GB4789.3-2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗 大腸菌群計數(shù)

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB4789.3—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)2016-12-23發(fā)布2017-06-23實施ⅠGB4789.3—2016GB/T4789.32—2002《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗大腸菌群的快速檢測》和SN/T0169—2010《進(jìn)出口食品中大腸菌群、糞大腸菌群和大腸桿菌檢測方法》大腸菌群計數(shù)部分。本標(biāo)準(zhǔn)與GB4789.3—2010相比,主要變化如下:—增加了檢驗原理;—修改了適用范圍;—修改了典型菌落的形態(tài)描述;—修改了第二法平板菌落數(shù)的選擇;—修改了第二法證實試驗;—修改了第二法平板計數(shù)的報告。1GB4789.3—2016食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗大腸菌群計數(shù)1范圍本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了食品中大腸菌群(Coliforms)計數(shù)的方法。本標(biāo)準(zhǔn)第一法適用于大腸菌群含量較低的食品中大腸菌群的計數(shù);第二法適用于大腸菌群含量較高的食品中大腸菌群的計數(shù)。2術(shù)語和定義大腸菌群Coliforms在一定培養(yǎng)條件下能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。2.2最可能數(shù)Mostprobablenumber;MPN基于泊松分布的一種間接計數(shù)方法。3檢驗原理3.1MPN法MPN法是統(tǒng)計學(xué)和微生物學(xué)結(jié)合的一種定量檢測法。待測樣品經(jīng)系列稀釋并培養(yǎng)后,根據(jù)其未生長的最低稀釋度與生長的最高稀釋度,應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)概率論推算出待測樣品中大腸菌群的最大可能數(shù)。3.2平板計數(shù)法大腸菌群在固體培養(yǎng)基中發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸,在指示劑的作用下形成可計數(shù)的紅色或紫色,帶有或不帶有沉淀環(huán)的菌落。4設(shè)備和材料除微生物實驗室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外,其他設(shè)備和材料如下:4.1恒溫培養(yǎng)箱:36℃±1℃。4.2冰箱:2℃~5℃。4.3恒溫水浴箱:46℃±1℃。4.4天平:感量0.1g。4.5均質(zhì)器。4.6振蕩器。4.7無菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。4.8無菌錐形瓶:容量500mL。4.9無菌培養(yǎng)皿:直徑90mm。2GB4789.3—20164.10pH計或pH比色管或精密pH試紙。4.11菌落計數(shù)器。5培養(yǎng)基和試劑5.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(laurylsulfatetryptose,LST)肉湯:見A.1。5.2煌綠乳糖膽鹽(brilliantgreenlactosebile,BGLB)肉湯:見A.2。5.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(violetredbileagar,VRBA):見A.3。5.4無菌磷酸鹽緩沖液:見A.4。5.5無菌生理鹽水:見A.5。5.61mol/LNaOH溶液:見A.6。5.71mol/LHCl溶液:見A.7。第一法大腸菌群MPN計數(shù)法6檢驗程序大腸菌群MPN計數(shù)的檢驗程序見圖1。圖1大腸菌群MPN計數(shù)法檢驗程序3GB4789.3—20167操作步驟7.1樣品的稀釋7.1.1固體和半固體樣品:稱取25g樣品,放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)杯內(nèi),8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min,或放入盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質(zhì)袋中,用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min,制成1∶10的樣品勻液。7.1.2液體樣品:以無菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶(瓶內(nèi)預(yù)置適當(dāng)數(shù)量的無菌玻璃珠)或其他無菌容器中充分振搖或置于機械振蕩器中振搖,充分混勻,制成1∶10的樣品勻液。7.1.3樣品勻液的pH應(yīng)在6.5~7.5之間,必要時分別用1mol/LNaOH或1mol/LHCl調(diào)節(jié)。7.1.4用1mL無菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL,沿管壁緩緩注入9mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面),振搖試管或換用1支1mL無菌吸管反復(fù)吹打,使其混合均勻,制成1∶100的樣品勻液。7.1.5根據(jù)對樣品污染狀況的估計,按上述操作,依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋1次,換用1支1mL無菌吸管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢,全過程不得超過15min。7.2初發(fā)酵試驗每個樣品,選擇3個適宜的連續(xù)稀釋度的樣品勻液(液體樣品可以選擇原液),每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯,每管接種1mL(如接種量超過1mL,則用雙料LST肉湯),36℃±1℃培養(yǎng)24h±2h,觀察倒管內(nèi)是否有氣泡產(chǎn)生,24h±2h產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗(證實試驗),如未產(chǎn)氣則繼續(xù)培養(yǎng)至48h±2h,產(chǎn)氣者進(jìn)行復(fù)發(fā)酵試驗。未產(chǎn)氣者為大腸菌群陰性。7.3復(fù)發(fā)酵試驗(證實試驗)用接種環(huán)從產(chǎn)氣的LST肉湯管中分別取培養(yǎng)物1環(huán),移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯(BGLB)管中,36℃±1℃培養(yǎng)48h±2h,觀察產(chǎn)氣情況。產(chǎn)氣者,計為大腸菌群陽性管。7.4大腸菌群最可能數(shù)(MPN)的報告按7.3確證的大腸菌群BGLB陽性管數(shù),檢索MPN表(見附錄B),報告每g(mL)樣品中大腸菌群的MPN值。第二法大腸菌群平板計數(shù)法8檢驗程序大腸菌群平板計數(shù)法的檢驗程序見圖2。4GB4789.3—2016圖2大腸菌群平板計數(shù)法檢驗程序9操作步驟9.1樣品的稀釋按7.1進(jìn)行。9.2平板計數(shù)9.2.1選取2個~3個適宜的連續(xù)稀釋度,每個稀釋度接種2個無菌平皿,每皿1mL。同時取1mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。9.2.2及時將15mL~20mL融化并恒溫至46℃的結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)約傾注于每個平皿中。小心旋轉(zhuǎn)平皿,將培養(yǎng)基與樣液充分混勻,待瓊脂凝固后,再加3mL~4mLVRBA覆蓋平板表層。翻轉(zhuǎn)平板,置于36℃±1℃培養(yǎng)18h~24h。9.3平板菌落數(shù)的選擇選取菌落數(shù)在15CFU~150CFU之間的平板,分別計數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑大腸菌群菌落(如菌落直徑較典型菌落小)。典型菌落為紫紅色,菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán),菌落直徑為0.5mm或更大,最低稀釋度平板低于15CFU的記錄具體菌落數(shù)。9.4證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落,少于10個菌落的挑取全部典型和可疑菌落。分別移種于BGLB肉湯管內(nèi),36℃±1℃培養(yǎng)24h~48h,觀察產(chǎn)氣情況。凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣,即可報告為大腸菌群陽性。5GB4789.3—20169.5大腸菌群平板計數(shù)的報告經(jīng)最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以9.3中計數(shù)的平板菌落數(shù),再乘以稀釋倍數(shù),即為每g(mL)樣品中大腸菌群數(shù)。例:10-4樣品稀釋液1mL,在VRBA平板上有100個典型和可疑菌落,挑取其中10個接種BGLB肉湯管,證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數(shù)為:100×6/10×104/g(mL)=6.0×105CFU/g(mL)。若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無菌落生長,則以小于1乘以最低稀釋倍數(shù)計算。6GB4789.3—2016附錄A培養(yǎng)基和試劑A.1月桂基硫酸鹽胰蛋白胨(LST)肉湯胰蛋白胨或胰酪胨氯化鈉乳糖磷酸氫二鉀(K2HPO4)磷酸二氫鉀(KH2PO4)月桂基硫酸鈉蒸餾水A.1.2制法20.0g5.0g5.0g2.75g2.75g0.1g1000mL將上述成分溶解于蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH至6.8±0.2。分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管10mL。121℃高壓滅菌15min。A.2煌綠乳糖膽鹽(BGLB)肉湯A.2.1成分蛋白胨10.0g乳糖10.0g牛膽粉(oxgall或oxbile)溶液200mL0.1%煌綠水溶液13.3mL蒸餾水800mLA.2.2制法將蛋白胨、乳糖溶于約500mL蒸餾水中,加入牛膽粉溶液200mL(將20.0g脫水牛膽粉溶于200mL蒸餾水中,調(diào)節(jié)pH至7.0~7.5),用蒸餾水稀釋到975mL,調(diào)節(jié)pH至7.2±0.1,再加入0.1%煌綠水溶液13.3mL,用蒸餾水補足到1000mL,用棉花過濾后,分裝到有玻璃小倒管的試管中,每管10mL。121℃高壓滅菌15min。A.3結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(VRBA)A.3.1成分蛋白胨7.0g酵母膏3.0g乳糖10.0g7GB4789.3—2016氯化鈉5.0g膽鹽或3號膽鹽1.5g中性紅0.03g結(jié)晶紫0.002g瓊脂15g~18g蒸餾水1000mLA.3.2制法將上述成分溶于蒸餾水中,靜置幾分鐘,充分?jǐn)嚢?調(diào)節(jié)pH至7.4±0.1。煮沸2min,將培養(yǎng)基融化并恒溫至45℃~50℃傾注平板。使用前臨時制備,不得超過3h。A.4磷酸鹽緩沖液A.4.1成分磷酸二氫鉀(KH2PO4)34.0g蒸餾水500mLA.4.2制法貯存液:稱取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7.2±0.2,用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。稀釋液:取貯存液1.25mL,用蒸餾水稀釋至1000mL,分裝于適宜容器中,121℃高壓滅菌15min。A.5無菌生理鹽水A.5.1成分氯化鈉8.5g蒸餾水1000mLA.5.2制法稱取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中,121℃高壓滅菌15min。A.61mol/LNaOH溶液A.6.1成分NaOH40.0g蒸餾水1000mLA.6.2制法稱取40g氫氧化鈉溶于1000mL無菌蒸餾水中。8GB4789.3—2016A.71mol/LHCl溶液A.7.1成分HCl90mL蒸餾水1000mLA.7.2制法移取濃鹽酸90mL,用無菌蒸餾水稀釋至1000mL。9GB4789.3—2016附錄B大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表B.1大腸菌群最可能數(shù)(MPN)檢索表每g(mL)檢樣中大腸菌群最可能數(shù)(MPN)的檢索見表B.1。表B.1大腸菌群最可能數(shù)(MP