顯好轉(zhuǎn),所以,初步將大鼠脊髓壓迫模型的治療時(shí)間也定為2周。1.5電針治療后小鼠骨髓血流量手術(shù)暴露對(duì)照組和電針組大鼠L1段脊髓后,以多普勒血流儀檢測(cè)脊髓壓迫前背側(cè)血流量10min。硅膠片壓迫造模后再次檢測(cè)大鼠L1段脊髓血流量10min。隨后,電針組大鼠進(jìn)行電針治療,時(shí)間為20min,同步記錄脊髓血流量。電針后,繼續(xù)檢測(cè)大鼠脊髓血流量10min。電針組每日治療1次,14d后,麻醉各組大鼠,暴露L1段背側(cè)脊髓,檢測(cè)脊髓血流量10min。1.6運(yùn)動(dòng)高能的判斷術(shù)后,分別在第1、4、7、14天采用大鼠BBB評(píng)分法對(duì)各組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能進(jìn)行評(píng)定(各種運(yùn)動(dòng)機(jī)能正常為滿分21分)。其中第1天在大鼠從麻醉狀態(tài)完全清醒后開始評(píng)分。1.7統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以表示,采用t-檢驗(yàn)/LSD多重比較分析對(duì)照組與電針組差異顯著性,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1大鼠腰椎前術(shù)后運(yùn)動(dòng)能力比較造模前大鼠后肢BBB評(píng)分結(jié)果皆為滿分21分,造模后第1天左、右后肢評(píng)分結(jié)果分別為(0.32±0.16)、(5.93±0.97),大鼠后肢均表現(xiàn)癱瘓。由圖2可知,與造模前比較,大鼠椎間盤脫出模型兩后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能顯著降低(P<0.001),造模成功。其中左后肢降低程度更大,這可能與硅膠片壓迫脊髓左側(cè)腹角有關(guān)?？瞻讓?duì)照組為手術(shù)通路對(duì)照組,手術(shù)后左、右后肢的評(píng)分皆為20.78±0.15,由圖3可知,手術(shù)后大鼠后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能與手術(shù)前比較沒有顯著性差異,說明手術(shù)通路本身對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)的影響可忽略不計(jì)。2.2大發(fā)作模型中的骨髓血流量改變由圖4可見,壓迫前脊髓血流量為(245.27±4.25),壓迫后為(161.67±6.49),呈極顯著下降(P<0.001)。2.3電針期間不同時(shí)間點(diǎn)髓壓血流量比較由圖5可見,電針組大鼠在脊髓壓迫后進(jìn)行的20min電針刺激過程中脊髓血流量由(164.70±8.58)上升至(198.33±7.49),與電針前和同時(shí)間段的對(duì)照組(155.41±9.15)比較,差異顯著(P<0.05)。電針結(jié)束后的10min脊髓血流量逐漸減小至(176.56±8.19),高于同時(shí)段對(duì)照組(154.27±9.32),差異無顯著性。電針連續(xù)治療14d后,脊髓血流量升高至(278.98±12.00),顯著高于脊髓壓迫后(P<0.01),并高于壓迫前水平(見圖4)。與壓迫后比較,對(duì)照組大鼠在14d后脊髓血流量也升高至(233.26±11.24),差異有顯著性(P<0.01),但顯著低于電針組(P<0.01)。2.4運(yùn)動(dòng)時(shí)機(jī)評(píng)分隨著時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)照組和電針組大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能都逐漸好轉(zhuǎn)。在第1天對(duì)照組和電針組左后肢運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分為(0.36±0.29)、(0.29±0.16),電針組低于對(duì)照組,差異無顯著性。由圖6可知,電針組大鼠在電針治療第4天開始,左后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能得分為(2.43±1.06),高于對(duì)照組的(1.57±1.07),其中在第7天、第14天評(píng)分結(jié)果為(4.36±1.38)、(9.86±1.87),與第1天比較,運(yùn)動(dòng)機(jī)能得分顯著(P<0.05)和極顯著(P<0.01)升高。對(duì)照組大鼠在第14天后,其左后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能得分為(4.86±1.60),與第1天比較也顯著升高(P<0.01),但仍顯著低于第14天電針組大鼠得分(P<0.01)。由圖7可知,電針組大鼠在電針治療第1天開始,右后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能得分(6.29±1.55),高于對(duì)照組(5.57±1.20),差異無顯著性。其中在第7天、第14天得分為(13.57±1.26)、(16.07±1.08),與第1天比較,差異有顯著性(P<0.05)。對(duì)照組大鼠右后肢運(yùn)動(dòng)得分也逐漸增加,在第14天其右后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能得分為(11.79±1.53),顯著高于第1天、第4天(P<0.05),但仍顯著低于第14天電針組大鼠得分(P<0.05)。3激光散斑血流監(jiān)測(cè)是治療特殊患者的手術(shù)方法椎間盤脫出在獸醫(yī)臨床是引起犬癱瘓的常見病,其本質(zhì)是脫出的髓核及其炎性反應(yīng)物質(zhì)壓迫脊髓或神經(jīng)根引起的損傷,影響上行/下行運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維信號(hào)傳導(dǎo),進(jìn)而導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙。近年來,脊髓損傷恢復(fù)一直是國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn),利用動(dòng)物模型來研究脊髓損傷的機(jī)理報(bào)道較多,主要有脊髓打擊法、鉗夾法、切割法、動(dòng)脈阻塞法及光化學(xué)誘導(dǎo)法等。而脊髓損傷后微血管的損傷又是脊髓二次損傷的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。因此,眾多學(xué)者越來越關(guān)注脊髓生理/病理狀態(tài)下微血管相關(guān)功能的變化,其中,脊髓血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)是一個(gè)重要技術(shù)。目前,脊髓血流動(dòng)力學(xué)指標(biāo)的檢測(cè)方法主要有:氫清除法、微球法、閉合性脊髓窗技術(shù)和激光多普勒法。其中,氫清除法需要將微電極插入到脊髓內(nèi)部,對(duì)脊髓有一定的損傷,且檢測(cè)的范圍較局限。微球法需要將放射性核素或熒光素標(biāo)記的微球通過心臟注入循環(huán)系統(tǒng),還需將檢測(cè)的脊髓節(jié)段取出,分光光度計(jì)測(cè)定脊髓中微球的含量,而且放射性核素污染環(huán)境,各種微球都有造成血栓的可能性。閉合性脊髓窗技術(shù)可以觀察到血管直徑的變化、白細(xì)胞黏附和紅細(xì)胞流速,但是這種技術(shù)操作復(fù)雜,對(duì)儀器要求高,推廣使用有一定難度。激光多普勒法無需造影劑,也無需掃描,能以較高的空間分辨率和時(shí)間分辨率非侵入、很好地實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)檢測(cè)脊髓血流。由此可見,激光多普勒法是較為適宜的檢測(cè)脊髓血流的方法,且能實(shí)時(shí)或長(zhǎng)期檢測(cè)電針對(duì)脊髓血流的影響。使用該技術(shù)的眾多研究結(jié)果表明,上述脊髓損傷模型伴隨的顯著的微循環(huán)血流灌注障礙是脊髓損傷的重要機(jī)制。在椎間盤脫出狀態(tài)下脊髓血流的變化鮮有研究,針灸對(duì)其的影響也未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)采用的激光散斑血流監(jiān)測(cè)視頻系統(tǒng)是激光多普勒微循環(huán)血流灌注檢測(cè)的最新技術(shù),該系統(tǒng)能夠非接觸、無傷害實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠脊髓血流,具有較高的分辨率,能在同一感興趣區(qū)域提供實(shí)時(shí)曲線和視頻記錄,是目前定量觀測(cè)脊髓微循環(huán)血流的最佳選擇。犬重癥椎間盤脫出時(shí)髓核進(jìn)入椎管后其對(duì)脊髓的壓迫持續(xù)存在,打擊等短時(shí)間的損傷不能反映實(shí)際情況。為此,課題組模擬臨床犬實(shí)際,采用自制硅膠墊片在大鼠T13椎腔填充壓迫脊髓腹側(cè)角部,采用大鼠BBB評(píng)分法對(duì)大鼠后肢運(yùn)動(dòng)功能進(jìn)行評(píng)定,試驗(yàn)結(jié)果表明模型組大鼠后肢均出現(xiàn)嚴(yán)重運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙,建立了椎間盤脫出癱瘓模型。多普勒血流儀檢測(cè)結(jié)果表明壓迫后脊髓血流量極顯著降低(見圖4),以上結(jié)果提示我們建立的大鼠椎間盤脫出模型已達(dá)到臨床犬椎間盤脫出病例具有的肢體萎弱、氣血壅滯的癥狀。另外,造模后大鼠兩后肢運(yùn)動(dòng)機(jī)能障礙程度不一,左后肢較右后肢嚴(yán)重,原因可能與僅壓迫脊髓一側(cè)腹角有關(guān)。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為:“凡病,皆由氣血壅滯,不得宣通,針以開道之,灸以溫暖之”,指出經(jīng)脈氣血的異常是疾病發(fā)生發(fā)展的主要因素,而針灸主要通過“通經(jīng)活絡(luò),活血化瘀,調(diào)節(jié)氣血”發(fā)揮治療效應(yīng)。椎間盤病對(duì)中國(guó)傳統(tǒng)獸醫(yī)學(xué)來講是一個(gè)相對(duì)較新的領(lǐng)域,按照傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)理論分析,其屬于“腰腿痛”、“痹證”和“痿證”的范疇。《黃帝內(nèi)經(jīng)》論痿,提出治痿獨(dú)取陽明。對(duì)自制大鼠椎間盤脫出模型,我們選用了治療犬椎間盤脫出病例常用的后肢陽明胃經(jīng)的后三里穴和趾間穴,結(jié)果表明無論是造模后即刻電針還是電針治療兩周后,脊髓血流量均顯著提高,與吳永剛等研究結(jié)果一致。Tsuchiya等研究表明針刺手掌和前臂可以顯著促進(jìn)同側(cè)腋靜脈NO的產(chǎn)生,同側(cè)手掌的皮下血流也有顯著升高。因NO具有擴(kuò)張血管的作用,因此,電針后三里穴和趾間穴提高大鼠椎間盤脫出模型脊髓血流量可能與脊髓局部血管組織產(chǎn)生NO有關(guān),需進(jìn)一步研究。針灸的基本原理是通過調(diào)動(dòng)和調(diào)節(jié)機(jī)體固有機(jī)能而實(shí)現(xiàn)防病治病作用。在椎間盤病導(dǎo)致的脊髓損傷的恢復(fù)過程中應(yīng)該也不例外。本實(shí)驗(yàn)大鼠在模型制作后均造成重度癱瘓,隨著時(shí)間的延長(zhǎng),對(duì)照組有明顯的恢復(fù)表現(xiàn),但在14d療程結(jié)束時(shí),結(jié)果顯示電針能顯著促進(jìn)癱瘓大鼠后肢運(yùn)動(dòng)能力的提高。針對(duì)犬胸腰段椎間盤病,課題組經(jīng)多年臨床實(shí)踐確定了以腎俞、膀胱俞和后三里與趾間穴組為主的電針治療方案,臨床效果理想。對(duì)椎間盤脫出IV級(jí)癱瘓(完全癱瘓,有深部痛覺)病例在2周內(nèi)恢復(fù)行走的有效率達(dá)到93%以上,遠(yuǎn)遠(yuǎn)領(lǐng)先于西醫(yī)保守療法,并超過手術(shù)療法。對(duì)V級(jí)癱瘓(完全癱瘓,無深部痛覺)病例(發(fā)病超過48h,西醫(yī)放棄治療者)的有效率也達(dá)到71%,說明針灸療法對(duì)嚴(yán)重脊髓損傷的V級(jí)癱瘓病例也有較高的治療價(jià)值。本試驗(yàn)電針對(duì)大鼠椎間盤脫出模型的治療效果與臨床療效基本一致。椎間