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文檔簡(jiǎn)介

第四章酶的提取與分離純化預(yù)處理(pretreatment):包括固液分離和細(xì)胞破碎(分離胞內(nèi)產(chǎn)物)等。初步純化(roughfractionation)(提取):除去與目的產(chǎn)物性質(zhì)差異很大的雜質(zhì)。高度純化(finefractionation)(精制):除去與產(chǎn)物性質(zhì)相似的雜質(zhì)。濃縮與干燥(concentrationanddesiccation)(成品加工):使酶與溶劑分離的過(guò)程。

第二節(jié)酶的精制

酶純化的基本原則:①建立一個(gè)方便靈敏的分析方法;②選擇有效的純化方法,盡可能減少純化步驟;③常在低溫(4℃)條件下進(jìn)行純化,以避免酶的變性。

一、膜分離

借助一定孔徑的高分子薄膜,將不同大小、形狀、性質(zhì)的顆粒或分子進(jìn)行分離的技術(shù)。(一)擴(kuò)散膜分離(濃度差為推動(dòng)力)

——透析(dialysis)溶質(zhì)分子Y從高濃度一側(cè)通過(guò)膜向低濃度一側(cè)移動(dòng)蛋白質(zhì)透析

1.透析膜

商品透析膜大多制成管狀。材料:纖維素衍生物。1)透析膜的預(yù)處理:目的:除雜質(zhì)。

2)透析袋的保存:防腐劑+冷藏。2.透析方法及裝置

透析袋透析簡(jiǎn)單裝置。A:透析夾,B:透析,C:透析示意圖

(二)加壓膜分離(靜壓力差為推動(dòng)力)

根據(jù)所截留物質(zhì)顆粒大小的不同,分為:截留顆粒直徑操作壓力應(yīng)用微濾0.2~2m<0.1MPa除菌超濾20A~0.2m0.1~0.7MPa分離病毒及生物大分子反滲透<20A0.7~13MPa純水制備微濾(Microfiltration,MF)

一種靜態(tài)過(guò)濾,隨過(guò)濾時(shí)間延長(zhǎng),膜面上截流沉積不溶物,引起水流阻力增大,透水速率下降,直至微孔全被堵塞;超濾(ultrafiltration,UF

)

一種動(dòng)態(tài)過(guò)程,由泵提供推動(dòng)力,在膜表面產(chǎn)生兩個(gè)分力:一個(gè)是垂直于膜面的法向分力,使水分子透過(guò)膜面,另一個(gè)是與膜面平行的切向力,把膜面截流物沖掉。

超濾原理的示意圖

利用超濾膜在一定壓力下使溶液中大分子滯留,而小分子及溶劑濾過(guò)的方法。超濾法在蛋白質(zhì)溶液除鹽、濃縮及分離純化中有廣泛的應(yīng)用。常規(guī)過(guò)濾(A)和超濾(B)的示意圖

AB圖4-61

超濾濃縮裝置

反滲透(Reverseosmosis,RO)

利用反滲透膜選擇性地只能透過(guò)溶劑(通常是水)的性質(zhì),對(duì)溶液施加壓力,使溶劑通過(guò)反滲透膜而從溶液中分離出來(lái)的過(guò)程。滲透與反滲透ReverseOsmosis(RO)Nanofiltration(NF)Ultrafiltration(UF)Microfiltration(MF)MembraneFiltration3.電場(chǎng)膜分離(電位差為推動(dòng)力)電滲析:在離子交換膜的兩側(cè)分別裝上正、負(fù)電極。應(yīng)用:脫鹽,海水淡化,純水制備,從發(fā)酵液中分離檸檬酸、谷氨酸及凝膠電洗脫。二、層析法

層析法也稱色譜法,是1903年俄國(guó)植物學(xué)家MichaelTswett發(fā)現(xiàn)并命名的。將植物色素溶液通過(guò)裝有CaCO3

吸附劑的柱子,然后用石油醚淋洗,各種色素以不同的速率流動(dòng)后形成不同的色帶而被分開(kāi)。

色譜起源色譜組分色素石油醚碳酸鈣顆粒

用色彩(chroma)和圖譜(graphs)組成色譜一詞(Chromatography)。層析法的基本原理

利用混合物中各組分物理化學(xué)性質(zhì)的差異(如吸附力、分子形狀及大小、分子親和力、分配系數(shù)等),使各組分在流動(dòng)相和固定相中的分布程度不同,并以不同的速度移動(dòng)而達(dá)到分離的目的。mobilephase:攜帶樣品流過(guò)整個(gè)系統(tǒng)的流體

stationaryphase:靜止不動(dòng)的一相層析法的分類

按兩相所處的狀態(tài)分類:液相層析液-固層析液-液層析氣相層析氣-固層析氣-液層析

按層析過(guò)程的機(jī)理分類:吸附層析:利用吸附劑表面對(duì)不同組分吸附性能的差異。分配層析:利用不同組分在流動(dòng)相和固定相之間的分配系數(shù)的不同。離子交換層析:利用不同組分對(duì)離子交換劑親和力的不同。凝膠層析:利用某些凝膠對(duì)于不同分子大小的組分阻滯作用的不同。

按操作形式不同分類:柱層析:將固定相裝于柱內(nèi),使樣品沿一個(gè)方向移動(dòng)而達(dá)到分離。紙層析:用濾紙做液體的載體,點(diǎn)樣后,用流動(dòng)相展開(kāi),以達(dá)到分離鑒定的目的。薄層層析:將適當(dāng)粒度的吸附劑鋪成薄層,以紙層析類似的方法進(jìn)行物質(zhì)的分離和鑒定。ColumnChromatography

層析設(shè)備梯度洗脫器蠕動(dòng)泵(恒流泵)層析柱紫外監(jiān)測(cè)儀記錄儀部分收集器

蛋白質(zhì)定量-——紫外吸收法蛋白質(zhì)分子中的色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸殘基(主要是色氨酸Trp和酪氨酸Tyr的共軛雙鍵)對(duì)紫外光有吸收,以色氨酸吸收最強(qiáng),最大吸收峰為280nm。在波長(zhǎng)280nm具有吸光的氨基酸平衡、吸附鹽梯度沖洗分管收集蛋白測(cè)定制圖測(cè)A280記錄儀低溫層析柜層析操作分離前:1)樹(shù)脂預(yù)處理:凝膠溶漲。2)裝柱:重力沉降法,要求均勻,無(wú)氣泡。3)平衡:層析柱使用前,須用緩沖液平衡至所需的pH值和離子強(qiáng)度。層析操作分離中:上樣:體積盡可能小。平衡:用緩沖液使不被吸附的雜蛋白穿過(guò)。洗脫:連續(xù)梯度洗脫:連續(xù)改變緩沖液的pH或離子強(qiáng)度。階梯式梯度洗脫:分段地改變緩沖液的pH或離子強(qiáng)度。等溫平衡洗脫:用平衡緩沖液直接進(jìn)行擴(kuò)展洗脫。同時(shí)進(jìn)行分步收集和檢測(cè)。

分離后:再生,平衡,保存。(一)吸附層析

(adsorptionchromatography)

1.原理利用吸附劑對(duì)不同物質(zhì)吸附力不同而使混合物中各組分分離的方法。吸附作用的強(qiáng)弱主要與吸附劑和被吸附物質(zhì)的性質(zhì)有關(guān)。吸附層析的關(guān)鍵是吸附劑和洗脫劑的選擇。2.吸附劑1)吸附劑的選擇:根據(jù)吸附能力強(qiáng)弱分為:弱吸附劑:蔗糖、淀粉中等吸附劑:碳酸鈣、磷酸鈣、硅膠等強(qiáng)吸附劑:氧化鋁、活性炭吸附劑的選擇根據(jù)相似相溶原則:極性強(qiáng)的吸附劑易吸附極性強(qiáng)的物質(zhì)非極性的吸附劑易吸附非極性的物質(zhì)。但為了便于解吸附,對(duì)于極性強(qiáng)的物質(zhì)通常選用極性弱的吸附劑進(jìn)行吸附。

2)吸附劑的性質(zhì):活性炭:常用的吸附介質(zhì)。硅膠:常用的極性吸附介質(zhì)。羥基磷灰石(HA)[Ca10(PO4)6.(OH)2]:

微晶型的磷酸鈣制品,表面有Ca2+和PO43-兩種帶電基團(tuán);吸附原理是HA的Ca2+與蛋白質(zhì)的負(fù)電荷基團(tuán)作用。

3.洗脫劑要求:

粘度小,純度高,穩(wěn)定性好,完全洗脫下所要分離的成分,易與目標(biāo)分子分離。選擇:

具有較高洗脫能力的洗脫劑作為流動(dòng)相。生物大分子一般選擇中性鹽溶液為洗脫劑。4.應(yīng)用

分離純化生物大分子(二)凝膠過(guò)濾層析

凝膠過(guò)濾(gelfiltration)又稱分子篩層析(molecularsievechromatography)、排阻層析(exclusionchromatography),是以各種多孔凝膠為固定相,利用溶液中各組分的分子量不同而進(jìn)行分離的技術(shù)。1.基本原理

大分子物質(zhì)不能進(jìn)入凝膠孔內(nèi),在凝膠顆粒之間的空隙向下移動(dòng),并最先被洗脫出來(lái);小分子物質(zhì)可自由出入凝膠孔,流程長(zhǎng)而后流出層析柱。Size-exclusionchromatography凝膠對(duì)溶質(zhì)的排阻程度可用分配系數(shù)Kd表示:

Ve-VoKd=————ViVo——外水體積,層析柱內(nèi)凝膠顆粒之間空隙的體積(ml)Vi——內(nèi)水體積,層析柱內(nèi)凝膠顆粒內(nèi)部各微孔體積的總和(ml)Ve——某組分的洗脫體積,從加進(jìn)層析柱到流出液中該組分出現(xiàn)高峰時(shí)的洗脫液體積(ml)凝膠過(guò)濾柱色譜洗脫的三種峰Ⅰ.Kd=0時(shí),即Ve=Vo,說(shuō)明該組分分子量足夠大,不進(jìn)入微孔,最先流出。Ⅱ.Kd=1時(shí),即Ve=Vo+Vi,說(shuō)明該組分能進(jìn)入凝膠的全部?jī)?nèi)空隙,最后流出。Ⅲ.其它組分0<Kd<1,因分子大小而改變洗脫峰的位置。Kd小的先流出,Kd大的后流出。

分配系數(shù)Kd的意義:1)可定量地衡量各組分的流出順序。2)判斷分離效果,Kd差異大,分離效果好,

Kd差異小,分離效果差。2.凝膠的種類和性質(zhì)

1)交聯(lián)葡聚糖凝膠(dextrangel)

商品名:Sephadex

型號(hào)

SephadexG-10至G-200G后的數(shù)字為凝膠吸水值的10倍。數(shù)字越大,交聯(lián)度越小,孔徑越大,分離范圍越廣。凝膠型號(hào)

顆粒大小/μm

溶脹體積/(ml/g)

分離范圍(Mr)

SephadexG-10

SephadexG-15

SephadexG-25

SephadexG-50

SephadexG-75

SephadexG-100

SephadexG-150SephadexG-2004~120

4~120

50~150

50~150

40~120

40~120

40~120

40~120

2~3

2.5~3.5

4~6

9~11

12~15

15~20

20~30

20~30

小于7×102

小于1.5×103

1.0×103~5.0×103

1.5×103~3.0×1043.0×103~8.0×104

4.0×103~1.0×105

5.0×103~3.0×105

5.0×103~6.0×105

葡聚糖凝膠層析介質(zhì)的有關(guān)參數(shù)

2)瓊脂糖凝膠(agarosegel)

商品名:Sepharose(瑞典);Bio-GelA(美國(guó))依靠糖鏈之間的次級(jí)鍵維持網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),瓊脂糖密度越大,網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)越密集。型號(hào)

使用范圍(蛋白質(zhì)的分子量)含瓊脂糖(℅)

6BSepharose4B2B104~3×106105~3×107106~108

642

6BSepharoseCL4B2B

同上

同上

0.5m

Bio-GelA1.5m5m15m50m150m10~500×10310~150010~500040~15000100~500001000~150000

1086421

Sepharose及Bio-gelA型號(hào)

3)聚丙烯酰胺凝膠(polyacrylamidegel)

商品名為Bio-Gel,型號(hào)從Bio-GelP-2至P-300,P值越大,孔徑也越大。以丙烯酰胺為單體,以甲叉雙丙烯酰胺為交聯(lián)劑聚合成的高分子聚合物。3.操作:1)凝膠的選擇和處理根據(jù)相對(duì)分子質(zhì)量范圍選擇相應(yīng)型號(hào)的凝膠介質(zhì)。將干膠懸浮于5~10倍的蒸餾水中,充分溶脹,抽氣,裝柱。2)柱的選擇采用L/D比值高的柱子,可提高分辨率,但影響流速。3)加樣體積不能過(guò)多,不超過(guò)床體積的5%,脫鹽時(shí)可在10%左右。4)洗脫洗脫液與平衡時(shí)用的buffer一致。洗速不可過(guò)快,保持恒速。5)膠的保存洗脫完畢后,凝膠柱已恢復(fù)到上柱前的狀態(tài),不必再生處理。用0.02%NaN3防腐。4.應(yīng)用

1)脫鹽2)生物大分子物質(zhì)的分離純化

3)分子量的測(cè)定

4)溶液濃縮LogMABCLogM測(cè)V測(cè)LogM=k1-k2Ve(Ve為洗脫體積)

先測(cè)得幾種標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的Ve,并以其分子量對(duì)數(shù)對(duì)Ve作圖得一直線,再測(cè)出待測(cè)樣品的Ve,查標(biāo)準(zhǔn)曲線即可確定分子量。蛋白質(zhì)的洗脫體積與其分子量有關(guān)(三)離子交換層析

(ionexchangechromatography,IEC)1.原理:根據(jù)待分離物質(zhì)帶電性質(zhì)不同的分離純化方法。1)離子交換劑:離子交換劑由載體、電荷基團(tuán)和反離子構(gòu)成。

如羧甲基纖維素離子交換劑組成纖維素—O—CH2—COO-—Na+

載體電荷基團(tuán)反離子

化學(xué)原料合成:樹(shù)脂類物質(zhì)載體

天然材料制成:cellulose

sephadexsepharose

陽(yáng)離子交換劑:電荷基團(tuán)(-),反離子(+)電荷基團(tuán)陰離子交換劑:電荷基團(tuán)(+),反離子(-)

如:DEAE-纖維素,CM-Sepharose離子交換劑--帶有電荷基團(tuán)的不溶性載體-O-CH2CH2N-HCH2CH3CH2CH3Cl-載體Diethylaminoethyl(DEAE)

陰離子交換劑(可吸附帶負(fù)電的蛋白質(zhì))

陽(yáng)離子交換劑(可吸附帶正電的蛋白質(zhì))兩種離子交換劑陰離子交換劑:常用二乙氨基乙基,二乙氨基乙基2-羥丙基陽(yáng)離子交換劑:常用羧甲基CM—CH2COO-

磺丙基SP—C3H6SO3-DEAE-C2H4N+(C2H5)2HQAE-C2H4N+(C2H5)2CH2CH(OH)CH3

離子交換葡聚糖

以SephadexG-25,G-50為骨架,接入離子交換基團(tuán)。

DEAE(QAE)SephadexA-25,A-50CM(SP)SephadexC-25,C-50

A:anion陰離子

C:cation陽(yáng)離子類型說(shuō)明功能基團(tuán)反離子DEAE-SephadexA-25,A-50弱堿性陰離子交換劑二乙氨基己基氯QAE-SephadexA-25,A-50強(qiáng)堿性陰離子交換劑二乙氨基己基—2-羥丙基氯CM-SephadexC-25,C-50弱酸性陽(yáng)離子交換劑羧甲基鈉SP-SephadexC-25,C-50強(qiáng)酸性陽(yáng)離子交換劑磺丙基鈉離子交換葡聚糖

離子交換劑的選擇a.強(qiáng)、弱離子交換劑的選擇:強(qiáng)型:適用的pH范圍廣,制備無(wú)離子水

弱型:適用的pH范圍窄,分離生物大分子物質(zhì)

b.陰、陽(yáng)離子交換劑的選擇:酶的穩(wěn)定性若<pI穩(wěn)定,蛋白質(zhì)帶正電荷,用陽(yáng)離子交換劑若>pI穩(wěn)定,蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷,用陰離子交換劑2)蛋白質(zhì)的電荷性質(zhì)pH值如何影響蛋白質(zhì)的電荷數(shù)24681012140系統(tǒng)pH+

蛋白質(zhì)帶正電荷

蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷等電點(diǎn)-

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理利用不同的蛋白質(zhì)分子在溶液中所帶電荷不同,從而與離子交換劑有不同結(jié)合力而分離。pH6.0pI>6.0蛋白質(zhì)帶正電pI<6.0蛋白質(zhì)帶負(fù)電2.陰離子交換劑分離蛋白質(zhì)的過(guò)程平衡吸附去吸附分離結(jié)束再生+低鹽高鹽利用不同鹽濃度將不同蛋白質(zhì)洗脫下來(lái)Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Cl-Ion-exchangechromatography3.操作平衡上樣平衡洗脫再生1)上樣:上樣體積不十分嚴(yán)格。2)洗脫:

增加溶液的離子強(qiáng)度

梯度洗脫法

改變?nèi)芤旱膒H值

3)再生:用0.5mol/LNaOH和0.5mol/LNaCl混合溶液或0.5mol/LHCl處理。4.應(yīng)用制備純化生物大分子圖4-39梯度溶液的制備方法和洗脫曲線(a)線性梯度;(b)凸形梯度;(c)凹形梯度;(d)編程梯度(四)疏水層析(HydrophobicInteractionChromatography,HIC)從分離純化的機(jī)制看,屬吸附層析類。利用疏水層析介質(zhì)和蛋白質(zhì)分子都具有一定的疏水性質(zhì),根據(jù)被分離成分與固定相之間疏水力大小的不同而進(jìn)行分離。

大多數(shù)蛋白質(zhì)具有較強(qiáng)的親水性,但分子內(nèi)部存在一個(gè)疏水核心,欲讓蛋白質(zhì)與疏水性固定相結(jié)合在一起,可以靠蛋白質(zhì)表面的一些疏水補(bǔ)丁(hydrophobicpatch),或讓蛋白質(zhì)發(fā)生局部變性(可逆),暴露出掩藏于分子內(nèi)的疏水性殘基。原理:

在高鹽濃度下,蛋白質(zhì)發(fā)生局部可逆變性,被迫與疏水層析的固定相結(jié)合在一起,然后通過(guò)降低流動(dòng)相的離子強(qiáng)度,即可將結(jié)合于固定相的蛋白質(zhì),按其結(jié)合力大小,依次進(jìn)行解吸附。2.層析介質(zhì)

親水性(如Sepharose)基質(zhì)固定相疏水性(如硅膠、樹(shù)脂)配體(疏水性基團(tuán))(苯基、辛基、烷基)產(chǎn)品名稱載體配基生產(chǎn)公司苯基Sepharose4B瓊脂糖凝膠珠苯基Pharnacia辛基Sepharose4B瓊脂糖凝膠珠辛基Pharnacia烷基交聯(lián)瓊脂糖凝膠珠瓊脂糖凝膠珠烷基(Cn)以色列

一些商品疏水層析介質(zhì)

3.操作平衡上樣平衡洗脫再生1)加樣:樣品溶液中補(bǔ)加適量的鹽。2)洗脫:用降低鹽濃度的平衡緩沖液洗脫。3)再生:除去固定相吸附的雜質(zhì),用水或

8mol/L脲素溶液。4.應(yīng)用主要用于分離純化大分子物質(zhì)。

(五)親和層析(AffinityChromatography)

由吸附層析發(fā)展起來(lái)的,是從復(fù)雜混和物中純化蛋白質(zhì)的最好方法。又稱:功能層析(functionchromatography)生物專一吸附(biospecificadsorption)選擇層析(selectivechromatography)

1.原理

利用生物大分子間特異的親和力來(lái)純化生物大分子,如:抗原和抗體;酶和底物或輔酶或抑制劑;激素和受體;RNA和其互補(bǔ)的DNA等。

將待純化物質(zhì)的特異配體通過(guò)適當(dāng)?shù)幕瘜W(xué)反應(yīng)共價(jià)連接到載體上,待純化的物質(zhì)可被配體吸附,雜質(zhì)則不被吸附,從層析柱流出,變換洗脫條件,即可將欲分離的物質(zhì)洗脫下來(lái),實(shí)現(xiàn)分離提純。+CCC配基蛋白質(zhì)1.配基固相化2.親和吸附固體載體3.解吸附Affinitychromatography2.基質(zhì)的選擇理想的基質(zhì)應(yīng)滿足以下要求:①高度的親水性。②極低的非特異性吸附性(惰性)。③具有足夠的化學(xué)基團(tuán)。④適當(dāng)?shù)亩嗫仔?。⑤較好的理化穩(wěn)定性??杀粦?yīng)用的基質(zhì)(載體):(按性能優(yōu)劣排序)瓊脂糖凝膠、聚丙稀酰胺凝膠、葡聚糖凝膠、纖維素。最常用的是瓊脂糖,Sepharose1B到10B3.配體的選擇一對(duì)可逆結(jié)合的生物分子中與載體相偶聯(lián)的一方稱配體。如抑制劑,底物,抗體,輔酶等。

優(yōu)良配體須具備的條件:1)與待純化的物質(zhì)有較強(qiáng)的親和力。2)具有與基質(zhì)共價(jià)結(jié)合的基團(tuán)。所要分離的目的產(chǎn)物

相應(yīng)的配基

酶抗體凝集素激素底物、抑制劑、輔酶(輔因子)抗原、病毒、細(xì)胞多糖、糖蛋白、細(xì)胞受體受體、載體蛋白

目的產(chǎn)物與相應(yīng)的配基

4.偶聯(lián)(親和吸附劑的制備)配體一定,改造載體(基質(zhì))1)基質(zhì)活化:不同的載體活化需要不同的活化劑。常用:溴化氰(CNBr)、環(huán)氧氯丙烷、1,4-丁二醚、戊二醛、高碘酸鹽、苯醌等。溴化氰法是最早使用且最常用的活化方法。如用CNBr作用于葡聚糖和瓊脂糖的糖羥基2)引入連接臂(spacearm)

又稱手臂(spacer)“接臂”的目的:克服影響配基與生物大分子的結(jié)合的空間障礙?!敖颖邸钡耐緩剑撼S枚坊衔铮ǘ《?、乙二胺、己二胺)。目前帶有各種手臂的系列載體已有商品供應(yīng)。如:AH-Sepharose4B常用手臂5.操作:1)層析前:制備親和層析劑

選擇根據(jù)欲分離物質(zhì)特性配基

選擇根據(jù)配基分子大小及基團(tuán)特性載體2)洗脫:能削弱酶和親和吸附劑間的相互作用。包括:非專一性洗脫和專一性洗脫偶聯(lián)親和層析劑非專一性洗脫:改變溫度改變pH值改變離子強(qiáng)度專一性洗脫:

競(jìng)爭(zhēng)性洗脫劑(如抑制劑、底物類似物)被吸附物質(zhì)結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性地與配體結(jié)合6.應(yīng)用1)純化大分子物質(zhì)如:純化糖蛋白用凝集素(能可逆性地結(jié)合碳水化合物的蛋白質(zhì)),Lectin-Sepha

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