復(fù)元膠囊對體外原代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

復(fù)元膠囊對體外原代培養(yǎng)軟骨細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究

骨關(guān)節(jié)炎（oa）是老年人最常見的慢性和刺激性關(guān)節(jié)疾病。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中唯一的細(xì)胞,在軟骨形成、代謝以及修復(fù)中起著極其重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)在骨關(guān)節(jié)炎病變過程中有軟骨細(xì)胞凋亡的特征性形態(tài),如染色質(zhì)凝聚、核碎片、細(xì)胞皺縮、凋亡小體等,軟骨細(xì)胞凋亡已被認(rèn)為是關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的病理因素之一。有學(xué)者報道,在NO供體硝普鈉(SNP)誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellularsignalregulatedkinase,包括ERK1和ERK2)信號通路能抑制凋亡信號的傳導(dǎo),抑制軟骨細(xì)胞的過度凋亡,而用ERK1/2特異性抑制劑U0126阻斷ERK1/2信號通路可促進(jìn)軟骨細(xì)胞的凋亡。復(fù)元膠囊是臨床上長期用于治療骨關(guān)節(jié)炎有效的經(jīng)驗方復(fù)元湯研制而成的中藥實驗制劑,但是其分子水平的作用機(jī)制尚不十分清楚。本實驗通過建立軟骨細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,觀察復(fù)元膠囊血清對SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡的影響,并從信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的角度,檢測了參與軟骨細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的磷酸化ERK1/2及其下游靶基因p53蛋白質(zhì)的表達(dá)和凋亡執(zhí)行因子caspase-3的活性,并觀察ERK1/2特異性抑制劑U0126阻斷ERK1/2信號通路后上述指標(biāo)的變化,旨在研究中藥復(fù)元膠囊抑制軟骨細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制,探討其治療骨關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制。1材料和方法1.1大鼠、大鼠、大鼠雄性3w齡SD大鼠10只,體重40～60g;雄性成年SD大鼠20只,體重200～250g。均由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,實驗動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(渝)2002007。1.2膠囊的制作復(fù)元膠囊,由人參、淫羊藿、鹿茸、黃芪、川芎、當(dāng)歸、枸杞子等組成,委托重慶希爾安藥業(yè)有限責(zé)任公司制成膠囊,僅供實驗使用。SNP為北京雙鶴現(xiàn)代醫(yī)藥技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品,批號:H111021635。1.3免疫藥物的免疫藥物研究FD培養(yǎng)基(Hyclone公司)、優(yōu)級胎牛血清(Hyclone公司)、Ⅱ型膠原酶(Sigma公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、總蛋白提取試劑盒(升博生物公司)、U0126(上?？党缮锕?、AnnexinⅤ-FITC試劑盒(晶美生物工程有限公司)、磷酸化抗體ERK1/2一抗(上?？党缮锕?、p53一抗和蛋白內(nèi)參β-actin(SantaCruz公司)、PBS緩沖液和辣根酶標(biāo)記兔抗山羊IgG二抗(北京中山生物技術(shù)有限公司)、免疫印跡化學(xué)發(fā)光試劑(碧云天生物公司)、PVDF膜(Millipore公司)、caspase-3比色法檢測試劑盒(BioVision公司)。1.4方法1.4.1胎牛血清fd活性的制備參照文獻(xiàn),將3w齡SD大鼠斷頸處死后,無菌條件下分離股骨頭,盡量剔除周圍組織,浸入含青霉素和鏈霉素的雙抗水中漂洗3次,FD培養(yǎng)基中漂洗3次,再次清除軟骨周圍附帶組織;將軟骨剪成1mm3大小,移入0.25%胰蛋白酶中,37℃水浴箱中消化30min;胎牛血清終止消化,PBS緩沖液清洗2遍;再加入0.2%Ⅱ型膠原酶,37℃水浴箱消化,每30min輕輕搖蕩一次,4h后消化成絮狀;1000r/min離心5min,棄上清,PBS緩沖液清洗1遍;加入含15%胎牛血清FD培養(yǎng)基制成細(xì)胞懸液,用200目不銹鋼篩網(wǎng)過濾后接種于培養(yǎng)瓶中,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱進(jìn)行原代培養(yǎng)。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞長滿80%后傳代培養(yǎng),Ⅱ型膠原免疫細(xì)胞化學(xué)染色鑒定細(xì)胞。1.4.2灌胃水處理組u2005200～250g的雄性SD大鼠20只,隨機(jī)分成2組,即復(fù)元膠囊組(10只)和空白對照組(10只)。復(fù)元膠囊組按Meeh-Rubner公式給予10倍等效劑量藥物,充分溶于生理鹽水后灌胃;空白組給予等體積的生理鹽水灌胃,每日2次,連續(xù)3d。末次灌胃后2h腹主動脈取血,4℃靜置過夜,3000r/min離心20min,取上清,經(jīng)0.22μm抽濾除菌后,分裝,-20℃保存?zhèn)溆谩?.4.3培養(yǎng)基的制備分為正常組(含15%胎牛血清的FD培養(yǎng)基正常培養(yǎng))、模型組(2mmol/LSNP+FD培養(yǎng)基)、空白血清組(2mmol/LSNP+含10%空白血清的FD培養(yǎng)基)、中藥組(2mmol/LSNP+含10%復(fù)元膠囊血清的FD培養(yǎng)基)、抑制劑組(2mmol/LSNP+50μmol/LU0126+無血清的FD培養(yǎng)基,預(yù)先用U0126孵育1h,再加入SNP和培養(yǎng)基)、中藥+抑制劑組(2mmol/LSNP+50μmol/LU0126+含10%復(fù)元膠囊血清的FD培養(yǎng)基,預(yù)先用U0126孵育1h,再加入SNP和培養(yǎng)基)。1.4.5細(xì)胞同步化培養(yǎng)選用第2代軟骨細(xì)胞,2×105個/ml密度種植于6孔培養(yǎng)板中。培養(yǎng)24h細(xì)胞貼壁后,除正常組外,用不含血清的FD培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24h使細(xì)胞同步化。按實驗要求進(jìn)行分組、處理,繼續(xù)培養(yǎng)48h后,收集培養(yǎng)上清和胰酶消化的細(xì)胞,離心后按FITCAnnexinV/PI試劑盒說明進(jìn)行操作,采用FACSCalibur流式細(xì)胞分析儀檢測,每個樣本檢測計數(shù)的細(xì)胞數(shù)量均固定為10000個,應(yīng)用CELLQuest軟件獲取、分析輸出實驗數(shù)據(jù)。1.4.6蛋白凝膠的制備及光密度檢測細(xì)胞培養(yǎng)及分組同前。按實驗要求進(jìn)行分組處理,繼續(xù)培養(yǎng)48h后,分組提取總蛋白,采用Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測定。取40μg蛋白在12%的SDS凝膠中電泳,電轉(zhuǎn)印于PVDF膜上;5%脫脂奶粉37℃搖床中封閉2h;膜在1:1000稀釋的一抗中4℃過夜;洗膜后加入HRP標(biāo)記的二抗(1:5000),室溫中搖床上孵育2h;洗膜4次后,加入ECL化學(xué)發(fā)光試劑,在BIO-RAD凝膠成像儀下曝光顯影。用QuantityOne凝膠圖像分析軟件檢測各組目的蛋白及其內(nèi)參蛋白的光密度值,二者比值作為各組蛋白的相對表達(dá)量。重復(fù)4次。1.4.7devd-na實驗檢測caspase-3的表達(dá)細(xì)胞培養(yǎng)及分組方法同前。參照試劑說明書,分組提取總蛋白,Bradford法進(jìn)行蛋白濃度測定。取50μl含100μg蛋白的細(xì)胞裂解上清(如體積不足50μl用裂解液補(bǔ)足)置于96孔板中,加入50μl的2×反應(yīng)緩沖液,再加入5μl的4mmol/LDEVD-ρNA底物并于37℃避光孵育2h,用ELX800型酶標(biāo)儀在λ=405nm測定其吸光值,根據(jù)其OD值換算成每毫克所含caspase-3的摩爾濃度。每組設(shè)4個復(fù)孔。1.5統(tǒng)計方法統(tǒng)計分析采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件處理,各組數(shù)據(jù)以表示,組間比較用One-WayANOVA方差分析,均數(shù)比較采用S-N-K檢驗。2結(jié)果2.1細(xì)胞漿、細(xì)胞器、膜的聚合反應(yīng)凋亡以早期為主,鏡下可見軟骨細(xì)胞體積縮小,細(xì)胞膜完整,細(xì)胞表面的微絨毛明顯減少,甚至消失,細(xì)胞漿致密,細(xì)胞器完整,核染色質(zhì)濃縮,集聚于核膜下呈境界分明塊狀。也可見中晚期凋亡細(xì)胞,細(xì)胞體積明顯縮小,核膜發(fā)生皺褶,胞質(zhì)密度增高,有典型的凋亡小體,內(nèi)有細(xì)胞器,細(xì)胞周圍可見脫落的凋亡小體(見圖1)。2.2perk1/2在不同濃度snp中表達(dá)增加提取細(xì)胞總蛋白進(jìn)行Western印跡分析(圖2)。與正常組比較,經(jīng)SNP誘導(dǎo)后的各組p-ERK1/2明顯降低,而p53表達(dá)增加,表明SNP抑制p-ERK1/2表達(dá),從而誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。中藥組pERK1/2的表達(dá)明顯高于模型組和空白血清(P<0.05),而中藥組p53表達(dá)低于模型組和空白血清組,差異顯著(P<0.01);U0126阻斷ERK1/2信號通路后,中藥+抑制劑組與抑制劑組比較,p-ERK1/2表達(dá)無明顯增加(P>0.05),而p53表達(dá)明顯增加(P<0.05)。見表1。2.3細(xì)胞凋亡率與模型組(39.48±0.16)和空白血清組(37.12±1.96)比較,中藥組(29.73±0.85)細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.01);使用U0126阻斷ERK1/2信號通路后,抑制劑組凋亡率(47.73±0.33)顯著升高,而抑制劑與含藥血清合用后,細(xì)胞凋亡率(41.95±0.78)下降,差異顯著(P<0.05)。2.4caspase-3活性模型組(0.88±0.01)和空白血清組(0.78±0.09)比較,中藥組(0.42±0.02)caspase-3活性明顯降低(P<0.01);U0126阻斷ERK1/2信號通路后,中藥+抑制劑組(0.83±0.01)與抑制劑組(0.98±0.01)比較,caspase-3活性明顯降低(P<0.05)。3復(fù)元膠囊對小鼠骨髓細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)OA在祖國醫(yī)學(xué)屬于“痹證”、“骨痹”范疇,另根據(jù)其臨床表現(xiàn),又與腰痛、歷節(jié)病、鶴膝風(fēng)、白虎病等多種病名有一定關(guān)聯(lián)。中醫(yī)認(rèn)為腎元虧虛、肝血不足、氣虛血瘀是導(dǎo)致本病的根本內(nèi)因。復(fù)元膠囊是臨床上長期用于治療OA有明顯療效的經(jīng)驗方復(fù)元湯研制而成的中藥復(fù)方實驗制劑,由曬參、淫羊藿、鹿茸、黃芪、川芎、當(dāng)歸、枸杞子等組成,具有補(bǔ)益肝腎,益氣活血之功效,但是其分子水平的作用機(jī)制尚不十分清楚。OA是以關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)降解為特征的退行性關(guān)節(jié)疾病,軟骨細(xì)胞過度凋亡在OA的發(fā)病過程中起著重要作用。本實驗結(jié)果顯示,經(jīng)SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞在透射電鏡下可觀察到典型的凋亡形態(tài),包括細(xì)胞體積縮小、染色質(zhì)凝聚、核碎片、細(xì)胞皺縮、凋亡小體等。流式細(xì)胞儀檢測發(fā)現(xiàn),復(fù)元膠囊血清能降低軟骨細(xì)胞凋亡率,與模型組及空白血清組比較,差異顯著。復(fù)元膠囊血清能抑制軟骨細(xì)胞的過度凋亡,可能是復(fù)元膠囊治療OA的重要機(jī)制之一。MAPK信號通路廣泛存在于各種細(xì)胞,對細(xì)胞的生長與凋亡的調(diào)節(jié)起著十分重要的作用。目前,在哺乳動物細(xì)胞中已鑒定有3條MAPKs信號通路,包括細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)通路、c-Jun氨基末端激酶(JNK)通路、p38蛋白激酶通路。一般認(rèn)為,JNK和p38主要抑制細(xì)胞的生長,促進(jìn)細(xì)胞凋亡;而ERK則參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖。ERK在軟骨細(xì)胞中是一個存活信號,Ⅱ型膠原、軟骨蛋白多糖和整合素β1的表達(dá)都需ERK信號途徑的轉(zhuǎn)導(dǎo),抑制ERK將引起細(xì)胞凋亡。有研究報道,SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中,SNP的代謝產(chǎn)物NO能抑制ERKI/2磷酸化,降低其活性。本實驗結(jié)果顯示,SNP處理后的軟骨細(xì)胞表達(dá)p-ERK1/2顯著減少,而使用復(fù)元膠囊血清干預(yù)后,p-ERK1/2表達(dá)水平增加,表明復(fù)元膠囊通過促進(jìn)ERK1/2磷酸化而抑制軟骨細(xì)胞的凋亡。正常情況下,當(dāng)ERK1/2磷酸化被激活后,可作用于下游靶基因P53,抑制P53的過度表達(dá),從而調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡。而在SNP作用于軟骨細(xì)胞后,ERK1/2磷酸化被抑制,P53表達(dá)增加。在SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡ERK1/2信號轉(zhuǎn)導(dǎo)級聯(lián)反應(yīng)過程中,過度表達(dá)的P53作用于線粒體,使其膜電位以及通透性改變,釋放細(xì)胞色素C,從而激活caspase-3,引起細(xì)胞凋亡。caspase-3為關(guān)鍵的凋亡執(zhí)行分子,與DNA斷裂、染色質(zhì)凝聚和凋亡小體形成有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)用特異性抑制劑Z-VAD-FMK抑制caspase-3的活性后,軟骨細(xì)胞的凋亡率降低,OA病變減輕。本研究發(fā)現(xiàn),SNP處理后的軟骨細(xì)胞p53表達(dá)明顯增加,caspase-3活性增強(qiáng)。經(jīng)復(fù)元膠囊血清干預(yù)后,軟骨細(xì)胞p53表達(dá)和caspase-3活性明顯降低,表明復(fù)元膠囊血清能通過促進(jìn)p-ERK1/2的表達(dá)而作用其下游靶基因p53和caspase-3,使p53表達(dá)減少、caspase-3活性降低。但是,當(dāng)用ERK1/2的特異性抑制劑U0126阻斷ERK1/2信號通路后,軟骨細(xì)胞的凋亡水平顯著提高,表明p-ERK1/2激酶在軟骨細(xì)胞凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。U0126和復(fù)元膠囊血清聯(lián)合使用時,其凋亡水平下降,p53表達(dá)減少,caspase-3活性明顯降低,而p-ERK1/2表達(dá)增加卻不明顯,表明復(fù)元膠囊血清可能還通過其他信號通路如p38、NF-κB等抑制SNP誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡,通過幾條通路共同作用或者相互作用,發(fā)揮自身獨(dú)特的多靶點效應(yīng)?？傊?復(fù)元膠囊血清通過增加p-ERK1/2蛋白表達(dá),降低ERK1/2下游靶基因p53表達(dá)以及caspase-3活