電針對慢性應(yīng)激抑郁大鼠腦內(nèi)erk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

電針對慢性應(yīng)激抑郁大鼠腦內(nèi)erk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響

細(xì)胞外信號的調(diào)節(jié)（erk）信號通道在調(diào)節(jié)交感神經(jīng)的生長、殖長、分化和生存方面發(fā)揮著重要作用，對提高和指導(dǎo)大腦的發(fā)育、學(xué)習(xí)和記憶有重要影響。研究結(jié)果表明,抑郁大鼠海馬和額葉皮質(zhì)區(qū)的ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路活性水平顯著降低,而抗抑郁藥物能夠逆轉(zhuǎn)ERK信號通路的損傷,并顯著地緩解抑郁行為,提示抗抑郁藥物作用于ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。以往的實驗結(jié)果證明,電針通過上調(diào)海馬組織中的抗凋亡因子和生長相關(guān)蛋白的表達(dá)水平,減少海馬神經(jīng)元凋亡,促減少海馬神經(jīng)元凋亡,改善慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為變化。本研究通過觀察電針對慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠腦內(nèi)Ras-Raf-MEK-ERK-RSK通路關(guān)鍵指標(biāo)的影響,探討針刺抗抑郁作用分子機(jī)制。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周健康雄性SD大鼠32只,體質(zhì)量(180±20)g,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,許可證號:SCXK(京)2006-2009。所有大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。百優(yōu)解(美國禮來公司,批號:J20030017);一抗、二抗(美國,CellSignalingTechnology);BCA試劑盒(普利萊基因有限公司);電針儀(HANS,LH-202型,北京華衛(wèi)產(chǎn)業(yè)開發(fā)公司);電泳儀(北京六一儀器廠)。電針、百優(yōu)解和海馬ras、c-raf、p-erk的檢測將大鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、電針組、百優(yōu)解組,每組8只。參考文獻(xiàn)方法,除空白組大鼠外均接受21d不可預(yù)測的慢性應(yīng)激刺激,包括斷食(24h)、斷水(24h)、晝夜顛倒(24h)、冷水游泳(10℃,5min)、熱應(yīng)激(45℃,5min)、夾尾3min、束縛3h。實驗過程中每種刺激平均3次?？瞻捉M大鼠不接受任何應(yīng)激刺激,自由進(jìn)食飲水。模型組大鼠按照造模方法每天接受1種不同的應(yīng)激刺激。電針組大鼠每天應(yīng)激刺激前1h接受電針干預(yù)。參照《實驗針灸學(xué)》,選取“百會”“印堂”穴,平刺進(jìn)針,針柄連接韓氏LH-202型電針儀,電針頻率為2Hz,電流強(qiáng)度為0.6mA,以大鼠頭部微顫為宜,每次20min,共21d。百優(yōu)解組大鼠每天應(yīng)激刺激前1h接受百優(yōu)解灌胃干預(yù),百優(yōu)解用蒸餾水配成1.8mg/kg,按10mL/kg給藥,共21d。實驗結(jié)束后,每組隨機(jī)取5只大鼠斷頭處死取腦,于冰上分離出海馬。用Westernblot方法檢測海馬中的Ras、c-raf、p-c-raf、ERK及p-ERK的含量。取100mg海馬組織加500μL組織裂解液(普利萊基因有限公司提供),勻漿后進(jìn)行4℃,1200r/min離心15min,取上清液BCA法測定蛋白質(zhì)濃度。每孔上樣50μg,12.5%SDS分離樣品,電泳、轉(zhuǎn)膜后將膜裝入5%脫脂奶粉封閉液,置室溫?fù)u床上持續(xù)搖動1h;加一抗于4℃冰箱孵育過夜;加二抗室溫?fù)u床上持續(xù)搖動1h,最后顯色,曝光,顯影,定影。實驗數(shù)據(jù)以ue0af±s表示,數(shù)據(jù)處理采用SPSS19.0進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示具有顯著性差異。各組大鼠海馬c-raf蛋白表達(dá)水平比較見表1,圖1。各組大鼠之間海馬中Ras蛋白含量無顯著差異,但電針組和百優(yōu)解組較模型組有升高趨勢。見表2,圖2。各組大鼠海馬中c-raf、p-c-raf蛋白含量無顯著差異,但電針組和百優(yōu)解組大鼠海馬c-raf蛋白含量較模型組有升高趨勢。見表3,圖3。各組大鼠海馬中ERK含量無顯著差異。海馬中p-ERK水平模型組顯著低于空白組(P<0.05),電針組與百優(yōu)解組大鼠海馬p-ERK水平較模型組顯著提高(P<0.05)。ras-rafmek-rsk信號通路缺失菌株絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinase,MAPK)是真核生物中廣泛存在的一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是多種細(xì)胞外信號從細(xì)胞表面?zhèn)鲗?dǎo)到細(xì)胞內(nèi)的重要傳遞者。目前已確定有4條MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,即ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、c-jun氨基末端激酶(c-junN-terminalkinase,JNK)/應(yīng)激活化蛋白激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、ERK5/大絲裂素活化蛋白激酶轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和p38MAPK(p38mitogenactivatesproteinkinases,p38MAPK)。其中ERK與JNK是MAPK家族的重要成員,兩者能應(yīng)答多種胞外刺激,如應(yīng)激刺激、分裂素、生長因子、腫瘤壞死因子等而參與調(diào)節(jié)增殖、運(yùn)動、死亡及DNA損傷修復(fù)等多個細(xì)胞生命過程。胞外信號如生長因子、神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞因子、神經(jīng)遞質(zhì)與細(xì)胞膜相應(yīng)受體結(jié)合最后導(dǎo)致蛋白激酶級聯(lián)途徑Ras-RafMEK-ERK-RSK被相繼的線性激活。首先生長因子受體酪氨酸激酶激活Ras,激活的Ras與絲-蘇氨酸蛋白激酶Raf-1氨基末端域結(jié)合并將募集到后膜,完成對Raf-1的激活,其C端催化區(qū)域能與MEK后者使MEK結(jié)合,并使MEK催化區(qū)中Thr和Ser磷酸化,從而使MEK激活。MEK可使ERK的酶催化區(qū)域的TXT序號磷酸化而活化。激活后的ERK通過磷酸化激活一系列細(xì)胞膜表面以及細(xì)胞質(zhì)、細(xì)胞核內(nèi)的類似核糖體S6蛋白激酶(RSK)的蛋白激酶底物,并與之共同入核的方式促進(jìn)環(huán)腺苷酸反應(yīng)元件蛋白(CREB)等重要轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化,從而調(diào)節(jié)相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。ERK是Ras絲裂原信號轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的核心元件。中樞神經(jīng)系統(tǒng)的ERK信號通路還對腦內(nèi)突出可塑性和學(xué)習(xí)記憶的形成起到重要作用。應(yīng)激能降低大鼠海馬組織的ERK1/2的活性,而抗抑郁藥能使抑郁模型大鼠海馬組織的ERK1/2的活性恢復(fù)正常水平有關(guān)。研究發(fā)現(xiàn),海馬ERK信號通路被阻斷大鼠表現(xiàn)了抑郁癥的核心癥狀快感缺乏和明顯的焦慮行為,并且有一定的腦區(qū)特異性。通過本實驗發(fā)現(xiàn),各組大鼠腦組織內(nèi)ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的上游信號分子的表達(dá)沒有顯著差異,但電針組和百優(yōu)解組大鼠海馬中磷酸化ERK的水平明顯高于模型組,說明電針對ERK信號通路的上游指標(biāo)作用不明顯,而主要作用于ERK蛋白的磷酸化啟動對該通路的活化進(jìn)而發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)。這與以往的研究結(jié)果一致。綜上所述,慢性應(yīng)激狀態(tài)下,大鼠出現(xiàn)抑郁樣行為改變和學(xué)習(xí)記憶下降與海馬組織受損密切相關(guān)。慢性應(yīng)激使大鼠海馬中ERK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能異常,尤其對下游信號分子功能下降明顯,電針能提高慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬內(nèi)REK的磷酸水平進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞核內(nèi)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及功能,改善抑郁大鼠海馬組織的損害,發(fā)揮抗抑郁作用。ERK信號通路可能是針刺抗抑郁作用的分子機(jī)制之一。至于磷酸化的ERK在細(xì)胞核內(nèi)的作用機(jī)