apelin-13對大鼠室旁核誘導(dǎo)的胃缺血-再灌注損傷的影響及其機(jī)制

apelin-13對大鼠室旁核誘導(dǎo)的胃缺血-再灌注損傷的影響及其機(jī)制

1993年，o和dad首次發(fā)現(xiàn)了新的g蛋白結(jié)合體：與血管緊張素相關(guān)的1形受體（apjr）。1998年Tatemoto等提取并純化出APJR的內(nèi)源性配體并命名為Apelin(APJRendogenousligand)。下丘腦室旁核(paraventricularnucleus,PVN)是腦內(nèi)Apelin能神經(jīng)元胞體及其受體相對集中的部位。我們曾發(fā)現(xiàn)下丘腦PVN對胃缺血-再灌注(gastricischemia-reperfusioninjury,GI-R)損傷具有調(diào)節(jié)作用。電刺激PVN后,能顯著減輕GI-R損傷,其保護(hù)作用與抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖有關(guān)。本研究探討大鼠室旁核注射Apelin對GI-R的影響及其作用機(jī)制。1材料和方法1.1檢測細(xì)胞抗體Caspase-3兔多克隆抗體(Cell-Signal公司);抗BCL-2多克隆抗體、抗BAX多克隆抗體(SantaCruz公司);小鼠抗大鼠增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)單克隆抗體、PowerVisionTM二步法免疫組化檢測系統(tǒng)、二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒、枸櫞酸鹽緩沖鹽溶液(北京中山生物技術(shù)有限公司);其他試劑均為市售化學(xué)純。1.2動(dòng)物分組及給藥方法健康SD大鼠(本院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供),4～5月齡、體重230～250g,雌雄不拘。大鼠隨機(jī)分為:對照組(control組)、缺血-再灌注組(GI-R組)、PVN給藥+GI-R組(Apelin-13+GI-R組)、PVN給溶劑+GI-R組(Vehicle+GI-R組),每組6只。動(dòng)物在(10%水合氯醛,0.3mL/100g)麻醉下手術(shù),按文獻(xiàn)方法定位PVN后,在2min內(nèi)將0.3μL(含Apelin-130.2、1.0和5.0μg,或生理鹽水)藥液緩慢注入。大鼠GI-R模型的制備按文獻(xiàn)方法。1.3免疫組染色按試劑盒說明進(jìn)行染色,用圖像分析儀對陽性細(xì)胞數(shù)或表達(dá)強(qiáng)度分別進(jìn)行半定量分析,檢測胃黏膜細(xì)胞凋亡、增殖及BCL-2與BAX蛋白表達(dá)。1.4損傷長度累積評分參照Guth等方法略加改進(jìn)。以腺胃區(qū)局限于胃上皮的點(diǎn)狀糜爛、潰瘍、出血灶的長度累積計(jì)分:正常為0分,損傷<1mm計(jì)1分,>1mm計(jì)2分,>2mm計(jì)3分,余類推。損傷寬度超過1mm時(shí)分?jǐn)?shù)加倍。每組大鼠損傷分?jǐn)?shù)的平均值為損傷指數(shù)。1.5統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(—x±s)(x—±s)表示,多組間比較用完全隨機(jī)設(shè)計(jì)方差分析法(ANOVA)。2結(jié)果2.1對產(chǎn)品損傷指數(shù)的影響PVN注射0.2、1.0和5μgApelin-13后對缺血-再灌注胃黏膜損傷指數(shù)與注射的劑量有關(guān)。Apelin-13可使胃黏膜損傷指數(shù)均呈劑量依賴性增高(P<0.05)(圖1)。2.2對胃黏膜凋亡細(xì)胞的表達(dá)和表達(dá)的影響正常胃黏膜中的caspase-3陽性細(xì)胞(即凋亡陽性細(xì)胞)主要散在表達(dá)于胃黏膜的上層,Apelin-130.2μg+GI-R組與GI-R組和溶劑組相比,明顯的增加了再灌后的胃黏膜凋亡細(xì)胞的表達(dá),Apelin-130.2μg+GI-R組陽性細(xì)胞累積吸光度(integralabsorbance,IA)分別是GI-R組的140%,是溶劑組的149%(P<0.01)(圖2A1～D1,表1)。2.3治療嘴唇下局部表達(dá)正常胃黏膜PCNA陽性細(xì)胞(即增殖陽性細(xì)胞)在胃黏膜的上中層1/3交界處有少量的表達(dá)。Apelin-130.2μg+GI-R組與GI-R組和溶劑組相比,增殖的陽性細(xì)胞百分比是GI-R組的57.9%,是溶劑組的58%(P<0.01)(圖2A2～D2,表1)。2.4apelin-3對bcl-2表達(dá)的影響Apelin-130.2μg+GI-R組與GI-R組及溶劑組相比,胃黏膜細(xì)胞內(nèi)BCL-2陽性細(xì)胞的表達(dá)明顯減少,Apelin-130.2μg+GI-R組BCL-2陽性細(xì)胞累積吸光度分別是GI-R組的32%,是溶劑組的29%(P<0.01)(圖2A3～D3,表1)。2.5bax蛋白的表達(dá)Apelin-130.2μg+GI-R組與GI-R組及溶劑組相比,胃黏膜細(xì)胞內(nèi)BAX蛋白的表達(dá)明顯增加,陽性細(xì)胞累積吸光度(integralabsorbance,IA)分別是GI-R組的319%,是溶劑組的296%(P<0.01)(圖2A4～D4,表1)。3apelin-13對胃黏膜細(xì)胞凋亡的調(diào)控Apelin是oGPCRsAPJ的天然配體,具有多種生物學(xué)效應(yīng)。近年來發(fā)現(xiàn),下丘腦PVN是腦內(nèi)Apelin能神經(jīng)元胞體及其受體相對集中的部位,可能參與下丘腦功能。我們發(fā)現(xiàn),PVN內(nèi)微量注射Apelin-13呈劑量依賴性明顯加重對缺血-再灌注的胃黏膜的損傷。Apelin-13的致?lián)p傷作用與其促進(jìn)胃黏膜細(xì)胞的凋亡、抑制細(xì)胞的增殖有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)檢測胃黏膜細(xì)胞增殖和凋亡使用的分別是PCNA抗體和caspase-3抗體。PCNA是DNA聚合酶的輔助因子,參與DNA合成,是目前公認(rèn)的增殖細(xì)胞的標(biāo)記物。在凋亡的過程中,caspase-3是關(guān)鍵的執(zhí)行分子,在凋亡發(fā)生后,它被激活并作為關(guān)鍵性蛋白酶,直接導(dǎo)致細(xì)胞解體并包裹形成凋亡小體。在PVN內(nèi)微量注射Apelin-13后,我們檢測到胃黏膜細(xì)胞的凋亡數(shù)與對照組相比明顯增多,而細(xì)胞的增殖減少。大量的研究認(rèn)為,BCL-2基因家族是許多生理和病理凋亡的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)因子。其中BAX表達(dá)占優(yōu)勢時(shí),BAX之間同型二聚體增多誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生;BCL-2表達(dá)增多時(shí),將阻止BAX之間形成同型二聚體,而形成BCL-2/BAX二聚體,使細(xì)胞凋亡減少、增殖增加。本實(shí)驗(yàn)顯示,室旁核注射Apelin-13可以明顯增加BAX蛋白的表達(dá),同時(shí)也顯著地降低了BCL-2蛋白的表達(dá),表明BAX和BCL-2兩種功能相反的基因參與了室旁核注射Apelin-13加重胃黏膜細(xì)胞的損傷過程。綜上所述,室旁核注射Apelin-13加重胃黏膜再灌注