大鼠下丘腦室旁核大細(xì)胞逆向動(dòng)作電位3指標(biāo)的增齡性變化

大鼠下丘腦室旁核大細(xì)胞逆向動(dòng)作電位3指標(biāo)的增齡性變化

目前，關(guān)于細(xì)胞生化特征的老細(xì)胞變化的研究很少涉及單細(xì)胞。神經(jīng)軸突是神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息的重要部分,其電生理學(xué)特性的變化會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞乃至神經(jīng)系統(tǒng)功能的改變。電刺激軸突末梢可在神經(jīng)細(xì)胞胞體上記錄到逆向轉(zhuǎn)遞的動(dòng)作電位,通過測(cè)定逆向動(dòng)作電位(AP)的閾值、潛伏期與跟隨頻率可反映單根神經(jīng)纖維功能的變化。但是,由于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中進(jìn)行同一細(xì)胞上的刺激與記錄較為困難,因而目前尚未見這方面的研究報(bào)道。下丘腦室旁核(PVN)主要由分泌加壓素與催產(chǎn)素的神經(jīng)分泌大細(xì)胞組成,其纖維主要投射至神經(jīng)垂體。本文應(yīng)用神經(jīng)垂體逆向電刺激,于PVN內(nèi)進(jìn)行玻璃微電極細(xì)胞外記錄逆向AP的方法,觀察了3月齡、12月齡及26月齡3組大鼠逆向AP的閾值、潛伏期及跟隨率的變化,從而為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的衰老性變化提供電生理學(xué)依據(jù)。1對(duì)象和方法1.1目標(biāo)采用西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供的健康3～5月齡、12月齡及26月齡SD大鼠,雌雄不拘。1.2方法1.2.1神經(jīng)部分變化在腹腔注射烏拉坦(20%,1.1g/kg)麻醉下行常規(guī)氣管及頸靜脈插管術(shù),然后將大鼠俯位固定于腦立體定位儀上。保持肛溫37～38℃。暴露枕骨大孔,留置脫脂棉條作腦脊液引流。沿顱頂正中切開皮膚,暴露頂骨,調(diào)節(jié)前后囟高度使其在同一水平面上。從前囟向后打開約0.5×0.5cm2的顱骨。結(jié)扎矢狀竇后,從正中剪開并分別向前后翻起矢狀竇,用溫鹽水棉球覆蓋保護(hù)腦組織。按PAXINOS圖譜定位神經(jīng)垂體坐標(biāo)為:耳間線間2.8～3.2mm,耳間線水平抬高0.4～0.8mm,旁開0mm,以與冠狀面成30°角從后向前插入刺激電極,據(jù)此在后囟約0.5cm處正中鉆一小孔。手術(shù)完成后,墊起顱頂周圍皮膚成一小油槽,灌入37℃的液體石蠟保護(hù)創(chuàng)面。按上述坐標(biāo)插入垂體雙極刺激電極。1.2.2質(zhì)量對(duì)比標(biāo)準(zhǔn)用灌以含有2%滂胺天藍(lán)的0.5mol/L醋酸鈉溶液的玻璃微電極進(jìn)行細(xì)胞外記錄,電極阻抗10～20mΩ,PVN坐標(biāo)為:前囪后1.6～2.0mm,旁開0.2～0.8mm,深7.2～8.2mm,用微電極推進(jìn)器將記錄電極插入一側(cè)PVN內(nèi),當(dāng)電極接近預(yù)定位置后,放慢行進(jìn)速度至2～3μm/步,尋找自發(fā)放電單位,其標(biāo)準(zhǔn)如下:(1)具有恒定潛伏期的“全”或“無”反應(yīng);(2)具有跟隨高頻刺激的能力(>100Hz);(3)可和自發(fā)順向動(dòng)作電位發(fā)生碰撞。具體步驟為:①當(dāng)在PVN區(qū)域內(nèi)出現(xiàn)自發(fā)放電單位后,給神經(jīng)垂體以波寬0.5ms,強(qiáng)度從0逐漸增大至1mA的單脈沖刺激,觀察能否誘發(fā)出一個(gè)潛伏期恒定的動(dòng)作電位。②如出現(xiàn)一個(gè)潛伏期恒定的動(dòng)作電位,則記錄引起該逆向單位的刺激閾值及潛伏期,并將刺激強(qiáng)度增至1.5倍閾值,變換刺激方式為雙脈沖刺激,兩刺激間隔從10ms逐漸減小,觀察其后的動(dòng)作電位是否能夠跟隨雙脈沖刺激并記錄跟隨的最小的脈沖間隔;③如一個(gè)動(dòng)作電位符合上述兩條標(biāo)準(zhǔn),則進(jìn)行碰撞試驗(yàn),以自發(fā)放電觸發(fā)示波器掃描,同時(shí)觸發(fā)刺激器刺激,調(diào)節(jié)刺激脈沖延遲(從稍長(zhǎng)于潛伏期逐漸減小),直至不能在胞體記錄到該逆向動(dòng)作電位即逆向動(dòng)作電位由于落在順向動(dòng)作電位的不應(yīng)期而消失,則碰撞試驗(yàn)成功。一般情況下,被記錄神經(jīng)元只有在同時(shí)符合上述3個(gè)條件時(shí)才確認(rèn)為逆向鑒定神經(jīng)元。1.2.3實(shí)驗(yàn)電極的制備每次實(shí)驗(yàn)結(jié)束前向玻璃微電極通以10～20μA的陰極直流電10～20min,于實(shí)驗(yàn)結(jié)束后小心取出腦組織,浸入10%的福爾馬林溶液內(nèi)固定1～2d,然后做100μm冰凍連續(xù)切片以確定記錄電極的位置;取腦后在顱底及垂體清晰暴露后按原參數(shù)重新插入刺激電極,觀察是否位于神經(jīng)垂體內(nèi)。1.3統(tǒng)計(jì)處理實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示,采χ2檢驗(yàn)或t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。2結(jié)果2.1青年組和老年組神經(jīng)元逆向鑒定檢測(cè)結(jié)果比較在20只青年(3～5月齡)大鼠上共測(cè)定了符合上述標(biāo)準(zhǔn)的逆向鑒定神經(jīng)元33例,其中閾值<0.5mA者16例(16/33,48.5%),0.5mA<閾值<1mA者17例(17/33,51.5%)。平均閾值為0.51±0.28mA。中年組(12月齡)大鼠8只,共測(cè)定了符合標(biāo)準(zhǔn)的神經(jīng)元6例,閾值<0.5mA者3例,0.5mA<閾值<1mA者3例。平均閾值0.65±0.25mA。共在9只老年(26月齡)大鼠上測(cè)定了符合前述標(biāo)準(zhǔn)的逆向鑒定神經(jīng)元26個(gè),其中閾值<0.5mA者9例(9/26,34.6%),0.5～1mA者18例(18/26,69.2%),平均閾值為0.59±0.24mA,與青年組相比,二者差異有顯著性(P<0.05)。另外,老齡大鼠逆向AP閾值<0.5mA的神經(jīng)元比例小于青年組大鼠,二者差異有顯著性(P<0.05)。2.2組大鼠推進(jìn)前后逆向鑒定神經(jīng)元的平均刑期青年組大鼠刺激閾值在0.1～1mA的逆向鑒定神經(jīng)元的平均潛伏期為13.2±3.2ms(范圍8～20ms,n=33);閾值<0.5mA者平均潛伏期為11.8±2.5ms(n=16)。中年組大鼠刺激閾值為0.1～1mA的逆向鑒定神經(jīng)元平均潛伏期為12.5±1.3ms(n=6),其中閾值<0.5mA者平均潛伏期為11.7±1.5ms(n=3)。老年大鼠刺激閾值在0.1～1mA的逆向鑒定神經(jīng)元的平均潛伏期為12.8±2.9ms(范圍9～67ms,n=34)。閾值<0.5mA平均潛伏期為14.4±3.0ms(n=9)。3組年齡大鼠閾值在0.1～1mA的潛伏期的差異無顯著性(P>0.05),由于刺激閾值增大可能會(huì)因電流擴(kuò)散而影響潛伏期的長(zhǎng)短,因而又比較了3組大鼠刺激閾值在0.5mA以下逆向AP的平均潛伏期變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn):中年組與青年組相比差異無顯著性(P>0.05),而老年組與中、青年組相比潛伏期明顯延長(zhǎng)(P<0.01)。2.3逆向鑒定神經(jīng)元的隨機(jī)頻率10只青年大鼠的18個(gè)逆向鑒定神經(jīng)元的跟隨頻率范圍為200～500Hz(雙刺激脈沖間隔為5～2ms),平均跟隨刺激間隔為3.16±0.71ms。8只中年組大鼠的5個(gè)神經(jīng)元的跟隨頻率范圍為200～333Hz(雙刺激脈沖間隔為5～3ms),平均跟隨刺激間隔為3.25±1.58ms。與青年組相比差異無顯著性(P>0.05)。另外在1例神經(jīng)元上測(cè)得跟隨頻率為125Hz(8ms)。共測(cè)定了8只老年大鼠16個(gè)逆向鑒定神經(jīng)元的跟隨頻率。其跟隨頻率范圍在200～333Hz(雙刺激間隔為5～3ms),平均跟隨刺激間隔為3.50±0.73ms。與青年組相比差異無顯著性(P>0.05)。3老年大鼠pvn神經(jīng)內(nèi)皮大細(xì)胞興震性下降,一般進(jìn)展符合下丘腦室旁核一方面由神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞合成分泌加壓素及催產(chǎn)素并將其運(yùn)送至神經(jīng)垂體釋放,另一方面又由神經(jīng)內(nèi)分泌小細(xì)胞分泌CRF、TRH等一系列促垂體激素經(jīng)正中隆起到達(dá)前葉垂體,成為調(diào)節(jié)機(jī)體幾個(gè)軸的活動(dòng)的最高中樞。雖然越來越多的研究證實(shí)在衰老過程中室旁核神經(jīng)細(xì)胞在數(shù)量上沒有明顯的丟失現(xiàn)象,但其功能仍然存在變化。目前關(guān)于下丘腦神經(jīng)分泌細(xì)胞衰老性變化的研究主要集中在其分泌功能的改變上,而對(duì)其在體電生理學(xué)特征的變化至今尚未見報(bào)道。逆向電刺激的閾值、潛伏期、跟隨率是反映中樞神經(jīng)系統(tǒng)衰老性變化的較好指標(biāo)。在該系統(tǒng)中刺激及記錄發(fā)生于同一神經(jīng)元上,不牽涉突觸傳遞的過程,逆向電刺激的閾值直接反映了PVN神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞的興奮性,而潛伏期的變化則主要反映神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度的改變,跟隨率則主要反映神經(jīng)細(xì)胞興奮后不應(yīng)期的長(zhǎng)短。本研究發(fā)現(xiàn):老年大鼠逆向刺激閾值<0.5mA的神經(jīng)元的百分?jǐn)?shù)(34.6%)明顯少于青年組大鼠(48.5%),而>0.5mA的百分?jǐn)?shù)(69.2%)卻明顯高于青年組(51.5%)。并且,老年大鼠逆向刺激的平均閾值(0.59±0.24mA)亦明顯高于青年組者(0.51±0.28mA)(P<0.05)。上述二方面的結(jié)果分析提示老年大鼠旁核神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞的興奮性降低。結(jié)合已有的電生理學(xué)方面的資料,分析該興奮性降低的原因可能與衰老神經(jīng)細(xì)胞膜靜息電位升高有關(guān)。如我室在培養(yǎng)的下丘腦神經(jīng)細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)衰老神經(jīng)細(xì)胞的膜靜息電位由7～14d的-69.3mV升高至61～71d的-82.9mV,而引起靜息電位增高的離子機(jī)制可能是衰老神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鉀離子的濃度增高。但由于在衰老神經(jīng)細(xì)胞膜靜息電位增高的同時(shí),細(xì)胞膜輸入阻抗卻是降低的,而膜輸入阻抗的降低可導(dǎo)致細(xì)胞興奮的閾值降低,因此,衰老PVN神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞興奮性的降低可能是多種因素互相作用的結(jié)果。我室及其他研究室曾報(bào)道在外周神經(jīng)系統(tǒng)的尾神經(jīng),貓的脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元傳出纖維等部位發(fā)現(xiàn)隨增齡其神經(jīng)纖維的傳導(dǎo)速度下降,而在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度是否有所改變尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),當(dāng)刺激閾值<0.5mA時(shí),老年大鼠PVN逆向鑒定神經(jīng)元的平均潛伏期(14.4ms)明顯長(zhǎng)于青年鼠(11.8ms)(P<0.01),提示老年大鼠由PVN至神經(jīng)垂體間的神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度可能降低。已知神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度與神經(jīng)細(xì)胞膜興奮性、膜電容、膜電阻及神經(jīng)軸突的粗細(xì)以及髓鞘的有無等緊密相關(guān)。PVN神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞的軸突傳導(dǎo)速度在0.5～1m/s間,當(dāng)屬無髓的C類纖維,因而其傳導(dǎo)速度不受髓鞘變性等因素的影響。值得注意的是:隨月齡增大,大鼠的PVN軸突可能有所延長(zhǎng),如以傳導(dǎo)速度0.5m/s計(jì),軸突延長(zhǎng)1mm,則傳導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)2ms。但由于在與老年組動(dòng)物前后囪距離相似的中年組大鼠上測(cè)得的潛伏期(11.7ms)亦低于老年組大鼠,故可能確實(shí)存在老年大鼠PVN至神經(jīng)垂體間纖維傳導(dǎo)速度降低。當(dāng)然,測(cè)定神經(jīng)纖維傳導(dǎo)速度的方法最好以移動(dòng)刺激電極的位置來完成,但該方法用于在體實(shí)驗(yàn)時(shí)從技術(shù)上講較困難,因而在此得出老年大鼠傳導(dǎo)速度降低的結(jié)論尚需慎重。從我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出:老年大鼠與青年大鼠PVN神經(jīng)內(nèi)分泌大細(xì)胞對(duì)高頻刺激的跟隨能力存在差別,主要體現(xiàn)在其所能跟隨的頻率范圍的上限上。如老年組大鼠最大可跟隨頻率為333Hz(雙刺激間隔3ms),而青年組大鼠最大可跟隨500Hz(雙刺激間隔2ms)的高頻刺激。中年組大鼠雖然最大限隨頻率亦為333Hz,但當(dāng)刺激強(qiáng)度提高至2倍閾強(qiáng)度時(shí)有時(shí)亦可跟隨500Hz的雙刺激(結(jié)果未顯示),而在老年組大鼠即使提高刺激強(qiáng)度亦無一例神經(jīng)元能夠跟隨如此高頻的刺激。神經(jīng)細(xì)胞對(duì)