兩種方法檢測支氣管肺灌洗液細胞分類的比較

兩種方法檢測支氣管肺灌洗液細胞分類的比較

支架氣泡壓縮性技術是一種通過纖維支氣管鏡對氣管以下肺段或亞段的無菌生理鹽水進行反復過濾、回收、檢測和分析的技術。BAL檢查可直接獲取下呼吸道及肺泡上皮表面襯液,即支氣管肺泡灌洗液(bronchoalveolarlavagefluid,BALF),通過對其所含的炎癥細胞、免疫細胞進行細胞計數(shù)和淋巴細胞亞群測定,可為結節(jié)病、過敏性肺泡炎、特發(fā)性肺間質纖維化及肺部惡性腫瘤等疾病的診斷、鑒別診斷和療效觀察提供重要手段。臨床實驗室既往多根據(jù)2002年發(fā)布的《支氣管肺泡灌洗液細胞學檢測技術規(guī)范(草案)》規(guī)定進行BALF細胞分類計數(shù),采用手工制片、蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色法或瑞氏染色法,其操作步驟繁瑣,費時費力,不適于標本量日漸增多的常規(guī)檢測;且通常使用的細胞采集液中含有乙醇等成分,細胞形態(tài)結構因固縮變小而不易被清晰辨認。為此,本研究簡化了制片步驟并通過自動化瑞氏吉姆薩(Wright-Giemsa)染色法進行細胞分類計數(shù),省去細胞收集液,使得淋巴細胞及中性粒細胞的識別更加清晰,提高了BALF細胞分類計數(shù)的可靠性。1balp基因檢測1.1儀器與試劑細胞收集液(ThermoShandon公司);HE染液(哈爾濱格林公司),瑞氏吉姆薩染液(珠海貝索公司),濾紙、漏斗、Cytospin細胞離心涂片機(ThermoScientific公司),改良Neubauer細胞計數(shù)版。Multifuge4KR離心機(Heraeus公司),SP-1000i自動推片染色機(Sysmex公司),CX41普通光學顯微鏡(Olympus公司)。1.2標本采集及制備50例BALF標本來自2013年4~9月北京協(xié)和醫(yī)院門診和住院患者。每位患者行支氣管鏡檢查時,留取≥5mL的BALF,裝入硅塑瓶或涂硅滅菌玻璃容器中(減少細胞粘附),1h內送檢。在改良Neubauer細胞計數(shù)板上計數(shù)細胞總數(shù)。1.3傳統(tǒng)制片和手工HE染色法(傳統(tǒng)法)操作流程見圖1。1.4改良制片和自動化瑞氏吉姆薩染色法(改良法)操作流程見圖1。1.5顯微鏡檢查由兩名具有專業(yè)技術能力的檢驗人員完成。針對每份標本,檢驗人員在光學顯微鏡下計數(shù)200個細胞,并進行細胞分類計數(shù)。1.6統(tǒng)計學分析用SPSS19.0軟件對兩人員間的細胞分類結果進行線性回歸分析,評估兩人員間結果的一致性。然后對兩人員的計數(shù)結果取均值,通過SPSS19.0軟件線性回歸分析評估兩種方法間細胞分類結果的一致性。2細胞形態(tài)檢測2.1BALF細胞分類計數(shù)結果2.1.1人員間的BALF細胞分類計數(shù)結果比較在傳統(tǒng)法細胞分類計數(shù)中,兩人員間計數(shù)結果的回歸分析顯示:吞噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的相關性良好,相關系數(shù)(r)分別為0.989(P<0.01)、0.989(P<0.01)、0.985(P<0.01)和0.976(P<0.01)。在改良法細胞分類計數(shù)中,兩人員間計數(shù)結果的回歸分析顯示:吞噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞和嗜酸性粒細胞的相關性良好,r分別為0.982(P<0.01)、0.986(P<0.01)、0.981(P<0.01)和0.969(P<0.01)。結果表明,兩人員間兩法的細胞分類計數(shù)結果一致性均良好。2.2兩種方法檢測不同類型細胞形態(tài)的比較圖2~5顯示了在油鏡下觀察的兩種方法對吞噬細胞、嗜酸性粒細胞、淋巴細胞和中性粒細胞的染色形態(tài)。瑞氏吉姆薩染色片中,細胞核被染成紫紅色,細胞漿被染成藍色。HE染色法中,細胞核內的染色質與細胞漿內的核糖體著藍紫色,細胞漿和細胞外基質中的成分著粉紅色。改良的自動化瑞氏吉姆薩染色法染色的細胞形態(tài)完整,細胞核和細胞漿分辨清楚,可見顆粒、空泡等細微結構;而手工HE染色后的細胞固縮明顯,細胞體積變小,細胞核和細胞漿分辨清晰度下降,顆粒和空泡等細胞結構辨認不清。2.3兩種方法所需時間的比較由圖1所示的操作流程圖可明顯看出,改良法比傳統(tǒng)法省去了濾液離心富集細胞的過程(6min),并且使用自動化瑞氏吉姆薩染色法(20min)代替了手工HE染色法(30min),至少節(jié)省了15~20min的制片和染色時間。3細胞富集和細胞收集健康人的BALF中,單核/吞噬細胞計數(shù)>85%、淋巴細胞計數(shù)<12%、中性粒細胞計數(shù)<2%、嗜酸性粒細胞計數(shù)<1%。病理情況下,BALF的細胞組成會發(fā)生明顯改變。當淋巴細胞計數(shù)>25%時,提示肉芽腫性肺病(如結節(jié)病、過敏性肺炎、非特異性間質性肺炎、淋巴細胞性間質性肺炎、隱源性機化性肺炎等),當淋巴細胞計數(shù)>50%,則高度提示過敏性肺炎和非特異性間質性肺炎。當嗜酸性粒細胞計數(shù)≥25%時,可協(xié)助診斷急性嗜酸性粒細胞性肺炎。中性粒細胞計數(shù)≥50%,可有力支持急性肺損傷、吸入性肺炎或化膿性感染的診斷。因此,BALF細胞分類計數(shù)能夠為肺部病變性質、炎癥過程及疾病活動性等提供重要的參考信息,近年來在國內外已普遍應用于呼吸系統(tǒng)疾病的診斷、預后和療效觀察。本研究建立的改良法與傳統(tǒng)法BALF細胞分類計數(shù)有良好的一致性,但二者的操作流程卻有明顯的不同:改良法將過濾后的濾液直接用生理鹽水調整細胞濃度,而傳統(tǒng)法將濾液離心富集細胞后,再用細胞收集液調整細胞濃度;改良法用自動化瑞氏吉姆薩染色,而傳統(tǒng)法用手工HE染色。傳統(tǒng)法中用到的細胞收集液主要成分為乙醇、甲醇、異丙醇和聚乙二醇,具有破壞紅細胞、固定有核細胞的作用,可防止細胞在染色操作中被破壞或丟失。但該液體也會使有核細胞固縮變小,使之在顯微鏡下結構不清,不易辨別,如圖2-2、3-2、4-2、5-2所見。同時,紅細胞殘渣可能干擾細胞的正確辨認。改良法不用細胞收集液,主要因為瑞氏吉姆薩染液的溶劑即為甲醇,本身即有固定細胞的作用。改良法和傳統(tǒng)法所獲結果的一致性很好,并沒有因為缺少細胞收集液而出現(xiàn)細胞被破壞或脫落的現(xiàn)象,所以改良法直接用生理鹽水調整細胞濃度。對于細胞總數(shù)很少的BALF標本,將濾液離心富集細胞的過程是必要的,但根據(jù)本實驗室的實際操作經(jīng)驗,95%的BALF標本不需要富集濾液細胞,可用生理鹽水直接將細胞懸液調整至最佳濃度,以減少富集過程所需的時間。HE染色有兩種主要染液:蘇木精和伊紅。蘇木精在堿性溶液中呈藍色,細胞核被染成藍色。伊紅是一種化學合成的酸性染料,在水中離解成帶負電荷的陰離子,與蛋白質的氨基———正電荷的陽離子結合使胞漿染色,細胞漿、紅細胞、肌肉、結締組織、嗜伊紅顆粒等被染成不同程度的紅色或粉紅色,與藍色的細胞核形成鮮明對比。由于組織或細胞的不同成分對蘇木精的親和力不同及染色性質不一樣,各種組織或細胞成分與病變的一般形態(tài)結構特點均可顯示出來,故HE染色更適用于細胞和組織病理學檢查。而瑞氏吉姆薩染色法結合了瑞氏染色法和吉姆薩染色法的優(yōu)點,對細胞胞核、胞漿和胞漿內顆粒均著色鮮艷,對比鮮明,常用于白細胞分類。因此,BALF的細胞分類計數(shù),瑞氏吉姆薩染色更為合適。自動化瑞氏吉姆薩染色機已逐漸普及,可突現(xiàn)瑞氏吉姆薩染色法的優(yōu)勢。傳統(tǒng)手工染色勞動強度大,而且有時會受溫度、時間、試劑、環(huán)境及個體差異等因素的影響,胞漿、胞核染色深淺不一,顏色對比不強,而自動染片機預先設定好染色程序和時間,使得每一次染色的步驟和時間都能一致,胞漿和胞核結構經(jīng)染色后清晰均勻,對比鮮明［9］。此外,自動染片機的操作簡單,可縮短制片周期,批量染色更加節(jié)約時間,減少人力［10］。2.1.2兩種方法的BALF細