廣西本地黃牛催產(chǎn)素的分泌釋放途徑

廣西本地黃牛催產(chǎn)素的分泌釋放途徑

催產(chǎn)素（ot）是核電站中發(fā)現(xiàn)并澄清結(jié)構(gòu)的神經(jīng)遺產(chǎn)，由腦神經(jīng)內(nèi)側(cè)的大細胞產(chǎn)生。這是一種由九個氨基酸組成的特殊結(jié)構(gòu)的環(huán)狀激素，分子質(zhì)量為1047u。OT在中性或堿性溶液中容易被破壞,而在酸性溶液中較為穩(wěn)定,在體內(nèi)容易被消化酶和血液中的催產(chǎn)素酶所破壞。荷蘭著名大腦研究學者Swaab等首次利用免疫組化方法對小鼠的下丘腦催產(chǎn)素能神經(jīng)元進行了定位描述。陳樹林等用原位雜交方法對成年發(fā)情期奶山羊下丘腦催產(chǎn)素及其表達測定發(fā)現(xiàn)了催產(chǎn)素mRNA的廣泛存在。越來越多的研究結(jié)果表明,OT樣神經(jīng)元廣泛存在于下丘腦中的視上核、室旁核、弓狀核等27個核區(qū)。另外,研究還發(fā)現(xiàn)下丘腦OT可經(jīng)神經(jīng)垂體、第三腦室、血管3條途徑釋放,然后經(jīng)血液循環(huán)最終作用于靶細胞而發(fā)揮生理作用。OT是一個最早被弄清楚的氨基酸序列,它有43種轉(zhuǎn)錄體,并且是能夠人工合成的肽類激素。隨后,對OT的研究進展極快,OT不僅能調(diào)節(jié)神經(jīng)內(nèi)分泌,而且與繁殖及育幼相關(guān)的行為和復(fù)雜的社會行為密切相關(guān)。目前除了已明確哺乳動物神經(jīng)垂體存在OT外,在其他許多脊椎動物的神經(jīng)垂體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)存在著一些結(jié)構(gòu)和功能方面與OT類似的激素。迄今為止,關(guān)于OT的研究大多集中在OT的生理功能、臨床應(yīng)用的研究,基礎(chǔ)研究的資料較少;關(guān)于OT在不同動物種屬中基礎(chǔ)研究方面,鼠和奶山羊的資料比較完整,而有關(guān)OT在牛體內(nèi)的報道較少,國內(nèi)外尚無OT在廣西本地水牛下丘腦-垂體-卵巢軸的研究報道。鑒于此,筆者進行了OT在廣西本地水牛下丘腦-垂體-卵巢軸的免疫組化定位的差異性研究,為培育廣西奶水牛提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。1材料和方法1.1試驗動物1～2年齡廣西本地青年水牛(沼澤型)5頭,臨床健康,雌性,購于廣西壯族自治區(qū)南寧市肉聯(lián)廠,體重約300kg。1.2方法1.2.1免疫組化試驗將廣西本地水牛頸動脈放血致死后迅速取下牛頭,打開顱腔取出完整牛腦,分離下丘腦,用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定3d;將取出的下丘腦在梯度酒精中脫水,二甲苯透明,石蠟包埋;將包埋好的蠟塊作矢狀連續(xù)切片,片厚5μm,隔6取2,得到3套切片。第1套用于免疫組化;第2套作免疫組化陰性對照,用來確定試驗的特異性反應(yīng);第3套作Nissl染色,用于下丘腦的核團定位。核團定位參照BenGreenstein編寫的《ColorAtlasofNeuroscienceandNeurophsiology》、田九疇主編的《畜禽神經(jīng)解剖學》、張培林主編的《神經(jīng)解剖》及潘堂峰碩士論文《摩拉雜交水牛和廣西本地水牛下丘腦神經(jīng)核團形態(tài)學及細胞構(gòu)筑比較研究》中的描述。1.2.2有機熱試驗將廣西本地水牛頸動脈放血致死后迅速取下牛頭,打開顱腔剝離腦硬膜并暴露腦神經(jīng),切斷視交叉前部2條視神經(jīng)、腦神經(jīng)和垂體漏斗,暴露大腦底,切開鞍膈,取出牛腦,分離并取出垂體,用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定12h。打開腹腔,迅速取出卵巢,延其縱軸將卵巢一分為二,用4%多聚甲醛磷酸緩沖液固定12h。垂體和卵巢的處理同下丘腦。第1套用于免疫組化;第2套作陰性對照,用來確定試驗的特異性反應(yīng);第3套作HE染色,用于常規(guī)組織學觀察。1.2.3催化劑的制備將下丘腦、垂體、卵巢等組織切片依次浸入下列試劑:二甲苯(I)10min→二甲苯(Ⅱ)10min→二甲苯(Ⅲ)10min→100%乙醇5min→95%乙醇5min→85%乙醇5min→70%乙醇5min→60%乙醇5min→50%乙醇5min→蒸餾水洗2min→PBS沖洗3次,每次5min→高壓修復(fù)1～1.5min→冷卻PBS沖洗3次,每次5min→3%過氧化氫20min→PBS沖洗3次,每次5min→封閉→滴加一抗,37℃恒溫箱孵育90min→PBS沖洗3次,每次5min→滴加二抗,37℃恒溫箱孵育30min→PBS沖洗3次,每次5min→DAB顯色(在顯微鏡下觀察)→水洗10min→蘇木精染色2～5min→自來水洗1min→1%鹽酸酒精分化數(shù)秒→自來水洗1min→烘干→中性樹脂封片。陰性對照試驗以0.01mol/LPBS液(pH值7.4)替代一抗,其他步驟同上。1.2.4用于檢測圖像面積、細胞數(shù)病理圖像分析儀由數(shù)碼顯微鏡及LEICQWIN圖像分析系統(tǒng)2部分組成,圖像分析軟件可以測量數(shù)量、直徑、面積、灰度值、光密度等指標。將制得的切片在數(shù)碼顯微鏡下觀察并拍照,將獲得的圖像存于計算機,用美國MediaCybernetics公司的Image-ProPlus6.0進行分析。Image-ProPlus自動測得所獲取圖像的面積(即視野面積)為59142.67μm2,高倍鏡(×40)下測量該圖像中陽性細胞大小(以平均直徑表示)、陽性細胞光密度值(不同于灰密度,光密度值越大,其陽性程度越高)等,低倍鏡(×10)下測量圖像中陽性細胞數(shù)(以具有細胞核細胞為準,壓線者亦記在內(nèi)),結(jié)果用平均數(shù)±標準差(xˉ±s)(xˉ±s)表示。每套切片隨機抽取5張,其中下丘腦切片每個核團隨機取5個視野圖像,數(shù)據(jù)用SPSS統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析。2結(jié)果與分析2.1組織病理學檢測經(jīng)免疫組織化學SuperPicTureTM二步法檢測染色的切片,背景呈淺黃色或淺黃褐色,OT免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元呈深淺不等的黃褐色,根據(jù)胞體內(nèi)反應(yīng)顆粒著色的深淺可分為強陽性、中等陽性和弱陽性3種。強陽性細胞黑褐色,胞體內(nèi)深褐色顆粒融合成團,染成一片;弱陽性細胞著色淺淡,細胞輪廓不清,在高倍鏡下方可見到胞質(zhì)中有少量淺褐色顆粒中等陽性細胞介于兩者之間;對照組切片均為陰性,說明此方法結(jié)果可靠。光密度值表示陽性細胞著色程度,值越高,陽性細胞著色越深(表1)。2.1.1小鼠視上部細胞發(fā)育的特點下丘腦視上核(supraopticnucleus,SON)位于丘腦下部的基部,即下丘腦的視上區(qū)。其細胞屬分泌神經(jīng)元,縱貫視前區(qū)、視上區(qū)和結(jié)節(jié)區(qū)嘴側(cè)部,橫跨內(nèi)外側(cè)帶,包繞視交叉,呈一連續(xù)的長扁平板狀核團。沼澤型水牛該核細胞體積較大,細胞密集,陽性細胞呈強陽性,短梭形,胞質(zhì)內(nèi)可見大小不一的陽性顆粒(圖1)。2.1.2視上區(qū)的內(nèi)核室旁核(Paraventricularnucleus,PVN)位于內(nèi)側(cè)帶靠近室周帶處,即視上區(qū)的背中部,在視前核后上方、前核上方、背內(nèi)側(cè)核上端的前方、室間孔的下方,呈卵圓形的核團。沼澤型水牛該核細胞胞核清晰可見,核仁清楚,細胞染色較深,OT免疫陽性細胞呈不明顯的空泡狀,顆粒豐富,多見三角形或四邊形細胞,偶見梭形,突起明顯,細胞間分布較松散,周圍有很多陽性纖維。2.1.3小細胞細胞組交叉上核(Nucleussuprachiasmaticus,SCH)位于視交叉上方,主要由呈梭形和卵圓形排列密集的小細胞和少量大細胞組成。沼澤型水牛該核細胞突起粗大、長、纖維多,OT免疫陽性產(chǎn)物主要分布于梭形的大細胞中,另外在一些無突起的小細胞中也有分布,細胞形態(tài)各異,體積中型,中等陽性,OT免疫陽性細胞染色深而密集,周圍可見陽性纖維。2.1.4視前外側(cè)核及pol的特性視前核(Preopticnucleus,NPO)位于視交叉上方,前核的前方,又分為視前內(nèi)側(cè)核(Medialpreopticnucleus,POM)及視前外側(cè)核(Lateralpreopticnucleus,POL),兩者之間無明顯界限,整個核團由上至下呈梭形。沼澤型水牛該核細胞以中型細胞為主,細胞主要為梭形和卵圓形的小細胞,分布較松散,細胞成短梭形,胞質(zhì)染色淺,胞核著色淺,可看到清晰的核仁。2.1.5nhp的核型后核(Posteriorhypothalamicnucleus,NHP)位于背內(nèi)側(cè)核后方,乳頭體上方,呈寬帶狀的核團。沼澤型水牛該核細胞以中型細胞為主,細胞主要為梭形和卵圓形小細胞,細胞胞質(zhì)染色淺,胞核著色淺,可看到清晰的核仁,OT陽性細胞呈中等陽性,短梭形,分布較松散。2.1.6充腹外側(cè)部弓狀核(Arcuatenucleus,ARC)位于視交叉后方,腹內(nèi)側(cè)核下方,乳頭體前方,呈梭形橫臥于下丘腦腹側(cè)部。沼澤型水牛該核細胞分布較密集,OT陽性細胞呈強陽性,細胞體積較大,細胞形態(tài)以梭形、圓形、卵圓形為主,胞內(nèi)胞外均有大量強陽性物質(zhì)分布(圖2)。2.1.7回采過程中,內(nèi)核和弓狀核的總體特征腹內(nèi)側(cè)核(Ventromedialnucleus,VMN),位于背內(nèi)側(cè)核及后核的下方、乳頭體前上方,弓狀核的背側(cè)部,由前向后呈橢圓形的核團。沼澤型水牛該核細胞以中小型細胞為主,OT陽性細胞呈強陽性,染色較深,細胞較小,核仁呈黑色,分布較松散,胞內(nèi)胞外均有大量強陽性物質(zhì)分布。2.1.8底物的周圍邊界乳頭體核(Mamillarybody,MB)為1對球形核團,突出于下丘腦底面,在下丘腦矢狀面上,位于下丘腦后下方,其上方是后核,前上方是腹內(nèi)側(cè)核,前方是弓狀核,核團呈圓形,其周圍界限明顯。沼澤型水牛該核細胞OT陽性細胞較小,分布較松散,呈中等陽性,細胞呈蝌蚪狀、多角形,胞質(zhì)偶見分布粗而短的陽性產(chǎn)物。2.1.9常網(wǎng)狀核團的形成前核(Anteriorhypothalamicnucleus,NHA)位于視交叉上核后上方、視前核的后方、背內(nèi)側(cè)核的前方、室旁核的下方,呈后上向前下呈常帶狀的核團。沼澤型水牛該核細胞體積較大,細胞形態(tài)多以圓形、卵圓形、梭形為主,OT陽性細胞呈強陽性,胞核可見空泡,胞質(zhì)染色較深,核仁呈黑色,細胞間分布較松散,胞漿內(nèi)可見大小不一的陽性顆粒。2.1.1旁核和前核的之前和外側(cè)核團的結(jié)構(gòu)背內(nèi)側(cè)核(Dorsomedialnucleus,NDM)位于室旁核和前核的后方、下丘腦后核的前方、腹內(nèi)側(cè)核的上方,由上往下呈寬帶狀的核團。沼澤型水牛該核細胞以中小型細胞為主,OT陽性細胞呈強陽性,胞質(zhì)染色較深,呈深褐色,細胞呈不規(guī)則分布,環(huán)繞胞體為空泡。2.2染色切片的檢測經(jīng)免疫組織化學SuperPicTureTM二步法檢測染色的切片,背景淺黃色或黃褐色,OT免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈深淺不等的棕黃色。對照組切片均為陰性,說明該試驗具有免疫反應(yīng)的特異性。2.2.1ot免疫陽性產(chǎn)物在垂體中的分布(1)ot免疫陽性細胞密度腺垂體是體內(nèi)最重要的內(nèi)分泌腺,位于腦基底部靠近視丘下部,呈櫻桃狀。沼澤型水牛的腺垂體上僅見數(shù)量極少、染色很淡、纖細的OT免疫陽性細胞和纖維,纖維沿腺細胞走向,分支形成不規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)狀。在中間部的粗大纖維和血管周圍被陽性物質(zhì)包圍(圖3)。試驗發(fā)現(xiàn),沼澤型水牛腺垂體中OT免疫陽性纖維豐富,平均光密度較低,為0.459±0.044;OT陽性纖維密度大,為“++++”。(2)青年期開發(fā)的雙組分纖維神經(jīng)垂體位于腦垂體后部,主要由下丘腦束的無髓神經(jīng)纖維和神經(jīng)膠質(zhì)分化而成的神經(jīng)垂體細胞所組成。沼澤型水牛的神經(jīng)垂體上可見少量呈斷續(xù)平行排列的OT陽性纖維,典型的纖維內(nèi)含有大小不等的棕黃色或深黃色反應(yīng)顆粒,膨大成圓形、桿形、梭形等,使纖維成串珠樣,或呈均質(zhì)分布在纖維上,膨體所在纖維明顯相連,這些纖維彎曲細小,多分布于近下丘腦區(qū)域。青年期沼澤型水牛神經(jīng)垂體上的OT免疫陽性纖維分支少、較短,有的形成纖維束,但數(shù)量少,有的交叉成不規(guī)則的網(wǎng)狀,這些纖維還在血管、血竇旁有較多分布。在OT免疫陽性纖維旁散在分布著一些黃色陽性顆粒,其大小不等,可能是被切斷的纖維。沼澤型水牛OT免疫陽性纖維粗大、長,纖維束較多,陽性顆粒多,膨體較多,分支較多,所含顆粒黃褐色,其中胞核呈藍色(圖4)。2.2.2生殖被膜細胞ot免疫陽性檢測經(jīng)免疫組織化學SuperPicTureTM二步法檢測染色的切片,背景無色或淺黃色,OT免疫反應(yīng)陽性產(chǎn)物呈深淺不等的黃褐色,細胞呈不規(guī)則的圓形、卵圓形、梭形、三角形和多角形等,大小不等,成堆或散在分布。其中,陽性細胞大小為(16.088±0.795)μm,陽性細胞數(shù)為265.30±2.93;平均光密度為0.235±0.033,OT免疫陽性面積為(122.537±0.116)μm2。根據(jù)胞體內(nèi)反應(yīng)顆粒著色的深淺可分為強陽性、中等陽性和弱陽性。強陽性細胞黑褐色,胞體內(nèi)褐色顆粒融合成團,染成一片;弱陽性細胞著色淺淡,細胞輪廓不清,在高倍鏡下方可見胞質(zhì)中有少量淺黃色顆粒;中等陽性細胞介于兩者之間。卵巢位于子宮底的后外側(cè),與盆腔側(cè)壁相接。試驗中5頭牛的卵巢皮質(zhì)和髓質(zhì)均未發(fā)現(xiàn)有OT免疫陽性產(chǎn)物的分布,而在生殖上皮、卵泡顆粒細胞和黃體細胞發(fā)現(xiàn)有大量OT免疫陽性產(chǎn)物存在。卵泡顆粒細胞中OT免疫陽性細胞形態(tài)為卵圓形和圓形,陽性細胞數(shù)較多,主要以強陽性細胞為主,顆粒細胞越靠近卵泡腔,平均光密度值越低。生殖上皮發(fā)現(xiàn)有OT免疫陽性產(chǎn)物分布,細胞呈立方狀。沼澤型水牛卵巢生殖被膜細胞呈弱陽性。卵泡細胞胞核不著色呈空泡狀,居于中央或偏于一側(cè),顆粒層細胞呈中等陽性(圖5)。2.2.3d現(xiàn)行體存在的細胞毒性和形態(tài)黃體為排卵后由卵泡迅速轉(zhuǎn)變成的富有血管的腺體樣結(jié)構(gòu)。許多學者先后對反芻家畜(綿羊、牛、山羊)的周期黃體中OT的定位進行了研究報道。卿素珠等認為奶山羊黃體中的OT免疫反應(yīng)細胞屬于彌散神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)(DNES)的周圍部分;李兆才等在奶山羊黃體確定了DNES細胞的存在。但目前尚無DNES細胞分泌OT的直接證據(jù),關(guān)于OT在黃體中的表達部位尚無定論。卵巢顆粒細胞在排卵到黃體化的過程中經(jīng)歷了許多生化和分化方面的變化,如從排卵前增殖的顆粒細胞向非增殖的終末分化的黃體細胞的轉(zhuǎn)化,OT對不同分化階段的顆粒細胞具有分化作用。連續(xù)切片HE染色的對照觀察顯示,奶山羊周期黃體中的OT主要由大黃體細胞分泌,小黃體細胞也可產(chǎn)生少量OT,且OT陽性細胞以不規(guī)則圓形為主,兼有卵圓形、多角形等,陽性細胞主要為大黃體細胞。近年來的研究發(fā)現(xiàn),黃體細胞除可分泌或表達孕酮、雌激素、前列腺素F2a和催產(chǎn)素等激素外,還表達一些細胞因子和激素的特異性受體。黃體中存在大量的OT免疫陽性產(chǎn)物,細胞以卵圓形和圓形為主。黃體細胞輪廓不清楚,著色較淺,免疫陽性物質(zhì)均勻分布于整個黃體組織中(圖6)。3生理功能的影響已有的關(guān)于OT生理功能方面的研究表明,OT除在生殖活動的調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用外,對心血管功能、消化功能、體液滲透壓、神經(jīng)免疫也有調(diào)節(jié)作用,與應(yīng)激反應(yīng)、睡眠與覺醒、痛覺調(diào)制等有密切關(guān)系,并能改善母親期長期空間記憶,增加人類之間的信任感,對精神失調(diào)和社會行為的破壞(如自閉癥)有改善作用。生理功能的產(chǎn)生必定有其形態(tài)學基礎(chǔ),OT合成部位的研究成為該領(lǐng)域的熱點。在該領(lǐng)域的動物研究方面,許多學者已對大鼠、倉鼠、樹鼩、人、豬、奶山羊等多種動物的OT神經(jīng)元及纖維的分布、合成部位有過研究及驗證,但OT在下丘腦-垂體-卵巢軸的具體作用機制及途徑還有待進一步研究。3.1ot在廣西本地一核中的分布關(guān)于下丘腦OT免疫陽性神經(jīng)元在動物中分布的報道很多。Monika研究發(fā)現(xiàn),哺乳動物的OT神經(jīng)元主要存在于下丘腦大細胞核、視上核和室旁核,其神經(jīng)纖維主要投射到垂體后葉和正中隆起。陳樹林等、卿素珠等在多種動物的室旁核、視上核、穹窿周核、室周核、下丘腦外側(cè)區(qū)、下丘腦前核、環(huán)核和前聯(lián)合核等觀察到OT神經(jīng)元,該試驗也在上述區(qū)域觀察到陽性神經(jīng)元及數(shù)量不等的陽性纖維。試驗發(fā)現(xiàn)OT在沼澤型水牛的下丘腦中廣泛分布,視上核、背內(nèi)側(cè)核等數(shù)十個核團(區(qū))均有分布,不僅分布在視上核和室旁核,在弓狀核亦見大量OT神經(jīng)元,并以弓狀核分布最多。與陳樹林等研究結(jié)果類似。試驗還發(fā)現(xiàn)弓狀核中存在大量OT免疫陽性神經(jīng)元,而弓狀核與視上核、背內(nèi)側(cè)核均位于促垂體區(qū),該區(qū)域的內(nèi)分泌細胞主要分泌促垂體激素,這提示了OT可能參與調(diào)節(jié)了垂體中某些激素的分泌。下丘腦一些血管被OT神經(jīng)元及纖維環(huán)繞,在第三腦室附近的一些核團和弓狀核、穹窿、正中隆起等處有一些OT神經(jīng)元的突起及神經(jīng)纖維。這表明OT可經(jīng)第三腦室(腦脊液)、血液、神經(jīng)垂體3條途徑釋放,然后通過血液循環(huán)作用于靶細胞,與孫志宏等研究結(jié)果一致,從而對OT釋放途徑有了進一步的證實。各核團神經(jīng)細胞的陽性產(chǎn)物光密度上有顯著差異,跟摩雜1代水牛研究中相應(yīng)各核團的光密度也有顯著差異,這表明不同核團功能區(qū)域、不同種屬牛的神經(jīng)元細胞因作用不同而出現(xiàn)內(nèi)分泌功能上的差異,可能對生產(chǎn)性能有影響。OT在廣西本地水牛下丘腦中的分布與大部分文獻報道基本一致。將該試驗結(jié)果與OT在不同動物下丘腦中的分布進行比較,結(jié)果表明,OT在下丘腦中的分布存在種屬上的差異。OT免疫陽性神經(jīng)纖維主要分布于下丘腦中弓狀核、腹內(nèi)側(cè)核、前核及背內(nèi)側(cè)核等核團,其出現(xiàn)在與神經(jīng)內(nèi)分泌相關(guān)的下丘腦核團中,提示OT可能參與了機體的生殖神經(jīng)內(nèi)分泌的調(diào)節(jié)。3.2ot對腺垂體激素合成的調(diào)節(jié)試驗發(fā)現(xiàn),沼澤型水牛免疫陽