2023年高考生物母題題源解密（全國通用）15 傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)從微生物培養(yǎng)中溯源（原卷版）

專題15傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)，從微生物培養(yǎng)中溯源

考向一生物技術(shù)實踐

【母題來源】2022年全國乙卷

【母題題文】化合物S被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和化工工業(yè)、用菌株C可生產(chǎn)S,S的產(chǎn)量

與菌株C培養(yǎng)所利用的碳源關(guān)系密切。為此，某小組通過實驗比較不同碳源對菌體生長和S

產(chǎn)量的影響，結(jié)果見表.

碳源細(xì)胞干重(g/L)s產(chǎn)量(g/L)

葡萄糖3.120.15

淀粉0.010.00

制糖廢液2.300.18

回答下列問題。

(1)通常在實驗室培養(yǎng)微生物時，需要對所需的玻璃器皿進(jìn)行滅菌，滅菌的方法有

________________________________________________(答出2點即可)?

(2)由實驗結(jié)果可知，菌株C生長的最適碳源是；用菌株C生產(chǎn)S的最適碳源是

。菌株C的生長除需要碳源外，還需要

___________________________________________(答出2點即可)等營養(yǎng)物質(zhì)。

(3)由實驗結(jié)果可知，碳源為淀粉時菌株C不能生長，其原因是

(4)若以制糖廢液作為碳源，為進(jìn)一步確定生產(chǎn)S的最適碳源濃度，某同學(xué)進(jìn)行了相關(guān)

實驗。請簡要寫出實驗思路：。

(5)利用制糖廢液生產(chǎn)S可以實現(xiàn)廢物利用，其意義是(答

出1點即可)。

圜題的圈

【試題解析】

1、實驗室常用的滅菌方法：(1)灼燒滅菌：將微生物的接種工具，如接種環(huán)、接種針或其他

金屬工具，直接在酒精燈火焰的充分燃燒層灼燒，可以迅速徹底地滅菌；(2)干熱滅菌：能

耐高溫的，需要保持干燥的物品，如玻璃器皿(吸管、培養(yǎng)皿)和金屬用具等，可以采用這種

方法滅菌；(3)高壓蒸汽滅菌：將滅菌物品放置在盛有適量水的高壓蒸汽滅菌鍋內(nèi)，為達(dá)到

良好的滅菌效果，一般在壓力為lOOkPa,溫度為121℃的條件下，維持15?30min。

2、培養(yǎng)基的營養(yǎng)構(gòu)成：各種培養(yǎng)基的具體配方不同，但一般都含有水、碳源、氮源和無機

鹽；不同培養(yǎng)基還要滿足不同微生物對pH、特殊營養(yǎng)物質(zhì)以及氧氣的要求。

(1)通常在實驗室培養(yǎng)微生物時，為防止實驗用的玻璃器皿等物品中原有的微生物污染培養(yǎng)

物，需要使用強烈的理化因素殺死物體內(nèi)外一切微生物的細(xì)胞、芽抱和抱子，即對所需的玻

璃器皿進(jìn)行滅菌，玻璃器皿常用的滅菌的方法有干熱滅菌、高壓蒸汽滅菌等。

(2)由實驗結(jié)果可知，與以制糖廢液為碳源相比，以葡萄糖為碳源時菌株C的細(xì)胞干重最大,

說明最適于菌株C生長的碳源是葡萄糖；而以制糖廢液為碳源時，用菌株C生產(chǎn)S的產(chǎn)量

高于以葡萄糖為碳源時的產(chǎn)量，說明最適于生產(chǎn)S的碳源是制糖廢液。微生物的生長一般

都需要水、碳源、氮源和無機鹽，還需要滿足微生物生長對pH、氧氣以及特殊營養(yǎng)物質(zhì)的

要求，故菌株C的生長除需要碳源外，還需要氮源、無機鹽、水等營養(yǎng)物質(zhì)。

(3)分析題圖表格可以看出在以淀粉為碳源的培養(yǎng)基中，菌株C不能生長，原因可能是菌株

C不能合成淀粉酶或菌株C不能分泌淀粉酶，因而不能利用淀粉。

(4)要測定生產(chǎn)S的最適制糖廢液為碳源的濃度，實驗自變量為制糖廢液的濃度，可分別配

制一系列不同濃度梯度的以制糖廢液為唯一碳源的培養(yǎng)基，培養(yǎng)菌株C,其他條件相同且適

宜，一段時間后，測定并比較不同濃度制糖廢液中的S的產(chǎn)量，S產(chǎn)量最高時對應(yīng)的制糖廢

液濃度，即為生產(chǎn)S的最適碳源濃度。

(5)利用制糖廢液生產(chǎn)S可以實驗廢物利用，既有利于減少污染、節(jié)省原料，又能降低生產(chǎn)

成本。

【命題意圖】本部分內(nèi)容以選考的形式出現(xiàn)，2道選考題，考生任選1道做答，對試題能力

的考查集中在識記和理解層次上，難度一般。考查的重點知識為主要涉及微生物的培養(yǎng)、分

離和計數(shù)技術(shù)、微生物的培養(yǎng)技術(shù)在生活中的運用。

【命題方向】生物技術(shù)實踐是高考的重要考點之一，考查的內(nèi)容為：將集中在傳統(tǒng)發(fā)酵技術(shù)

的原理和應(yīng)用、生物材料中有效成分的提取和分離、微生物的純化培養(yǎng)的操作和應(yīng)用上，可

能以環(huán)境污染為背景考查微生物的存在條件及微生物的分離、純化和培養(yǎng)過程，或以幾種發(fā)

酵產(chǎn)物的生產(chǎn)為背景材料進(jìn)行實驗設(shè)計，或結(jié)合其他專題知識，以多種形式來考查知識的應(yīng)

用能力。展望2023年高考仍會對考生的實驗探究能力和綜合能力進(jìn)行考查，但對能力的要

求并不高，難度變化不大，重在對主干知識的理解和識記。

【得分要點】

一、果酒和果醋的制作

1.制作原理與發(fā)酵條件

果酒制作果醋制作

菌種酵母菌醋酸菌

模式圖GO

菌種來源附著在葡萄皮上的野生型酵母菌變酸酒表面的菌膜

有氧條件下，醛母菌通過有氧呼

氧氣、糖源充足時：C6Hl2。6+2。2-

吸大量繁殖：C6Hl2。6+6。2--

2CHCOOH+2CO+2HO；缺少糖

發(fā)酵過程6CO2+6H2O；無氧條件下，酵母322

源、氧氣充足時：C2H5OH+O2-

菌通過無氧呼吸產(chǎn)生酒精：

CH3COOH+H2O

C6Hl2。6—?2C2H5OH+2CO2

一般酒精發(fā)酵18?25°C，繁殖最

溫度最適為30?35℃

適為20℃左右

氣體前期：需氧，后期：無氧需要充足的氧氣

時間10?12天7?8天

2.發(fā)酵過程及注意事項

挑選葡萄沖洗榨汁酒精發(fā)酵f稍酸發(fā)醉

II

果酒果一

(1)實驗用具消毒：榨汁機要清洗干凈，并晾干。發(fā)酵瓶要用溫水沖洗，再用體積分?jǐn)?shù)

為70%的酒精消毒。

(2)挑選沖洗葡萄：先沖洗，后除去枝梗，不能反復(fù)沖洗，防止洗去野生酵母菌。

(3)榨汁：用榨汁機榨取葡萄汁，裝入發(fā)酵瓶中。

(4)果酒發(fā)酵：放在18?25℃的溫度下發(fā)酵，發(fā)酵過程要注意適時排氣。

(5)取樣檢測：10?12d取樣檢測酒精含量，在酸性條件下，重鋁酸鉀與酒精反應(yīng)呈現(xiàn)

灰綠色。酵母菌數(shù)量鏡檢。

(6)果醋發(fā)酵：加入醋酸菌后溫度控制在30?35C,適時通入氧氣(無菌空氣)

3.發(fā)酵裝置的設(shè)計

(1)因酵母菌的繁殖需要空氣，醋酸菌是好氧菌，所以在果酒制作的前期和果醋制作的

整個過程中都需氧。而酵母菌產(chǎn)生酒精是在無氧條件下，應(yīng)控制充入氧的量，故應(yīng)在充氣口

設(shè)置開關(guān).

(2)由于在發(fā)酵過程中都產(chǎn)生CO2,因此又需設(shè)排氣口；為防止空氣中微生物的污染，

排氣口應(yīng)連接一個長而彎曲的膠管。

(3)因要對發(fā)酵的情況進(jìn)行及時監(jiān)測，應(yīng)設(shè)置出料口便于取料。

(4)果酒和果醋的發(fā)酵裝置及各個部件的作用

裝置圖結(jié)構(gòu)目的

醋酸發(fā)酵時連接充氣泵，輸入無菌空氣；制酒時

充氣口

關(guān)閉充氣口

充氣和口

排氣口用來排出CO2

長而彎

防止空氣中微生物的污染

曲的膠管

出料口便于取料，及時監(jiān)測發(fā)酹進(jìn)行的情況

4.實驗注意事項

(1)葡萄酒呈現(xiàn)深紅色的原因是紅葡萄皮的色素進(jìn)入發(fā)醛液。

(2)現(xiàn)在工廠生產(chǎn)果酒，為提高果酒的品質(zhì)，更好地抑制其他微生物的生長，采取的措

施是直接在果汁中加入人工培養(yǎng)的酵母菌。

二、豆腐乳制作

1.豆腐乳制作的原理

|毛霉等微生物

合成、分泌

I]

羽匕缶ffiAW氨基酸+叱*脂肪的甘油+

小分子的肽—脂肪裾

2.腐乳的制作流程

操作流程操作說明

讓豆腐上長出毛霉直接接種或利用空氣中的毛霉狗子

加鹽腌制目的是析出豆腐中的水分抑制微生物生長。

酒：抑制微生物生長，使腐乳具有獨特的香味。

加鹵湯裝瓶

香辛料：調(diào)味、防腐殺菌

密封腌制溫度為15?18°C,適合毛霉生長

3.腐乳制作的關(guān)鍵點分析

(1)豆腐的選?。憾垢恳?0%為宜，若含水量過高，豆腐塊不易成形；若含水量

過低，則不利于毛霉的生長。

(2)控制好材料的用量

①鹽的用量：制作時，應(yīng)逐層加鹽，近瓶口處鹽要鋪厚一些，以防止雜菌從瓶口進(jìn)入。

鹽的用量：豆腐毛坯：鹽=5：1,鹽的濃度過低，不足以抑制微生物生長，可能導(dǎo)致豆腐腐

敗變質(zhì)；鹽的濃度過高，會影響腐乳的口味。

②酒的用量：鹵湯中酒的含量控制在12%左右為宜。酒精含量的高低與腐乳后期發(fā)酵

時間的長短有很大關(guān)系：酒精含量越高，對蛋白酶的抑制作用也越大，會使腐乳成熟時間延

長；酒精含量過低，蛋白的的活性高，加快蛋白質(zhì)的水解，但雜菌繁殖快，豆腐易腐敗，難

以成塊。

(3)防止雜菌的污染

①用來腌制腐乳的玻璃瓶，洗刷干凈后要用沸水消毒。

②裝瓶腌制時，操作要迅速小心，且要逐層加鹽，離瓶口表面的鹽要鋪厚一些。

③加入鹵湯后，要用膠條將瓶口密封。封瓶時，最好將瓶口通過酒精燈的火焰，防止瓶

口被污染。

(4)發(fā)酵溫度：前期發(fā)酵溫度應(yīng)保持在15?18°C,如溫度過低，則菌絲生長緩慢，不能

進(jìn)入豆腐塊的深層：溫度過高，菌絲易老化和死亡，影響腐乳的品質(zhì)。

(5)發(fā)酵時間：發(fā)酵時間影響生化反應(yīng)速度及生化產(chǎn)物的量。

三、1.泡菜的制作

(1)菌種及來源：附著在蔬菜上的乳酸菌。

(2)制作原理

①發(fā)酵實質(zhì)：在無氧條件下，乳酸菌將葡萄糖分解成乳酸。

酶

②反應(yīng)式：C6Hl2。6—^2C3H6。3(乳酸)。

(3)制作流程

測定亞硝酸鹽祠

修整、洗滌、晾曬I

切分成條狀或片狀

ffPi配制鹽水口泡菜鹽水上遢

(4)泡菜制作的注意事項

①材料的選擇及用量

a.蔬菜應(yīng)新鮮，若放置時間過長，蔬菜中的硝酸鹽易被還原成亞硝酸鹽。

b.清水和鹽的質(zhì)量比為4：I,鹽水要煮沸后冷卻。煮沸有兩大作用，一是除去水中的

氧氣，二是殺滅鹽水中的其他細(xì)菌。

②防止雜菌污染：每次取樣用具要洗凈，要迅速封口。

③氧氣需求

a.泡菜壇要選擇透氣性差的容器，以創(chuàng)造無氧環(huán)境，有利于乳酸菌發(fā)酵，防止蔬菜腐

b.泡菜壇壇蓋邊沿的水槽內(nèi)注滿水，以保證壇內(nèi)乳酸菌發(fā)酵所需的無氧環(huán)境，并注意

在發(fā)酵過程中經(jīng)常補水。

④控制適宜的溫度：以18?20C為宜，溫度偏高有害菌活動能力強，溫度偏低不利于

乳酸發(fā)酵。

2.檢測亞硝酸鹽含量

⑴原理

①亞硝酸鹽+對氨基苯磺酸f反應(yīng)物；

反應(yīng)物+N-1—蔡基乙二胺鹽酸鹽玫瑰紅色染料。

②亞硝酸鹽溶液的濃度越高，顏色越迷；濃度越低，顏色越淺。

(2)流程

配制溶液I-I制備標(biāo)準(zhǔn)顯色液I一I制備樣品處理液If

（3）用顯色反應(yīng)后的樣品與已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)顯色液進(jìn)行過比，并估算泡菜中亞硝酸鹽的

含量。

3.泡菜制作過程中乳酸菌、乳酸和亞硝酸鹽的變化情況分析

y目

乳酸菌乳酸亞硝酸鹽

發(fā)酵少（有氧氣，乳酸菌活增加（硝酸鹽還原菌

少

初期動受到抑制）作用）

下降（硝酸鹽還原菌

發(fā)酵最多（乳酸抑制其他積累增多，

受抑制，部分亞硝酸

中期菌活動）pH下降

鹽被分解）

下降至相對穩(wěn)定（硝

發(fā)酵減少（乳酸積累，pH繼續(xù)增多，pH繼續(xù)下

酸鹽還原菌被完全抑

后期下降，抑制其活動）降

制）

亞

乳

硝

酸

酸

菌

鹽

含

S含

曲線M

。發(fā)酵筆胖發(fā)酷時血°發(fā)酹發(fā)酵發(fā)酵時血C

發(fā)酵發(fā)酵發(fā)酵時期

初期中期后期初期中期后期初期中期后期

四、培養(yǎng)基及微生物的純化培養(yǎng)技術(shù)

1.培養(yǎng)基：人們按照微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的不同需求，配制出供其生長繁殖的營養(yǎng)基質(zhì)。

（1）營養(yǎng)組成：一般都含有水、碳源、氮源和無機鹽。止匕外，還需要滿足微生物生長對

pH、氧氣以及特殊營養(yǎng)物質(zhì)的要求。

⑵種類

①按照物理性質(zhì)可分為雌培養(yǎng)基、固體培養(yǎng)基、半固體培養(yǎng)基。

②按照成分的來源可分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。

③按照功能用途可分為選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基等。

④下表為某微生物培養(yǎng)基的成分舉例

葡萄糖尿素瓊脂

KH2Po4Na2HPO4MgS04?7H2OH2O

1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g1000mL

該培養(yǎng)基中可以為微生物提供碳源的是葡萄糖,此培養(yǎng)基為固制K培養(yǎng)基，因此培養(yǎng)基中

加入了瓊脂。

2.無菌技術(shù)：在培養(yǎng)微生物的操作中，所有防止雜菌污染的方法。常用方法如下圖:

區(qū)別：能否殺死

I煮沸消毒法卜r全部微生物，H灼燒滅菌~~

化學(xué)藥劑消毒法卜

~勰I~H--1干熱滅菌

I紫外線消毒法卜國鍵?q高壓蒸汽滅窗7

防止外來雜菌的入侵

3.大腸桿菌的純化培養(yǎng)

(1)制備牛肉膏蛋白豚固體培養(yǎng)基

_依據(jù)：配方比例

①計算,

I計算：配制一定體積的培養(yǎng)基時,各種成分的用量

|牛肉膏要放在稱量紙上稱量

②稱重i牛肉膏和蛋白陳都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱取后及時蓋上瓶蓋

'牛肉一連同稱量紙一同放入燒杯,加入少量水，加熱

③溶化，牛肉膏溶化后取出稱量紙，加入稱量好的蛋白陳和氯化鈉,攪拌

加入瓊脂,加熱使其熔化，并不斷攪拌，補加蒸鐲水定容

④滅菌

J滅菌前：調(diào)節(jié)出

i方法：高壓蒸汽滅菌法。壓力為100kPa,溫度為121℃,滅菌時間為15?30min

'倒平板應(yīng)在酒精燈火焰附近

⑤倒平板，甲、乙、丙中的滅菌方法是灼燒滅菌

,T中的操作需要等待平板冷卻凝固后才能進(jìn)行

O艇

甲乙丙丁

(2)純化大腸桿菌

①純化培養(yǎng)原理：想方設(shè)法在培養(yǎng)基上得到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可見的菌落，即

可獲得較純的菌種。

②純化大腸桿菌的關(guān)鍵步驟：接種。

③常用的微生物接種方法有兩種

a.平板劃線法：通過接種環(huán)在瓊脂固體培養(yǎng)基表面連續(xù)劃線的操作，將聚集的菌種逐

步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面。在數(shù)次劃線后培養(yǎng)，可以分離到由一個細(xì)胞繁殖而來的肉眼可

見的子細(xì)胞群體，即菌落。

b.稀釋涂布平板法：是將菌液進(jìn)行一系列的梯度稀釋，然后將不同稀釋度的菌液分別

涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面，進(jìn)行培養(yǎng)。在稀釋度足夠高的菌液里，聚集在一起的微生物

將被分散成單個細(xì)胞，從而能在培養(yǎng)基表面形成單個的菌落。

圖甲圖乙

微生物的接種方法

(1)平板劃線法：幾種劃線方法示意圖

(2)稀釋涂布平板法：10倍系列稀釋操作。

①將分別盛有9mL水的6支試管滅菌，并按ICT?106的順序編號。

②進(jìn)行梯度稀釋時，從菌液開始，每次從前一試管中取1mL溶液注入到下一試管中混

勻。(如圖丙)

格菌

液

在

培

布

涂

布

。

養(yǎng)

皿

培

均

勻

布

④純化微生物的接種方法的比較

項目平板劃線法稀釋涂布平板法

優(yōu)點可以觀察菌落特征，對混合菌進(jìn)行分離可以計數(shù)，可以觀察菌落特征

操作較麻煩,平板干燥效果不好，

缺點不能計數(shù)

容易蔓延

適用范圍適用于好氧菌適用丁一厭氧菌和兼性厭氧菌

4.菌種的保存方法

(1)對于頻繁使用的菌種，可以采用臨時保藏的方法。

(2)對于需要長期保存的菌種，可以采用甘油管藏的方法。

1.培養(yǎng)基的配制原則

(1)目的要明確：配制時應(yīng)根據(jù)微生物的種類、培養(yǎng)目的等確定配制的培養(yǎng)基種類。

(2)營養(yǎng)要協(xié)調(diào)：注意各種營養(yǎng)物質(zhì)的濃度和比例。

(3)pH要適宜：細(xì)菌為6.5?7.5,放線菌為7.5?8.5,真菌為5.0?6.0,培養(yǎng)不同微生物

所需pH不同。

(4)認(rèn)清不同生物需要的管養(yǎng)物質(zhì)不同

①微生物需要的營養(yǎng)成分有水、無機鹽、碳源、氮源，有些微生物還需要特殊營養(yǎng)物質(zhì)，

如生長因子。

②在人和動物中，營養(yǎng)物質(zhì)包括水、無機鹽、糖類、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、維生素六類。

③在植物中，營養(yǎng)物質(zhì)包括礦質(zhì)元素、水、二氧化碳三類。

2.培養(yǎng)基的成分

營養(yǎng)物質(zhì)含義作用主要來源

無機物:82、NaHCO；有機物：

構(gòu)成生物體的物質(zhì)，異養(yǎng)生物3

碳源能提供碳元素的物質(zhì)糖類、脂肪酸、石油、花生粉餅

的能源物質(zhì)

等

無機物：N2、NH3、氨鹽、硝酸鹽；

合成蛋白質(zhì)、核酸以及含氮代

氮源能提供犯元素的物質(zhì)有機物：尿素、牛肉膏、蛋白陳

謝產(chǎn)物

等

生長必不可少的微量有

生長因子能和核酸的成分維生素、氨基酸、堿基等

機物

細(xì)胞生命活動必不可少不僅是良好的溶劑，還是結(jié)

水培養(yǎng)基、大氣、代謝產(chǎn)物

的物質(zhì)構(gòu)物質(zhì)

提供除碳、氮元素以外細(xì)胞內(nèi)的組成成分，生理調(diào)

無機鹽的各種重要元素，包括節(jié)物質(zhì)；某些化能自養(yǎng)型細(xì)培養(yǎng)基、大氣

某些大量元素菌的能源；酶的激活劑

3.培養(yǎng)基的分類

種類特點應(yīng)用

液體培養(yǎng)基不加凝固劑工業(yè)生產(chǎn)

物理性質(zhì)微生物的分離、鑒定、

固體培養(yǎng)基加凝固劑

活菌計數(shù)、保藏

天然培養(yǎng)基含化學(xué)成分不明的天然物質(zhì)工業(yè)生產(chǎn)

化學(xué)成分培養(yǎng)基成分明確或用一定化學(xué)

合成培養(yǎng)基分類、鑒定

物質(zhì)配制

添加某物質(zhì)，抑制雜菌生長，

選提培養(yǎng)基培養(yǎng)分離出

促進(jìn)所需微生物生長

用途

特定微生物鑒別根據(jù)微生物的代謝特點，在培

鑒別微生物

培養(yǎng)基養(yǎng)基中加入某種指示劑

4.平板劃線操作的注意事項

(1)操作第一步即取菌種之前及每次劃線之前都需要對接種環(huán)進(jìn)行火焰灼燒滅菌，劃線

操作結(jié)束時，仍需灼燒接種環(huán)，每次灼燒目的不同：

①第一次操作目的是殺死接種環(huán)上原有的微生物。

②每次劃線之間操作目的是殺死上次劃線后接種環(huán)上殘留的菌種，使下次劃線的菌種直

接來源于上次劃線的末端，使每次劃線菌種數(shù)目減少。

③劃線結(jié)束操作目的是殺死接種環(huán)上殘存的菌種，避免細(xì)菌污染環(huán)境和感染操作者。

(2)灼燒接種環(huán)，待其冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。

(3)第二次及其以后的劃線操作總是從上一次劃線末端開始，能使細(xì)菌的數(shù)目隨著劃線

次數(shù)的增加而逐漸減少，最終得到由單個細(xì)菌繁殖而來的菌落。

(4)劃線時最后一區(qū)不要與第一區(qū)相連。

(5)劃線用力大小要適當(dāng)，防止用力過大將培養(yǎng)基劃破。

五、微生物的篩選和計數(shù)

1.土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計數(shù)

(1)分離原理：土壤中的細(xì)菌之所以能分解尿素，是因為它們能合成典這種物質(zhì)在

把尿素分解成無機物的過程中起到催化作用。

(2)統(tǒng)計菌落數(shù)目一般用稀釋涂布平板法。

ImLImLImL

Vv7v^￡Z'

IO6

9mL

無菌水

小土樣鐮￡

①統(tǒng)計菌落數(shù)目時，培養(yǎng)基表面生長的1個菌落,來源于樣品稀釋液中L個活菌。為了

保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30?300的平板進(jìn)行計數(shù)。

②從平板上的菌落數(shù)推測出每克樣品中的菌落數(shù)的計算方法是(平均菌落數(shù)+涂布的稀

釋液體積)X稀釋倍數(shù)。

③利用稀釋涂布平板法成功統(tǒng)計菌落數(shù)目的關(guān)鍵是恰當(dāng)?shù)南♂尪取?/p>

用稀釋涂布平板法統(tǒng)計的菌落數(shù)往往比活菌的實際數(shù)目低，這是因為當(dāng)兩個或多個細(xì)

胞在一起時，平板上觀察到的只是一個菌落。

(3)實驗流程:

①土壤取樣一富含有機質(zhì)的土壤表層土

1

②樣品的稀釋一通常選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30?300之間、

適于計數(shù)的平板

1

③接種一用稀釋涂布平板法接種

i

'細(xì)菌：30?37℃培養(yǎng)1?2天

④培養(yǎng)放線菌：25?28℃培養(yǎng)5?7天

.霉菌：25?28C培養(yǎng)3?4天

i

⑤觀察一根據(jù)菌落的特征區(qū)分微生物

i

⑥計數(shù)一統(tǒng)計睡的數(shù)目

I

⑦計算一根據(jù)公式“每克樣品中的菌落數(shù)=(C+V)XM[C代表某一稀釋度下平板上生長的平均

菌落數(shù)，V代表涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL),M代表稀釋倍數(shù)]”進(jìn)行計算。

用顯微鏡直接計數(shù)法計數(shù)：血細(xì)胞計數(shù)板法

①結(jié)構(gòu)：常用的是1mmxlmmxO.lmm方格的計數(shù)板(如圖)。每個計數(shù)板上有兩個計數(shù)

室，每個計數(shù)室上刻有9個大方格，其中只有中間的大方格為計數(shù)室，大方格的長和寬各為

Imm,深度為0.1mm,其容積為0.1mm3;大方格內(nèi)分為25中格，每一中格又分為16小

格,即大方格是由400個小方格組成。

②操作：將清潔干燥的血球計數(shù)板的計數(shù)室上加蓋專用的蓋玻片，用吸管吸取稀釋后的

菌液，滴于蓋玻片邊緣，讓培養(yǎng)液自行緩緩滲入，充滿計數(shù)室。

③計數(shù)：在顯微鏡下計數(shù)4?5個中方格內(nèi)的菌體數(shù)，求出每個小方格所含有的細(xì)菌的

平均數(shù)，按照以下公式計算：每毫升原液含有的菌數(shù)=每小格平均細(xì)菌數(shù)x400xl04x原液被

稀釋倍數(shù)。

2.分解纖維素的微生物的分離

(1)纖維素酣

①組成：纖維素酶是一種復(fù)合酶,一般認(rèn)為它至少包括三種組分，即C酶、Cx酶和葡

萄糖昔酶。

南作田紅*左Q薛前萄糖甘酒

⑷作用纖維素二，二纖維一一糖---------*葡萄糖

Cx?-------------------------

(2)纖維素分解菌的篩選

①原理

纖維素分解菌

I|

［譬/紅色復(fù)合物必極紅色消失.出現(xiàn)透明圈

纖維素J

②篩選方法：剛果紅染色法,即通過是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

③培養(yǎng)基：以紅維素為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基。

④實驗流程

土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境

選擇培養(yǎng)：用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，以增加纖維素分解菌的濃度

I

梯度稀釋：制備系列稀釋液

I

涂布平板：將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上

挑選產(chǎn)生透明圈的菌落

3.篩選微生物的兩個實例比較

比較項目土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離分解纖維素的微生物的分離

利用以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基進(jìn)利用富含纖維素的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行選

方法

行選擇培養(yǎng)擇培養(yǎng)

因為培養(yǎng)基中含有豐富的纖維素，因

只有分解尿素的細(xì)菌能夠合成胭酶，才

原理此能夠分解纖維素的微生物具有更多

能在以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基上生長

的生存機會而大量繁殖

剛果紅染色法，菌落周圍出現(xiàn)不變紅

在培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，指示劑變

鑒定的透明圈的菌落為分解纖維素的微生

紅說明菌落中的菌體為分解尿素的細(xì)菌

物的菌落

4.微生物兩種計數(shù)方法的比較

比較項目間接計數(shù)法(稀釋涂布平板法)直接計數(shù)法(顯微計數(shù)法)

當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時，培養(yǎng)基表面生長的利用特定細(xì)菌計數(shù)板或血細(xì)

一個菌落，來源于樣品稀釋液中的一個活菌，胞計數(shù)板，在顯微鏡下計算一

原理

通過統(tǒng)計平板上的菌落數(shù)，就能推測出樣品中定容積的樣品中微生物的數(shù)

大約含有多少活菌量

每克樣品中的菌落數(shù)：(C+VRM

每毫升原液所含細(xì)菌數(shù)：每小

C：某稀釋度下平板上生長的平均菌落數(shù)；V：

公式格平均細(xì)菌數(shù)x400x10OOOx

涂布平板時所用的稀釋液的體積(mL);M：稀

稀釋倍數(shù)

釋倍數(shù)

當(dāng)兩個或多個菌體連在一起時，平板上觀察到

缺點不能區(qū)分細(xì)胞死活

的只是一個菌落

結(jié)果比實際值偏小比實際值偏大

六、微生物的篩選與鑒別

1.纖維素酶

(1)組成：纖維素酶是一種復(fù)合酶，它包括Ci酶、Cx酶和葡萄糖甘酶。

(2)作用

「纖維素施(復(fù)合酶)q

纖維素G薛、身纖維二糖—年葡萄糖

2.菌種篩選

(1)方法：剛果紅染色法。

⑵原理

纖維素分解菌

I

剛果紅］奸維素幅

“心主一紅色復(fù)合物,3紅色消失、出現(xiàn)透明圈

纖維素J

即：使用以纖維素為唯一碳源的選擇培養(yǎng)基，根據(jù)是否產(chǎn)生透明圈來篩選纖維素分解菌。

3.篩選流程

土壤取樣：富含纖維素的環(huán)境

I

選擇培養(yǎng)：用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)，以增加纖維素分解菌的數(shù)量

I

梯度稀釋

I

涂布平板：將樣品涂布于含CR的鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上

挑選產(chǎn)生透明圈的菌落：產(chǎn)生纖維素醐的菌落周圍出現(xiàn)透明圈

4.微生物的鑒別方法

(1)菌落特征鑒別法：根據(jù)微生物在固體平板培養(yǎng)基表面形成的菌落的形狀、大小、隆

起程度和顏色等特征進(jìn)行鑒別。

(2)指示劑鑒別法：如以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種微生物

后，培養(yǎng)基變紅說明該種微生物能夠分解尿素。

(3)染色鑒別法：如利用剛果紅染色法，根據(jù)培養(yǎng)基中出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透

明圈來篩選分解纖維素的微生物。

5.篩選微生物的三種方法

(1)單菌落挑取法：利用平板劃線法或稀釋涂布平板法接種到固體平板培養(yǎng)基表面，直

接根據(jù)微生物菌落的特征利用單菌落挑取的方法獲得目的微生物。

(2)選擇培養(yǎng)法：利用選擇培養(yǎng)基對微生物進(jìn)行選擇培養(yǎng)，直接獲得目的微生物。

(3)鑒定培養(yǎng)法：利用鑒別培養(yǎng)基使目的微生物菌落呈現(xiàn)特有的特征，然后篩選目的微

生物。

6.選擇培養(yǎng)基四種常見制備方法或?qū)嵗?/p>

■H依據(jù)某些微生物對某些物質(zhì)的抗性，在培養(yǎng)基

轡》中加人某些物質(zhì)，以“抑制”不需要的微生物，

@“促進(jìn)”所需耍的微生物生長。

鬻器培養(yǎng)電中加入高濃度食鹽時可抑制多種細(xì)

舉例L菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生

嶼長，從而可將該菌分離出來；

在培養(yǎng)基中加入青霉素時可抑制細(xì)菌、放

j線菌的生長，從而分離得到酵母菌和霉菌。

培養(yǎng)基中缺乏氮源時，可分離自生固氮微生物,

i非自生固氤微生物因缺乏氮源而無法生存；

改變培養(yǎng)基

培養(yǎng)基中若缺乏有機碳源則異養(yǎng)微生物無法

營養(yǎng)成分

一生存，而自養(yǎng)微生物可利用空氣中的CO?制造

有機物生存。

利用培養(yǎng)基的當(dāng)石油是唯一碳源時，可抑制不能利用石

油的微生物的生長,使能夠利用石油的微

“特定化學(xué)成分”生物生存，從而分離出能消除石油污染的

?分離微生物。

在高鹽環(huán)境中可分離耐鹽菌，其他菌在鹽濃

通過某些度高時易失水而不能生存；

方“特殊環(huán)境”

法分離微生物

四在高溫環(huán)境中可分離得到耐高溫的微生物，

其他微生物在高溫環(huán)境中因醉失活而無法

生存。

七、植物有效成分的提取

1.植物有效成分的提取方法

提取方法方法步驟適用范圍

適用于提取玫瑰油、薄荷油等揮發(fā)性

水蒸氣蒸儲水蒸氣蒸儲f分離油層f除水過濾

強的芳香油

石灰水浸泡f漂洗f壓榨、過濾、適用于柑橘、檸檬等易焦糊原料的提

壓榨

靜置一再次過濾取

適用范圍廣，要求原料的顆粒要盡可

有機溶劑萃取粉碎、干燥f萃取、過濾f濃縮

能細(xì)小，能充分浸泡在有機溶劑中

2.實例

(1)玫瑰精油的提取

(2)橘皮精油的提取

⑶胡蘿卜素的提取

原理.胡蘿卜素不溶于水，易溶于石油分等

一有機溶劑

座T萃取法|

胡蘿區(qū)

、卜素/菽流程胡蘿卜一粉碎一干燥一萃取一過濾

一|一濃縮一胡蘿卜素

紙層析法］

3.植物有效成分的提取的三種方法比較

提取方法水蒸氣蒸儲法壓榨法有機溶劑萃取法

使芳香油溶解在有機

利用水蒸氣將揮發(fā)性較強通過機械加壓，壓榨出果

實驗原理溶劑中，蒸發(fā)溶劑獲

的植物芳香油攜帶出來皮中的芳香油

得芳香油

①水蒸氣蒸儲①石灰水浸泡、漂洗①粉碎、干燥

方法步驟②分離油層②壓榨、過濾、靜置②萃取、過濾

③除水過濾③再次過濾③濃縮

適用范圍廣，要求原

適用于柑橘芳香油、檸檬

適用于提取玫瑰油、薄荷油料的顆粒要盡可能細(xì)

適用范圍芳香油等原料易焦糊芳香

等揮發(fā)性強的芳香汕小，能充分浸泡在有

油的提取

機溶劑中

生產(chǎn)成本低，易保持原料

優(yōu)點簡單易行，便于分離出油率高，易分離

原有的結(jié)構(gòu)和功能

使用的有機溶劑處理

水中蒸儲會導(dǎo)致原料焦糊分離較為困難，出油率相

局限性不當(dāng)會影響芳香油的

和有效成分水解等問題對較低

質(zhì)量

八、DNA的粗提取與鑒定

i.實驗原理

(l)DNA與蛋白質(zhì)在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同

2mol/L0.14mol/L

項目溶解規(guī)律

NaCl溶液NaCl溶液

DNA溶解度

DNA溶解析出

________:_NaCl

C0.14mol/L濃度

NaCl溶液物質(zhì)的量濃度

部分發(fā)生

蛋白質(zhì)從2mol/L逐漸降低的過溶解

鹽析沉淀

程中，溶解度逐漸增大

（2）DNA不溶于酒精溶液，但是細(xì)胞中的某些蛋白質(zhì)則溶于酒精，利用這一原理可將

DNA與蛋白質(zhì)進(jìn)一步分離。

（3）DNA與二苯胺沸水浴加熱，呈藍(lán)色。

2.操作流程

材料的選?。哼x用DNA含量相對較高的生物組織

破碎細(xì)胞（以雞血為例）：雞血細(xì)胞一加蒸餛水一用玻璃棒攪拌一用紗布過濾f收集濾液

去除雜質(zhì)：利用DNA在不同濃度的NaCl溶液中溶解度不同，通過控制NaCl溶液的濃度去除雜質(zhì)

DNA的析出：將處理后的溶液過濾，加入與濾液體積相等的、冷卻的體積分?jǐn)?shù)為95%的酒精溶液

DNA的鑒定：在溶有DNA的溶液中加入二苯胺試劑，混合均勻后將試管置于沸水中加熱5min,溶

液變成藍(lán)色

3.DNA的粗提取與鑒定實驗中的“2、4、4”

①加到雞血細(xì)胞液中，使血細(xì)胞吸水漲破；②加到含DNA的2mol/L

加蒸儲水2次的NaCl溶液中，使NaCl溶液的物質(zhì)的量濃度稀釋到0.14mol/L,使DNA

析出

①過濾血細(xì)胞破裂液，得到含細(xì)胞核物質(zhì)的濾液；②過濾用2moi/L的

NaCl充分溶解的DNA,濾去溶液中的雜質(zhì)；

用紗布過濾4次

③濾取0.14mol/L的NaCl溶液中析出的DNA（黏稠物）;④過濾溶有DNA

的2mol/L的NaCl溶液

①加2mol/L的NaCl溶液,溶解提取的細(xì)胞核物質(zhì);②用0.14mol/L的

用NaCl溶液4次N