中國先天性腎病綜合征家系nphs1基因突變分析

中國先天性腎病綜合征家系nphs1基因突變分析

先天性腎衰竭（cns）是指出生后3個月內(nèi)出現(xiàn)的腎衰竭或大量蛋白質(zhì)。CNS大多起病早、病情重、腎功能進(jìn)行性減退、激素治療無效、死亡率高,預(yù)后極差。近年來明確了多個CNS的致病基因,如NPHS1、NPHS2和WT1。我國以往對CNS患者致病基因及其突變的研究尚少。我們采用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)和DNA直接測序的方法,對一個中國CNS家系進(jìn)行了NPHS1基因的檢測,以獲得確切的基因診斷,分析基因型與表型關(guān)系,既有助于遺傳咨詢、產(chǎn)前診斷,也有利于進(jìn)一步探討發(fā)病機制。對象和方法一、腎活檢部位及病理結(jié)果先證者(Ⅲ:12),男,45日齡。第2胎,第2產(chǎn),足月順產(chǎn),胎盤450g,出生體重:2.7kg。生后無窒息。生后10d出現(xiàn)全身水腫。在當(dāng)?shù)伢w檢:心肺正常,神經(jīng)系統(tǒng)未見異常。尿常規(guī):蛋白(+++)(蛋白定量未做)。血總蛋白30.3g/L,白蛋白14.6g/L,尿素氮1.1mmol/L,肌酐26.0μmol/L,TORCH篩查均陰性,心臟彩超正常,腎臟B超示:左腎64mm×32mm,右腎67mm×32mm,回聲增強。診斷為CNS。因家長不同意,未做腎穿刺活檢。未用激素治療,僅給予對癥治療。先證者之姐姐(Ⅲ:11),女,5歲,系第1胎,第1產(chǎn),足月順產(chǎn),出生體重:2.4kg,胎盤情況不詳。生后半個月發(fā)現(xiàn)臍以下水腫,查尿常規(guī):蛋白(+++)(蛋白定量未做),生后40d左右出現(xiàn)抽搐、“缺鈣”。在當(dāng)?shù)伢w檢:心肺正常,神經(jīng)系統(tǒng)檢查未見異常。當(dāng)時肝腎功能不詳,診斷為CNS,未用激素治療,僅給予中藥治療。5歲時復(fù)查:尿蛋白(+++),血總蛋白36.7g/L,白蛋白14.2g/L,總膽固醇15.1mmol/L,尿素氮4.7mmol/L,肌酐28.0μmol/L。5歲時行腎活檢,病理結(jié)果示:腎活檢標(biāo)本可見7個腎小球,其中1個球性硬化,其余腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕～中度彌漫增生。腎小管上皮顆粒變性,部分小管上皮肥大呈柱狀改變,伴有管腔囊狀擴張。腎間質(zhì)灶狀淋巴單核細(xì)胞浸潤伴有泡沫細(xì)胞形成。小動脈管壁增厚。電鏡示腎小球系膜細(xì)胞和基質(zhì)輕～中度彌漫增生,基底膜節(jié)段性不規(guī)則增厚伴蟲蝕樣透亮區(qū)及顆粒狀結(jié)構(gòu)形成,足細(xì)胞空泡變性,足突廣泛融合。腎小管上皮微絨毛稀疏短小,胞質(zhì)內(nèi)空泡變性。先證者之大姐(Ⅲ:10),與先證者和先證者之姐姐系同父異母之同胞,身體健康,多次尿常規(guī)檢查均正常?；純焊改干眢w健康,非近親結(jié)婚,多次尿常規(guī)檢查亦正常。家族中其他人無同類疾病。家系譜圖見圖1。二、學(xué)習(xí)方法1.周血標(biāo)本,鹽析法在簽署知情同意書后,采集上述研究對象的外周血標(biāo)本,鹽析法抽提基因組DNA。另取50名健康人外周血DNA作為對照樣本(北京大學(xué)第一醫(yī)院輸血科“人類血液樣本庫”提供)。2.強調(diào)4、17、20、33研究的引物設(shè)計參考文獻(xiàn),對NPHS1的29個外顯子設(shè)計18對引物,其中外顯子5、14、17、20、23,是根據(jù)從人類基因組數(shù)據(jù)庫Genebank中獲得的NPHS1序列(NT_011109),應(yīng)用在線引物設(shè)計軟件Primer3重新設(shè)計的引物(表1)。引物由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。3.pcr擴增體系及條件PCR在25μl的反應(yīng)體系中進(jìn)行:10×緩沖液2.5μl,1.5mmol/LMgCl21.5μl,2.5mmol/LdNTP1μl,5pmol/L正、反向引物各1μl,TagDNA聚合酶(Perkin-Elmer公司)1.5U,基因組DNA1μl,加去離子水至25μl體積。PCR反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性12min;而后按94℃變性1min,58℃～64℃退火1min,72℃延伸1min的順序,共35個循環(huán),最后72℃延伸10min,4℃保存。由于外顯子12～13的擴增序列中GC含量高,其PCR反應(yīng)體系中使用高GC緩沖液(大連寶生物公司產(chǎn)品)。取3μl的PCR產(chǎn)物以1.5%瓊脂糖凝膠電泳鑒定其擴增結(jié)果,將目的片段純化、測序。4.rt-pcr法測序以PCR引物作為測序引物,委托北京諾賽基因組研究中心有限責(zé)任公司,用末端終止法在ABI9700型熱循環(huán)儀上進(jìn)行測序反應(yīng)。反應(yīng)結(jié)束后,延伸產(chǎn)物在ABIPRISM3730型XLDNA序列分析儀上進(jìn)行分析。對測序異常的片段重新進(jìn)行PCR擴增,再次正向、反向測序,以驗證結(jié)果的可靠性。5.antm軟件的分析測序結(jié)果應(yīng)用DNAStar軟件包中的SeqmanTM(Lasergene公司產(chǎn)品)軟件進(jìn)行序列對比分析。正常序列為GeneBank中NPHS1全基因組序列(NT_011109)。6.內(nèi)切酶rt-pcr檢測明確NPHS1基因突變區(qū)域后,利用限制性內(nèi)切酶,對先證者及其家系成員的相應(yīng)片段PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切反應(yīng),并對50名健康人進(jìn)行了相應(yīng)片段的擴增及相應(yīng)的酶切反應(yīng),以證實突變的存在。①核酸內(nèi)切酶BbsI,酶切消化先證者及其家系成員和50個對照樣本的外顯子8～9片段。酶切體系:在20μl的反應(yīng)體系中加入PCR產(chǎn)物5μl,內(nèi)切酶BbsI4U,Buffer2μl,加去離子水12μl,混勻后置于37℃水浴90min。②核酸內(nèi)切酶DraⅢ,酶切消化先證者及其家系成員和50個對照樣本的外顯子21～22片段。酶切體系:PCR產(chǎn)物5μl,內(nèi)切酶DraⅢ3U,Buffer2μl,乙?；疊SA0.2μl,加去離子水補至20μl,混勻后置于37℃水浴90min。酶切后產(chǎn)物經(jīng)8%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離,硝酸銀染色后觀察結(jié)果。結(jié)果一、pcr擴增結(jié)果以18對引物進(jìn)行的NPHS1基因PCR擴增都有較好的擴增結(jié)果,擴增片段與所設(shè)計的擴增片段的大小一致,沒有非特異性擴增帶。因此,可以進(jìn)行純化、測序和酶切反應(yīng)。二、18先證者nphs1基因的雜合突變先證者NPHS1基因的第8外顯子發(fā)現(xiàn)一雜合突變G928A,遺傳密碼子由GGC變?yōu)锳GC(圖2(A)),從而導(dǎo)致310位的天冬氨酸被天冬酰胺替代(Asp310Asn,D310N)。先證者之母(Ⅱ:13)和先證者之姐姐的NPHS1基因的第8外顯子也同樣存在這一突變,而其父(Ⅱ:11)的NPHS1基因的第8外顯子的測序結(jié)果與野生型相同。先證者NPHS1基因的第14外顯子存在1893～1900del8(CGAAACCG)雜合缺失突變(圖2(B)),由于第1893～1900位8個堿基缺失,致使第630位密碼子以后的閱讀框移碼,從而導(dǎo)致第670位密碼子轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子(TAA)。先證者之父和先證者之姐姐的NPHS1基因的第14外顯子也同樣存在這一突變,而其母的NPHS1基因的第14外顯子的測序結(jié)果與野生型相同。同時先證者NPHS1基因的第21外顯子發(fā)現(xiàn)一雜合突變G2869C(圖2(C)),遺傳密碼子由GGC變?yōu)锳GC,從而導(dǎo)致957位的纈氨酸被亮氨酸替代(Val957Leu,V957L)。先證者之父和先證者之姐姐的NPHS1基因的第21外顯子也同樣存在這一突變,而其母的NPHS1基因的第21外顯子的測序結(jié)果與野生型相同。先證者之大姐則沒有發(fā)現(xiàn)上述的任一突變。另外還在先證者發(fā)現(xiàn)了4種堿基異常:位于第3外顯子的雜合突變C349T,導(dǎo)致E117K;第8內(nèi)含子的68a>g(IVS8+68a>g);位于第26外顯子的純合突變G3315A,導(dǎo)致S1105S和第27內(nèi)含子的45c>t(IVS27+45c>t)。三、雜合性突變試驗NPHS1外顯子8～9擴增片段長度為624bp。核酸內(nèi)切酶BbsI識別序列為5′…GAAGAC(N)2…3′,野生型序列中存在2個BbsⅠ酶切位點,酶切后產(chǎn)生148bp、233bp和243bp3種片段;而G928A突變消除了1個酶切位點,因此突變的NPHS1外顯子8～9片段經(jīng)BbsI酶切,只產(chǎn)生243bp和381bp兩種片段。先證者及其母親、姐姐均有4種片段:148bp、233bp、243bp和381bp,說明該突變是雜合性突變;而先證者之父和先證者之大姐及對照樣本只有前3種片段,沒有381bp未切片段,為野生型序列(圖3)。NPHS1外顯子21～22擴增片段長度為487bp。核酸內(nèi)切酶DraⅢ識別序列為5′…CACNNNGTG…3′,野生型序列中存在2個DraⅢ酶切位點,酶切后產(chǎn)生118bp、170bp和199bp3種片段。而G2869C突變消除了一個酶切位點,因此突變的NPHS1外顯子21～22片段經(jīng)DraⅢ酶切后,只產(chǎn)生288bp和199bp兩種片段。故先證者及其父親、姐姐均有4種片段:118bp、170bp、199bp和288bp,說明該突變是雜合性突變;而其先證者之母和先證者之大姐及對照樣本的酶切結(jié)果,為野生型序列(圖4)。變3g98a和其他雜合突變國外報道CNS較常見的基因突變?yōu)榫幋anephrin蛋白的NPHS1基因的突變,但對于我國CNS的致病基因及其特征卻不清楚。本組來自同一家系的兩例患兒均于生后3個月內(nèi)出現(xiàn)腎病綜合征,臨床符合CNS的診斷。對他們的檢測結(jié)果,證實了中國CNS也具有NPHS1基因突變。近年來有報道CNS還可因NPHS2基因突變所致,但本研究對先證者進(jìn)行的NPHS2的全部8個外顯子的測序結(jié)果顯示正常,沒有突變(資料待發(fā)表);再者,由于在表型正常的先證者同父異母的大姐未檢出上述雜合突變,在與本家系無親緣關(guān)系的50名健康人中也未檢出以上基因突變,我們認(rèn)為,這3個NPHS1基因的雜合突變是本CNS家系患兒的致病突變。經(jīng)檢索人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD)和最新的文獻(xiàn)報道,上述3個雜合突變位點不但為國際首次報道,而且還是第一次在NPHS1第21外顯子發(fā)現(xiàn)的突變。本家系發(fā)現(xiàn)的3個雜合突變中,1個為缺失突變(1893～1900del8),2個為錯義突變(G928A和G2869C)。將先證者及其父母的NPHS1突變進(jìn)行比較分析顯示:第8外顯子的錯義突變(G928A)來自患兒母親,第14外顯子的缺失突變(1893～1900del8)和第21外顯子的錯義突變(G2869C)均來自患兒父親,可見1893～1900del8和G2869C位于同一條染色體上。1893～1900del8是產(chǎn)生了截短蛋白,那么位于其后的G2869C突變的病理意義則有待進(jìn)一步探討。此外,本研究還在先證者發(fā)現(xiàn)了4種堿基變異:E117K(rs3814995)、IVS8+68a>g、S1105S(rs2071327)和IVS27+45c>t,經(jīng)與NCBI和Ensembl的SNP數(shù)據(jù)庫比較,并檢索相關(guān)文獻(xiàn),證實E117K(rs3814995)、S1105S(rs2071327)和IVS27+45c>t,均為單核苷酸多態(tài)性(SNPs),而IVS8+68a>g未見報道,其意義有待進(jìn)一步研究。從NPHS1的編碼的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)一步分析本研究所確定的突變意義,可以看出:缺失突變(1893～1900del8)導(dǎo)致的截短的nephrin蛋白只有670個氨基酸,被截斷的為nephrin分子的部分胞內(nèi)段和跨膜區(qū),因而嚴(yán)重影響了nephrin分子的功能;錯義突變(G928A)導(dǎo)致310位的天冬氨酸被天冬酰胺替代(Asp310Asn),發(fā)生于nephrin的Ig3基序(motif),而錯義突變(G2869C)導(dǎo)致957位的纈氨酸被亮氨酸替代(Val957Leu),發(fā)生于nephrin的FN-Ⅲ,可見3個雜合突變均影響nephrin的功能結(jié)構(gòu)域(Ig樣基序和FN-Ⅲ樣結(jié)構(gòu)域)。不同的突變部位、突變類型可能出現(xiàn)不同的臨床表型。國外研究者曾報道臨床表型較輕的CNS,2002年Koziell等指出,50%的R1160X無義突變病例為輕型病例,且多為女性;最近,Gigante等報道了意大利一個2歲的表型較輕的芬蘭型CNS女孩,其復(fù)合雜合突變?yōu)?48insA和S572N,分別位于Ig1和Ig6。結(jié)合國外報道和本研究結(jié)果可見,較輕的CNS的錯義突變位于nephrin分子的Ig1、Ig3、Ig5和Ig6基序,而國外報道的臨床表型較重的CNS的突變多位于nephrin分子的Ig2、Ig4和Ig7。另一方面,同時存在NPHS13個雜合突變的CNS病例既往也有報道:1999年Lenkkeri等報道2例,1例同時具有Fin-major(121delCT)、G1223A和G1384A雜合突變(其中G1223A在正常對照和其他CNS患者均可見到),分別位于外顯子2(Ig1)、10(Ig4)和11(Ig5);另1例同時具有C1099T、C2171G和C3418T雜合突變,分別位于外顯子