家族性低鉀型周期性麻痹基因的篩查

家族性低鉀型周期性麻痹基因的篩查

核電站低鉀周期性麻痹（hypkamase，hyp）是一種正常染色體的顯性遺傳疾病，發(fā)病率為1.105。該病分為家族性和散發(fā)性2型,西方國(guó)家以家族性多見,亞洲各國(guó)以散發(fā)性多見。其臨床特征為發(fā)作性肌無(wú)力伴隨血清鉀濃度降低,肌無(wú)力經(jīng)常涉及四肢,嚴(yán)重患者可死于呼吸肌麻痹或血清鉀濃度降低所致的心律失常。近年來(lái),通過(guò)遺傳學(xué)、分子生物學(xué)和電生理學(xué)的聯(lián)合研究發(fā)現(xiàn),HOKPP是由離子通道基因突變所致的離子通道病,涉及的離子通道基因主要有CACNA1S、SCN4A、KCNE3(分別編碼骨骼肌電壓門控鈣通道α1亞單位、鈉通道α亞單位和鉀通道輔助亞單位MiRP2)。目前已發(fā)現(xiàn)CACNA1S存在R528H/G、R1239H/G突變(位于外顯子11和30),SCN4A基因存在R669H、R672H/G/C/S突變(位于外顯子12)和P1158S突變(位于外顯子19)。有報(bào)道編碼骨骼肌鉀通道輔助亞單位MiRP2基因KCNE3的R83H突變也與HOKPP相關(guān),但此結(jié)論尚存在爭(zhēng)議。與CACNA1S突變相關(guān)的HOKPP被定義為Ⅰ型,與SCN4A突變相關(guān)的HOKPP被定義為Ⅱ型。西方國(guó)家統(tǒng)計(jì)Ⅰ型HOKPP約占患病人數(shù)的69.0%,Ⅱ型約占8.6%,約22.4%沒有找到相關(guān)突變。HOKPP不僅具有基因異質(zhì)性,同時(shí)具有表型異質(zhì)性。不同突變的臨床表型,包括首發(fā)年齡、發(fā)作時(shí)血清鉀水平、發(fā)作持續(xù)時(shí)間、持久性肌無(wú)力的發(fā)生率、性別外顯率、對(duì)藥物的反應(yīng)等都不盡相同。而且,不同種族在突變好發(fā)位點(diǎn)以及相同突變的臨床表型方面也存在差異。我們對(duì)中國(guó)家族性HOKPP患者進(jìn)行HOKPP相關(guān)候選基因的篩查,旨在明確中國(guó)HOKPP的致病基因位點(diǎn)以及基因型和臨床表型的相關(guān)性。數(shù)據(jù)和方法1.發(fā)作性四下肢無(wú)力風(fēng)險(xiǎn)為2002—2005年在我院門診和住院部就診的14例有陽(yáng)性家族史的HOKPP先證者以及其中3例陽(yáng)性先證者的家系中的4例其他患者和34名健康親屬。患者均表現(xiàn)為發(fā)作性四肢無(wú)力伴有血清鉀降低。所有先證者均行血生化、血?dú)夥治?、甲狀腺功能、甲狀腺及腎上腺B超、尿常規(guī)等檢查,排除了甲狀腺功能亢進(jìn)、腎小管酸中毒等繼發(fā)性HOKPP。2.所有患者及其家人均簽署知情同意書，收取三分之一之三的周游世界ml,應(yīng)用SigmaDNApurificationkit試劑盒提取基因組DNA。3.pcr擴(kuò)增及活性物質(zhì)合成CACNA1S基因外顯子11、30,SCN4A基因外顯子12、19和KCNE3基因外顯子1包括了目前已知的可導(dǎo)致HOKPP的相關(guān)突變位點(diǎn)。5對(duì)引物來(lái)源于文獻(xiàn),利用PCR技術(shù)擴(kuò)增以上3個(gè)基因的5個(gè)外顯子,引物由奧科生物工程技術(shù)公司合成。PCR反應(yīng)體系25μl,含DNA50ng,引物0.2μmol/L,dNTPs200μmol/L,TaqDNA聚合酶1U(日本TaKaRa公司)。反應(yīng)條件:在Cetus2400熱循環(huán)儀(美國(guó)PE公司)中,變性94℃5min;變性94℃40s,退火溫度由具體引物決定(表1);延伸72℃60s,循環(huán)35次;延伸7min。應(yīng)用2%瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物的質(zhì)量,用PCR純化試劑盒(申能博采生物技術(shù)公司)純化PCR產(chǎn)物,去除引物及Taq酶。4.使用美國(guó)制造的abiprim377DNA測(cè)序儀對(duì)純化后的PCR產(chǎn)物進(jìn)行正反向測(cè)序,明確有無(wú)突變。結(jié)果一、家系及性別基因外顯子基因型檢測(cè)對(duì)14個(gè)家系的先證者進(jìn)行3個(gè)基因5個(gè)外顯子測(cè)序后,發(fā)現(xiàn)3個(gè)家系(圖1)中的先證者攜帶HOKPP相關(guān)突變:CACNA1S基因的R1239H突變和SCN4A基因R672H突變。其余家系先證者未發(fā)現(xiàn)已知的HOKPP相關(guān)突變。進(jìn)一步對(duì)這3個(gè)家系中的其他患者和相關(guān)親屬進(jìn)行測(cè)序分析,結(jié)果如下。1.家系1:3代共11人,其中2例發(fā)病,為先證者及其母親,對(duì)其母進(jìn)行CACNA1S基因外顯子30測(cè)序也發(fā)現(xiàn)存在3716G→A雜合突變,引起氨基酸序列改變R1239H(圖2)。對(duì)其家系其他成員進(jìn)行測(cè)序,未見此突變,提示此突變?yōu)橥耆怙@率,男女均發(fā)病,無(wú)性別差異。2.家系2:3代共17人(獲得其中15人的血液樣本,Ⅱ3、Ⅱ7失訪),其中3例患者均為男性,為先證者及其2位堂兄。測(cè)序發(fā)現(xiàn)3例患者SCN4A基因外顯子12上存在2015G→A雜合突變,引起氨基酸序列改變R672H(圖3)。進(jìn)一步對(duì)其家系其他成員測(cè)序發(fā)現(xiàn),此家系另外4人也攜帶此突變但未發(fā)病。其中1名男性,為先證者的弟弟,現(xiàn)年17歲,目前無(wú)臨床癥狀,但不排除今后發(fā)病可能。另外3名為女性,分別是先證者的母親、姨母、外祖母,年齡分別是38歲、47歲、73歲,既無(wú)發(fā)作性肌無(wú)力癥狀,也無(wú)持久性肌無(wú)力表現(xiàn)。提示此突變?yōu)椴煌耆怙@率,尤其是女性突變基因攜帶者均未發(fā)病。3.家系3:3代共15人,其中2例發(fā)病,均為男性,為先證者及其舅舅。測(cè)序發(fā)現(xiàn)2例患者SCN4A基因外顯子12上存在2015G→A雜合突變,引起氨基酸序列改變R672H(圖3)。進(jìn)一步對(duì)其家系其他成員測(cè)序,發(fā)現(xiàn)先證者的母親(36歲),也存在相同突變但未發(fā)病。先證者外祖父測(cè)序正常,外祖母去世,推測(cè)外祖母也攜帶此突變,但未發(fā)病。此家系女性突變基因攜帶者未發(fā)病。二、干預(yù)綜合征的臨床特征分析表21.血鉀偏低的治療先證者(Ⅲ2)男性,17歲,首發(fā)年齡為8歲。主要臨床表現(xiàn)為發(fā)作性四肢力弱,嚴(yán)重時(shí)可累及呼吸肌,一般在夜間睡眠時(shí)出現(xiàn)癥狀,持續(xù)時(shí)間4～48h后肢體肌力恢復(fù)正常,發(fā)作恢復(fù)期出現(xiàn)肌肉疼痛,無(wú)肌強(qiáng)直。誘因有勞累、受涼、飽食、感染后、精神緊張、秋冬及冬春交界等。8歲時(shí)首次發(fā)作1次,12歲開始發(fā)作頻繁,達(dá)到35～50次/年。發(fā)作期血鉀偏低(1.5～2.8mmol/L)。給予補(bǔ)鉀和乙酰唑胺治療有效。先證者母親(Ⅱ3)也為HOKPP患者,其臨床特征見表2。2.肌強(qiáng)直和持久神經(jīng)病先證者(Ⅲ5)為18歲男性,發(fā)病年齡為15歲。表現(xiàn)為發(fā)作性四肢無(wú)力,一般在晨起時(shí)發(fā)作,持續(xù)2～24h后肢體肌力可恢復(fù)正常,無(wú)肌強(qiáng)直和持久性肌無(wú)力表現(xiàn)。誘因有勞累、受涼、飽食、饑餓、感染后、情緒緊張、飲用碳酸類飲料等。發(fā)作頻率:病初4～6次/年,17歲開始病情加重,100～200次/年。發(fā)作期血鉀2.5～3.4mmol/L(平均2.95mmol/L)。給予補(bǔ)鉀治療可以減輕癥狀,促進(jìn)恢復(fù)。給予乙酰唑胺250mg,3次/d,治療無(wú)效。先證者的2位堂兄(Ⅲ2、Ⅲ3)也為HOKPP患者,臨床特征見表2。3.發(fā)作期血鉀偏低、以乙酰胺胺治療先證者(Ⅲ4)為男性,13歲,首發(fā)年齡12歲。一般在睡眠時(shí)發(fā)病,持續(xù)時(shí)間4～12h后肢體肌力恢復(fù)正常。誘因有勞累、受涼、出汗等。發(fā)作頻率:12歲發(fā)作4～5次,13歲開始發(fā)作頻繁,發(fā)作達(dá)到30次。發(fā)作期血鉀偏低(2.6mmol/L),尿常規(guī)、肌電圖正常。補(bǔ)鉀治療有效,乙酰唑胺治療無(wú)效。其舅舅(Ⅱ7)也為HOKPP患者,臨床特征見表2。4.發(fā)病年齡及治療有效CACNA1SR1239H突變攜帶者,男女均發(fā)病,完全外顯率,發(fā)病年齡在8～9歲,乙酰唑胺治療有效;而SCN4AR672H突變患者均為男性,女性突變基因攜帶者均未發(fā)病,呈不完全外顯率,發(fā)病年齡在15～29歲,乙酰唑胺治療無(wú)效。cacna1s基因s1239h突變家系的發(fā)現(xiàn)目前,我國(guó)HOKPP家系的研究發(fā)現(xiàn)有2種突變,CACNA1S基因的R528G突變和SCN4A基因R672C突變。我們對(duì)我國(guó)14個(gè)HOKPP家系先證者進(jìn)行了候選基因的熱點(diǎn)篩查,首次發(fā)現(xiàn)中國(guó)HOKPP家系還存在CACNA1S基因R1239H突變和SCN4A基因R672H突變。2種突變患者除具有HOKPP的典型表現(xiàn)外,又各具特點(diǎn)。CACNA1S基因R1239H突變特點(diǎn)為:兒童期發(fā)病,青春期加重,30歲以后病情減輕;乙酰唑胺治療有效;完全外顯率,無(wú)性別差異。SCN4A基因R672H突變特點(diǎn)為:青春期發(fā)病,25歲以后病情減輕;乙酰唑胺治療無(wú)效;不完全外顯率,女性突變基因攜帶者均未發(fā)病。因此,我們認(rèn)為CACNA1S基因R1239H突變和SCN4A基因R672H突變的臨床表型存在差異。通過(guò)對(duì)不同突變位點(diǎn)臨床表型的總結(jié),有助于今后根據(jù)臨床表型推斷突變位點(diǎn),指導(dǎo)治療,判斷預(yù)后。2001年日本報(bào)道了1個(gè)CACNA1S基因R1239H突變家系,我們的研究與其不同之處在于:日本家系患者首發(fā)年齡在3～7歲,而中國(guó)患者在8～9歲;日本家系部分患者首次發(fā)病前就有持續(xù)性肌無(wú)力表現(xiàn),而中國(guó)患者沒有類似表現(xiàn)。而且,我們觀察到R1239H突變家系女性患者在月經(jīng)前期易發(fā)作,而妊娠期間無(wú)發(fā)作,既往的文獻(xiàn)未見到類似報(bào)道。此現(xiàn)象提示女性患者的肌無(wú)力發(fā)作可能與體內(nèi)的雌、孕激素水平有關(guān)。但雌、孕激素影響周期性麻痹發(fā)作的機(jī)制尚不清楚。2001年Sternberg等對(duì)58例法國(guó)HOKPP先證者進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),5例存在SCN4A基因突變(R672H3例,R672G1例,R672S1例),與我們觀察到的相同之處在于乙酰唑胺對(duì)于SCN4A基因突變患者無(wú)效;不同之處在于他們觀察到SCN4A基因突變?cè)谀行院团灾芯鶠橥耆耐怙@率,而我們發(fā)現(xiàn)4例女性R672H突變攜帶者均未發(fā)病(最小的36歲,最大的73歲),1例男性R672H突變攜帶者也未發(fā)病(目前17歲,不排除今后發(fā)病可能,需要隨診)。因此,根據(jù)我們研究的結(jié)果,R672H突變存在不全外顯率,與國(guó)外報(bào)道的不同可能是由于種族差異。文獻(xiàn)報(bào)道HOKPP患者男性多于女性,男性約占62%,女性約占38%。HOKPP患者男性多于女性可能是由于HOKPP責(zé)任突變?cè)谂缘耐怙@率下降。同時(shí),某些散發(fā)的患者無(wú)家族史,也可能是由于不外顯的女性基因攜帶者將責(zé)任突變傳給子代,導(dǎo)致子代發(fā)病。與歐洲國(guó)家相比,亞洲各國(guó)HOKPP患者散發(fā)性多于家族性。我們發(fā)現(xiàn)R672H突變女性攜帶者均未發(fā)病,而Sternberg等觀察到SCN4A基因突變(包括R672H)女性外顯率為100%,我們推測(cè)可能由于種族差異,亞洲攜帶突變的女性外顯率較歐洲人更低,造成亞洲散發(fā)性HOKPP明顯多于歐洲,但尚需大樣本驗(yàn)證。關(guān)于女性外顯率低的原因,目前尚不清楚,有人提出HOKPP發(fā)病受多基因影響,并非單基因疾病。也有人提出此病可能是X-連鎖隱性遺傳,具體原因有待進(jìn)一步研究。我們通過(guò)DNA直接測(cè)序?qū)?4個(gè)獨(dú)立的HOKPP家系先證者進(jìn)行了候選基因突變熱點(diǎn)篩查,僅發(fā)現(xiàn)3個(gè)家系患者攜帶已知