電針治療慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及jnk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化

電針治療慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠海馬神經(jīng)元凋亡及jnk信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的變化

針灸和艾灸治療有很好的臨床效果，但其作用機(jī)制尚不完全清楚。許多研究報道不同的應(yīng)激刺激可以通過激活JNK蛋白激酶(c-JunNterminalkinase,JNK)信號途徑引起海馬神經(jīng)元凋亡。我們的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠JNK蛋白激酶信號系統(tǒng)活化及引起相應(yīng)的海馬神經(jīng)元異常凋亡參與了抑郁癥的病理生理過程,前期的研究結(jié)果表明電針可以對慢性應(yīng)激抑郁相關(guān)的信號通路上關(guān)鍵指標(biāo)產(chǎn)生影響。在此研究基礎(chǔ)上,我們使用電針治療慢性應(yīng)激抑郁模型大鼠,以期觀察電針對海馬神經(jīng)元凋亡及JNK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響。1材料和方法1.1實驗動物及分組雄性SD大鼠[動物許可證號:SCXK(京)2006-0009],體重(200±20)g,共65只,由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供,隨機(jī)分為空白組、空白電針組、模型組、電針組、百優(yōu)解組,每組13只。各組大鼠在實驗前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。應(yīng)激結(jié)束后從每組中隨機(jī)抽出5只進(jìn)行免疫印跡(Westernblot)檢測,其余大鼠用于流式細(xì)胞凋亡檢測。1.2多次刺激的多次參考文獻(xiàn)方法,造模動物全部接受孤養(yǎng)。大鼠共接受21d各種不同刺激,包括:斷食24h、斷水24h、晝夜顛倒24h、冷水游泳(10℃,5min)、熱應(yīng)激(45℃,5min)、夾尾3min、束縛3h,每種刺激平均使用3次?？瞻捉M和空白電針組大鼠不接受上述任何刺激,每籠6~7只飼養(yǎng)。1.3應(yīng)激造模干預(yù)空白組:動物不接受任何刺激,自由攝食飲水飼養(yǎng)?？瞻纂娽樈M:動物每天進(jìn)行電針處理,電針方法同電針組。模型組:動物每天進(jìn)行慢性應(yīng)激造模處理。電針組:動物每天進(jìn)行慢性應(yīng)激造模處理,同時在每天應(yīng)激刺激前1h進(jìn)行電針干預(yù)。選取“百會”“印堂”穴,用30號1寸毫針(2.5cm)平刺進(jìn)針,深度為0.5~1.0cm,然后接HANSLH-202型電針治療儀,電針頻率為2Hz,電流強(qiáng)度為0.6mA左右,以大鼠頭部微顫為宜。每次電針20min,每日1次,連續(xù)針刺21d。百優(yōu)解組:動物每天進(jìn)行應(yīng)激造模處理,同時在每天應(yīng)激刺激前1h進(jìn)行百優(yōu)解(鹽酸氟西汀,美國禮來公司生產(chǎn),批號:J20030017)灌胃干預(yù)。百優(yōu)解用蒸餾水配成0.18mg/mL,按10mL/kg給藥。以上各組同步平行實驗,共計21d。1.4大鼠在vmin內(nèi)活動參考文獻(xiàn)方法制作80cm×80cm×40cm的周邊不透明的立方型敞箱,將箱底用白線劃分為面積相等的25塊。室內(nèi)隔音保持安靜狀態(tài)下將大鼠放置于敞箱底面的中心方格內(nèi),然后開始記錄大鼠在3min內(nèi)的活動。以穿越底面塊數(shù)為水平穿越格數(shù)(記錄四爪均進(jìn)入的方格),以兩前肢離開地面直立數(shù)為豎立活動次數(shù),每只動物只測1次,分別于實驗前1天和實驗第22天進(jìn)行。1.5碘化丙錠pi單染的制備慢性應(yīng)激程序及行為學(xué)測試結(jié)束后,各組8只大鼠以3.5mL/kg的10%水合氯醛腹腔注射麻醉,斷頭取腦。于冰上分離出海馬組織,先用冷生理鹽水沖洗1次,再用200目網(wǎng)篩網(wǎng)搓法制成單細(xì)胞懸液。將制備好的單細(xì)胞懸液依照錨定蛋白V(AnnexinV)異硫氰酸熒光素(FITC)試劑盒操作說明進(jìn)行處理:4℃、2000r/min離心5min;棄上清,加預(yù)冷的PBS混勻1mL,吸出一半放入另一空管內(nèi),再將剩下的一半進(jìn)行同上離心后用來做碘化丙錠(PI)單染。上述空管中的一半加入3mLPBS,用迷你離心機(jī)混勻振蕩離心5min,棄上清,然后加入200μL的結(jié)合Buffer;再次混勻振蕩;再加入5μLAnne-xinV-FITC和10μL的20μg/mLPI溶液,將其混勻后于室溫避光孵育15min;最后在反應(yīng)管中加入400μLPBS,上FACScan型流式細(xì)胞檢測儀(美國Becton-Dickinson公司)分析。1.6western-q病:蛋白質(zhì)定量檢測①腦組織蛋白提取及測定:慢性應(yīng)激程序及行為學(xué)測試結(jié)束后,各組5只大鼠迅速被斷頭處死,取腦,分離出海馬組織。取100mg組織加500μL組織裂解液(普利萊基因有限公司提供),勻漿后,以12000r/min速度在4℃離心15min,取上清液用于蛋白定量檢測(BCA蛋白定量檢測試劑盒由普利萊基因有限公司提供)。②SDS-聚炳烯酰胺凝膠電泳(SDS):從上述提取的樣品中取出20μg總蛋白,用10%SDS在4℃、20mA條件下進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后,在4℃、400mA條件下將蛋白質(zhì)從SDS轉(zhuǎn)到硝酸纖維素膜上。③抗體免疫反應(yīng):按產(chǎn)品使用說明書使用一抗JNK/p-JNK(購自美國CellSignallingTechnology)、二抗-actin(購自中杉金橋公司)。④化學(xué)發(fā)光顯影及凝膠圖像分析:將顯影并定影好的膠片進(jìn)行掃描,用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈吸光度值。1.7統(tǒng)計學(xué)處理實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(xˉ±s)(xˉ±s)表示,用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS16.0對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析。組間比較采用單因素方差分析和最小顯著差法(LSD),P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)。2結(jié)果2.1各組患兒的樹立次數(shù)、越界次數(shù)比較由圖1和圖2可見,造模前,各組間的水平穿越格數(shù)和豎立次數(shù)的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。造模結(jié)束后,模型組與空白組相比,水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)明顯減少(均P<0.05);電針組與百優(yōu)解組水平穿越格數(shù)、豎立次數(shù)較模型組明顯增多(均P<0.05)?？瞻纂娽樈M行為學(xué)無明顯改變。*P<0.05與空白組比較(vsthecontrolgroup);#P<0.05與模型組比較(vsthemodelgroup).*P<0.05與空白組比較(vsthecontrolgroup);#P<0.05與模型組比較(vsthemodelgroup).2.2電針組ftc由圖3可見,模型組海馬神經(jīng)元凋亡率高于空白組及空白電針組(P<0.05);電針組及百優(yōu)解組凋亡率低于模型組(均P<0.05),且電針組低于百優(yōu)解組(P<0.05)。在雙變量流式細(xì)胞儀的散點(diǎn)圖上,凋亡細(xì)胞FITC染色陽性而正常活細(xì)胞染色陰性。左下象限顯示活細(xì)胞(FITC-/PI-),右下象限顯示凋亡細(xì)胞(FITC+/PI-),右上象限顯示繼發(fā)性壞死細(xì)胞(FITC+/PI+),左上象限顯示機(jī)械損傷細(xì)胞(FITC-/PI+)。由圖3可見,右下象限凋亡細(xì)胞密度,模型組明顯高于其它各組,以電針組最低。2.3對百優(yōu)解組wagraprcract的預(yù)測和檢測圖4為磷酸化JNK(phospho-JNK)和總JNK的免疫印跡結(jié)果,JNK包括JNK1(分子量為46kD)、JNK2(分子量為54kD)和JNK3(分子量為54kD)。各組大鼠海馬組織提取物與JNK磷酸化抗體雜交后的蛋白印跡可見,海馬組織內(nèi)只有模型組JNK的磷酸化水平明顯增高。用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈吸光度值,算出各組被磷酸化的JNK占總JNK的百分?jǐn)?shù),并經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理,結(jié)果表明,各組大鼠海馬組織中JNK磷酸酶活化,模型組高于空白組和空白電針組(均P<0.05),電針組、百優(yōu)解組均低于模型組(P<0.05)。Leftpanel:scatterplotsofflowcytometryshowingtheapoptoticcellsintherightinferiorquadrant(FITC+/PI-),secondarydeadcellsintherightsuperiorquadrant(FITC+/PI+),livingcellsintheleftinferiorquadrant(FITC-/PI-)indiffe-rentgroups.Rightpanel:histogramsshowingtheapoptoticratesofhippocampalneuronsindifferentgroups(xˉ±s).?P<0.05(xˉ±s).*Ρ<0.05與空白組及空白電針組比較(vsthecontrolandcontrol+EAgroups);#P<0.05與模型組比較(vsthemodelgroup);△P<0.05與百優(yōu)解組比較(vstheProzacgroup).Leftpanel:gelelectrophoresisstripsofWesternblotshowingtheexpressionofhippocampalp-JNKproteinindifferentgroups.Rightpanel:histogramsshowingtheexpressionlevelsofhippocampalp-JNKindifferentgroups(xˉ±s).(xˉ±s).A:空白組(controlgroup);B:空白電針組(control+EAgroup);C:百優(yōu)解組(Prozacgroup);D:模型組(modelgroup);E:電針組(EAgroup).#P<0.05與空白組和空白電針組比較(vsthecontrolandcontrol+EAgroups);△P<0.05與模型組比較(vsthemodelgroup).3慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬神經(jīng)元凋亡本實驗采用目前國內(nèi)外普遍接受的慢性應(yīng)激抑郁模型,該模型由KatzRJ提出,經(jīng)Willner等的改進(jìn)逐漸形成,與人類抑郁癥中慢性、低水平的應(yīng)激源促進(jìn)疾病發(fā)生、加速疾病發(fā)展的機(jī)制更接近。本實驗?zāi)Ｐ徒M動物表現(xiàn)出抑郁狀態(tài),興趣喪失,而使用了電針干預(yù)和百優(yōu)解干預(yù)之后,大鼠的抑郁狀態(tài)明顯改善。海馬是與學(xué)習(xí)、記憶、行為和情緒密切相關(guān)的重要腦區(qū),也是應(yīng)激損傷的主要靶器官。海馬神經(jīng)元損傷可能是誘發(fā)抑郁癥的器質(zhì)性基礎(chǔ)之一。應(yīng)激在抑郁的發(fā)病中起關(guān)鍵作用,應(yīng)激對細(xì)胞凋亡和神經(jīng)再生的損害可以通過抗抑郁藥物緩解。AnnexinV/PI雙染色法是目前最為理想的凋亡定量檢測方法。本實驗通過散點(diǎn)圖統(tǒng)計結(jié)果分析看到,模型組大鼠海馬組織的細(xì)胞早期凋亡率明顯高于其它各組,提示慢性應(yīng)激抑郁大鼠海馬組織細(xì)胞存在明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象。而電針組、百優(yōu)解組大鼠海馬組織的細(xì)胞凋亡率明顯降低,提示電針和百優(yōu)解干預(yù)可在改善慢性應(yīng)激抑郁大鼠行為學(xué)癥狀的同時減低海馬神經(jīng)元凋亡率。JNK屬絲裂原激活的蛋白激酶(MAPK)家族。MAPK為一類存在于所有真核細(xì)胞內(nèi)的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄因子為其主要的作用底物。JNK的作用底物全部為轉(zhuǎn)錄因子,JNK在細(xì)胞生長、細(xì)胞分化和細(xì)胞死亡中起重要作用。MAPK/JNK通路主要由應(yīng)激刺激所激活。許多研究結(jié)果表明,