復(fù)元膠囊對實(shí)驗(yàn)性大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織蛋白聚糖酶1、2的影響

復(fù)元膠囊對實(shí)驗(yàn)性大鼠膝骨關(guān)節(jié)炎軟骨組織蛋白聚糖酶1、2的影響

骨關(guān)節(jié)炎（oa）的主要特征是關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的死亡和外土壤因素的進(jìn)展性退化。蛋白聚糖酶屬于帶有血小板反應(yīng)蛋白結(jié)構(gòu)域單元的裂解素和金屬蛋白酶(ADAMTs)家族。近年研究發(fā)現(xiàn)在OA早期,ADAMTS是降解蛋白多糖的主要酶系,比基質(zhì)金屬蛋白酶(MMPs)作用大約提前3w左右,且抑制AD-AMTS-4和ADAMTS-5能有效防止關(guān)節(jié)軟骨的破壞,其降解部位主要在蛋白多糖核心蛋白球間區(qū)域(IGD)的Glu373-Ala374作用位點(diǎn)〔2,3〕。復(fù)元膠囊是在長期臨床實(shí)踐的基礎(chǔ)上總結(jié)出來的治療OA的中藥復(fù)方制劑,臨床觀察發(fā)現(xiàn)其對OA的療效確切,不良反應(yīng)少。前期研究顯示,復(fù)元膠囊通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、MMPs及其抑制劑(TIMPs)和生長因子之間的平衡〔4〕,抑制軟骨中誘導(dǎo)性一氧化碳合酶(iNOS)的表達(dá),減少NO的產(chǎn)生〔5〕,減少Ⅱ型膠原和蛋白多糖的降解〔6〕,促進(jìn)細(xì)胞增殖,減少細(xì)胞凋亡,從而發(fā)揮對OA的防治作用〔7〕。本文觀察不同濃度復(fù)元膠囊對關(guān)節(jié)軟骨中ADAMTS-4和ADAMTS-5表達(dá)的影響。1藥物、試劑和儀器雄性8周齡SD大鼠60只,體重(200±10)g,由重慶醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號:SYXK(渝)2012-0001。復(fù)元膠囊:重慶希爾安藥業(yè)公司生產(chǎn)(批準(zhǔn)文號:渝衛(wèi)2002〔42-33〕),由黃芪、人參、川芎、丹參、淫羊藿、鹿角膠、肉蓯蓉、骨碎補(bǔ)、枸杞子等中藥組成,每粒0.41g,每克粉末含生藥3g;抗骨增生膠囊:江蘇康緣股份有限公司生產(chǎn),生產(chǎn)批號:110402。ADAMTS-4和ADAMTS-5多克隆抗體,購于美國SantaCruz公司;SABC試劑盒及DAB顯色劑購于武漢博士德生物工程有限公司;軟骨總提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒及2XEsTaqMasterMix(含染料)均來自于北京康為世紀(jì);ADAMTS-4、ADAMTS-5及內(nèi)參GAPDH引物由TakaRa公司合成(見表1);SDS凝膠試劑盒、RIPA蛋白提取試劑盒均由碧云天公司生產(chǎn)。BX50型光學(xué)顯微鏡來自日本OLYMPUS公司;DNAenginePT-200PCR儀、BIO-RAD電泳儀及BIO-RAD凝膠成像儀來自美國BIORAD公司。1.2表達(dá)抗-rad-pcr檢測ca-射線衍射蛋白切片脫蠟至水,3%H2O2室溫15min滅活內(nèi)源性過氧化物酶。沖洗后PBS浸泡5min,胰蛋白酶消化液修復(fù)抗原活性20min,正常山羊血清封閉,分別滴加1∶50的稀釋抗大鼠AD-AMTS-4和ADAMTS-5多克隆抗體(美國SantaCruz公司),4℃孵育過夜。PBS沖洗5min,3次。滴加生物素標(biāo)記的二抗(武漢博士德),37℃孵育30min,PBS沖洗5min,3次。滴加SABC-HRP(武漢博士德),37℃孵育30min。PBS沖洗5min,3次。DAB室溫下顯色至滿意,自來水終止反應(yīng)。蘇木素復(fù)染3min,洗去多余染液,鹽酸酒精分化2s,碳酸鋰復(fù)染1min,酒精梯度脫水后封片,顯微鏡下觀察。圖像分析:每個(gè)標(biāo)本取5張切片,每張切片OLYMPUSBX50顯微鏡下放大200倍,隨機(jī)取5個(gè)視野,采用Image-ProPlus圖像分析軟件測定陽性染色平均累積光密度(IOD)。取損傷區(qū)軟骨30mg在液氮中研磨成粉末,然后用TRIzol提取總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測樣品吸光度(A),A260/A280為1.8-2.0。每組取1μl總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA(dNTPMix,2.5mmol/LEach4U、PrimerMix2μl、RNATemplate2μl、5×RTBuffer4μl、DTT,0.1mol/L、HiFi-MMLV,200U/μl,1μl、RNase-freeWater5μl)。取cDNA1μl進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增完畢后取5μl產(chǎn)物于含50μl/LGoldViewTM核酸染料的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳,用BRO-RAD凝膠圖像分析軟件檢測各組目的基因及內(nèi)參的光密度值。于-80℃中取出軟骨組織,用RIPA試劑盒(碧云天公司)提取蛋白,BCA法測定蛋白濃度后,按每孔50μg上樣,在10%的SDS凝膠上電泳后,用濕法轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至0.45μm孔徑的PVDF膜上,用5%BSA在37℃條件下封閉2h后,分別敷上抗ADAMTS-4、ADAMTS-5及抗β-actin的多克隆抗體(1∶50稀釋),在4℃過夜,用TBST洗3次,每次15min。然后分別敷上羊抗兔及抗小鼠抗體,37℃條件下放置1h后,用TBST沖洗3次,每次15min。在暗室中敷上BeyoECL發(fā)光液,用ChemiDocXRS凝膠/發(fā)光圖像分析系統(tǒng)對蛋白條帶進(jìn)行顯影,并采用QuantitiyOne軟件計(jì)算條帶的灰度值。應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件,計(jì)量資料數(shù)據(jù)以ue0af±s表示,采用單因素方差分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理,兩兩比較采用T檢驗(yàn)。2復(fù)元膠囊對小鼠軟骨組織及蛋白表達(dá)的影響正常組軟骨組織4層結(jié)構(gòu)清晰,軟骨表層光滑平整,細(xì)胞排列整齊,基質(zhì)染色均勻,潮線清晰Mankin評分為(0.33±0.08)分;模型組軟骨組織層變薄,表層裂隙交錯(cuò)分布,細(xì)胞數(shù)目變少,排列紊亂,潮線嚴(yán)重?cái)嗔涯：齅ankin評分為(6.9±0.30)分;抗骨增生膠囊組軟骨表面欠光整,細(xì)胞層數(shù)增多,排列稍顯紊亂,潮線部分?jǐn)嗔袽ankin評分為(4.1±0.83分);復(fù)元膠囊低劑量組軟骨表層可見少許裂隙,細(xì)胞數(shù)減少,排列紊亂,有空泡樣改變出現(xiàn),潮線稍顯紊亂Mankin評分為(5.6±0.48)分;復(fù)元中劑量組軟骨組織染色較均勻,細(xì)胞層有增生且細(xì)胞數(shù)增多Mankin評分?jǐn)?shù)為(4.3±0.45)分;復(fù)元高劑量組軟骨組織表層尚且光滑平整,細(xì)胞有明顯增生,中深層有少量細(xì)胞簇聚,可見雙重潮線Mankin評分為(2.4±0.66)分。正常組軟骨在表層見少許陽性細(xì)胞;模型組及其余各組軟骨組織見不同程度著色,軟骨細(xì)胞的胞質(zhì)中可見黃色顆粒著色,ADAMTS-4和ADAMTS-5均主要在胞質(zhì)表達(dá),以表層最為明顯;復(fù)元膠囊中劑量組和高劑量組與模型組相比,ADAMTS的表達(dá)有明顯減少,尤其以ADAMTS-5最為顯著,且復(fù)元高劑量組減少程度顯著(P<0.01);與抗骨增生膠囊組比較,復(fù)元膠囊高劑量組ADAMTS-4及ADAMT-5表達(dá)低于抗骨增生膠囊組(P<0.01,P<0.05)。見表2,圖1,圖2。各組軟骨組織提取的RNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增后,電泳顯示強(qiáng)弱不等的熒光(圖3)。經(jīng)圖像軟件分析結(jié)果顯示,模型組ADAMTS-4及ADAMTS-5表達(dá)顯著增加,與其余各組比較,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01);與抗骨增生膠囊組比,復(fù)元膠囊高劑量組ADAMTS-4和ADAMT-5的mRNA的表達(dá)量明顯降低(P<0.05),而復(fù)元膠囊低劑量組和中劑量組表達(dá)無明顯改變,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表3。與正常組比較,模型組軟骨組織中ADAMTS-4和ADAMTS-5的蛋白表達(dá)量顯著增高(P<0.01);ADAMTS-4及ADAMTS-5在抗骨增生膠囊組和復(fù)元膠囊各組的蛋白表達(dá)量均較模型組顯著降低(P<0.01),復(fù)元膠囊低劑量組和中劑量組較之抗骨增生膠囊組差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),復(fù)元膠囊高劑量組的表達(dá)量顯著低于抗骨增生膠囊組(P<0.05)。見圖4,表4。3蛋白多糖的降解在OA病變早期,以細(xì)胞外基質(zhì)的降解為主,基質(zhì)主要由膠原和蛋白多糖構(gòu)成,其中蛋白多糖占關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)干重的40%,以軟骨聚集蛋白多糖的形式存在〔10〕。在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),只有蛋白多糖降解后Ⅱ型膠原才緩慢降解。MMPs和蛋白聚糖酶均能降解蛋白多糖,其中ADAMTS-4和ADAMTS-5是主要的蛋白聚糖酶〔11〕,ADAMTS-4與ADAMTS-5結(jié)構(gòu)相似,均具有前肽區(qū)、催化區(qū)、解聚素樣區(qū)、血小板凝血酶敏感蛋白樣序列1區(qū)(TSP-1)、半胱氨酸富含區(qū)及間隔區(qū),其中ADAMTS-5還有一個(gè)血小板凝血酶敏感蛋白樣序列2區(qū)(TSP-2),TSP區(qū)可與ECM結(jié)合,參與蛋白多糖的降解。蛋白聚糖酶可在多個(gè)位點(diǎn)裂解蛋白多糖,一是核心蛋白G2-G3的硫酸軟骨素富集區(qū)的4個(gè)位點(diǎn);二是傳統(tǒng)球間區(qū)G1-G2(IGD)的作用位點(diǎn)。Glasson等〔12〕在敲除的ADAMTS-5和ADAMTS-4基因的小鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在炎性和非炎性骨關(guān)節(jié)炎中,敲除ADAMTS-5基因可減少對小鼠軟骨組織中的蛋白多糖的降解,而敲除ADAMTS-4無此作用。Stanton等〔13〕通過在小鼠體內(nèi)和體外實(shí)驗(yàn)中證明去除ADAMTS-5活性能對抗蛋白多糖的降解。隨著基因敲除及轉(zhuǎn)基因技術(shù)的引入,蛋白聚糖酶對OA病程中蛋白多糖的降解作用得到進(jìn)一步確定,因此西醫(yī)做出大量的努力用來研發(fā)聚蛋白聚糖酶的小分子抑制劑〔14〕,在治療骨關(guān)節(jié)炎上尋找突破,而在中醫(yī)對OA的治療方面的研究才剛剛起步。中醫(yī)認(rèn)為骨關(guān)節(jié)炎屬于“骨痹”范疇。其病因病機(jī)為:氣血不足,肝腎虧虛,風(fēng)寒濕侵入骨髓,痹阻經(jīng)絡(luò)導(dǎo)致筋骨失養(yǎng),證屬肝腎虧虛、氣滯血瘀,治法以補(bǔ)腎壯骨,益氣活血為主。復(fù)元膠囊中人參、黃芪益氣活血,具有抗疲勞、抗缺氧、增強(qiáng)機(jī)體適應(yīng)能力的作用;川芎、丹參行氣活血,其有效成分川芎嗪和阿魏酸有改善微循環(huán)的作用,且有研究表明川芎嗪能有效防治骨關(guān)節(jié)炎。鹿茸、淫羊藿補(bǔ)腎壯陽、強(qiáng)筋健骨,有調(diào)節(jié)免疫和促性腺激素樣作用,而研究發(fā)現(xiàn)性激素通過促進(jìn)軟骨細(xì)胞中生長因子的表達(dá),抑制多種炎癥因子的表達(dá),影響細(xì)胞外基質(zhì)的合成和降解,達(dá)到延緩OA的病程進(jìn)展的作用〔15〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,復(fù)元膠囊能夠通過抑制ADAMTS-4和ADAMTS-5的產(chǎn)生,減少蛋白多糖的降解,從而減輕關(guān)節(jié)軟骨的損傷,延緩0A的發(fā)展進(jìn)程。1.1材料表面1.2.1肌注激素抗感染聯(lián)合免疫組化模型將60只大鼠隨機(jī)分為正常組,模型組,抗骨增生膠囊組,復(fù)元膠囊低、中、高劑量組,每組10只。Hulth法〔8〕建立OA模型,用10%水合氯醛按照0.3ml/100g腹腔注射麻醉大鼠,在無菌條件下切斷大鼠右膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)副韌帶,完整切除內(nèi)側(cè)半月板及剪斷前后交叉韌帶逐層縫合,無菌包扎。術(shù)后給予肌注青霉素抗感染,共7d。術(shù)后1w開始每天驅(qū)趕大鼠跑步30min,共驅(qū)趕4w。正常組大鼠不給予任何處理。1.2.2復(fù)元膠囊的配置依據(jù)Meeh-Rubner公式計(jì)算大鼠的等效給藥劑量,復(fù)元膠囊低、中、高劑量組分別給予復(fù)元膠囊371.65、743.30、2229.90mg·kg-1·d-1,抗骨增生膠囊組給予抗骨增生膠囊557mg·kg-1·d-1,均配置成3ml溶液,正常組和模型組給予生理鹽水灌胃,于術(shù)后第2周開始,每天灌胃1次,共4w。1.2.3軟骨組織病理學(xué)檢測于治療后第4周處死各組大鼠共60只,觀察并記錄關(guān)節(jié)囊、滑膜、關(guān)節(jié)軟骨及關(guān)節(jié)液的一般情況,取脛骨平臺(tái)全層軟骨連同軟骨下骨標(biāo)本,將其中一部分放置在-80℃冰箱保存,一部分在4%多聚甲醛溶液中固定24h,10%EDTA脫鈣15d,常規(guī)石蠟包埋后切片,HE染色觀察軟骨組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞數(shù)量和潮線的完整性。依據(jù)Mankin法〔9〕評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分,0級為正常;1級為表層破壞;2級為血管翳及表層破壞;3級為淺層裂隙形成;4級為局限性深達(dá)骨質(zhì)的裂隙;5級為大面積深達(dá)骨質(zhì)的