生物技術(shù)專業(yè)畢業(yè)論文報(bào)告

青島海域爆發(fā)滸苔的光合作用研究及分子鑒定

PhotosynthesisandmolecularidentificationoftheoutbreakoftheQingdaowatersEnteromorpha08生技三班趙許峰滸苔的根本性狀滸苔Enteromorphaprolifera屬于綠藻門、綠藻綱、石莼目、石莼科、滸苔屬,是一種常見大型海洋綠藻,藻體管狀,膜質(zhì),細(xì)胞單層,主枝明顯,分枝細(xì)長(zhǎng).幼體時(shí)期通過假根附著于固體基質(zhì)生長(zhǎng),廣泛地分布于潮間帶區(qū)砂礫、巖石、泥灘上,成體藻體和斷裂的成體藻體碎片可漂浮生長(zhǎng)。青島海域爆發(fā)滸苔的起源2023年黃海衛(wèi)星照片顯示證明綠潮起源于離青島海域180km的江蘇省海岸線。其主要原因是可能歸結(jié)于江蘇省沿岸的紫菜擴(kuò)大養(yǎng)殖。之前有研究說(shuō)明滸苔是紫菜養(yǎng)殖架上的主要污染海洋藻類，因此，在江蘇省沿岸的22974公頃的紫菜養(yǎng)殖海域中，紫菜養(yǎng)殖架為滸苔的生物量累計(jì)提供了“溫床〞。研究目的研究黃海滸苔爆發(fā)地區(qū)滸苔的光和作用，并對(duì)青島地區(qū)爆發(fā)滸苔進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。材料來(lái)源本實(shí)驗(yàn)所應(yīng)用的滸苔均采自青島海域以及由國(guó)家海洋局第一研究所實(shí)驗(yàn)中心提供。實(shí)驗(yàn)試劑蔗糖，可溶性淀粉，瓊脂糖，裂解緩沖液，變性緩沖液，異丙醇，70%的乙醇，去離子水，硫酸亞鐵，酒石酸鉀鈉，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鉀，水合茚三酮，氯化亞錫，苯酚，硫酸，無(wú)水乙醇，葡萄糖，0.45um微孔濾膜，甲酰胺，甲醇，冰醋酸。主要儀器722S型分光光度計(jì)，ZD2型自動(dòng)電位滴定儀，SHAC型水浴恒溫振蕩器，YXQS46280型高壓蒸汽滅菌器，GZX9146MBE型電熱恒溫鼓風(fēng)枯燥箱，高速離心機(jī)，顯微鏡，電子顯微鏡，U-3310紫外分光光度計(jì)，Niskin采水器，CTD，0．45uM濾膜，高效液相色譜儀1.滸苔的分子鑒定采樣站位與時(shí)間2023年7月9日至16目，研究人員跟隨“北斗〞號(hào)科學(xué)考察船對(duì)衛(wèi)星照片顯示具有大面積綠潮藻類出現(xiàn)的黃海海域(北緯33.5度至北緯36度，東經(jīng)120度至東經(jīng)122度)進(jìn)行調(diào)察，共采集到這一海域中22個(gè)站位的滸苔樣品，其中包括20個(gè)站位的飄浮滸苔以及2個(gè)站位(J13及J20-1)的拖網(wǎng)樣品。青島的漂浮滸苔樣品采自棧橋潮問帶滸苔的分子鑒定將滸苔用無(wú)菌水清洗3遍，用吸水紙吸干，利用天根植物全基因組提取試劑盒〔DP320〕提取全基因組DNA。設(shè)計(jì)IST擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)分別為T1〔5，-TCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3，〕與T2〔5，-TTCCTTTTGCTTATTGATATGC-3，〕，PCR反響體系為25uL，其中包括：10×PCRbuffer2.5uL，2.0mmol/LMgCl22.0uL，10mmol/LdNTPs0.5uL，10umol/L引物T1和T2各1uL，TaqDNA聚合酶〔Promega〕0.2uL，DNA模板1uL。反響條件為94℃變性1min，54℃退火1min，72℃延伸1min，循環(huán)30次；72℃繼續(xù)延伸10min，4℃保存。PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，將目的條帶回收純化之后，送北京六合華大基因科技持股測(cè)序。用于序列分析以及系統(tǒng)進(jìn)化分析的滸苔及石莼的ITS及5.8SrDNA序列從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載。用ClustalW軟件進(jìn)行多序列比對(duì)記憶序列相似性分析。用Phylip3.65軟件中最大簡(jiǎn)約法〔Maximumlikelihood〕和Mega4.0軟件中的鄰接法〔Neighbor-Joining〕構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)1000次計(jì)算Bootstrap值。2.青島海域漂浮和沉降滸苔的光合作用研究滸苔葉狀體由專人乘中國(guó)科學(xué)院海洋研究所“創(chuàng)新號(hào)〞考察船于綠潮爆發(fā)期間在海況允許的情況下間斷出海采集。本文選擇經(jīng)比較檢測(cè)說(shuō)明目前光合活性最高的2023年7月12日采集的青島奧帆基地A賽區(qū)南側(cè)海域(北緯36度,東經(jīng)120度24分)水表藻體以及采自團(tuán)島灣(北緯36度20分，東經(jīng)120度17分)泥表(圖5)藻體,作為水表漂浮藻體和泥底沉降藻體的代表。用毛筆輕輕洗凈藻體外表污泥和附生雜藻,并經(jīng)顯微鏡鏡檢確認(rèn)藻體無(wú)雜藻污染后待用。實(shí)驗(yàn)材料2.1葉綠素光譜特性及含量的測(cè)定取新鮮滸苔藻體，用濾紙輕輕吸干藻體外表水分，稱取0.5g藻體放入研缽中液氮研磨。藻體磨碎后加少許石英砂和5mL丙酮繼續(xù)研磨成勻漿狀，參加5mL80%丙酮抽提。10000×g室溫離心10min，棄沉淀，80%丙酮定容上清20mL。以80%丙酮作為空白對(duì)照，對(duì)樣品進(jìn)行350-800nm的波長(zhǎng)掃描，讀取663nm和645nm處的光密度值。重復(fù)3次以上，計(jì)算平均值

2.2葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定利用調(diào)制葉綠素?zé)晒饧夹g(shù)用IMAGING-PAMMicroscopy調(diào)制脈沖熒光儀通過葉綠素?zé)晒庹T導(dǎo)動(dòng)力學(xué)曲線和光響應(yīng)曲線測(cè)定了不同來(lái)源的滸苔葉狀體葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)。樣品暗適應(yīng)15min以弱調(diào)制測(cè)量光測(cè)定初始熒光；以強(qiáng)飽和脈沖激發(fā)后測(cè)量最大熒光，重復(fù)5次。樣品的快速光響應(yīng),同樣通過IMAGING-PAMMicroscopy調(diào)制脈沖熒光儀測(cè)定。將經(jīng)過光適應(yīng)5min的樣品，暴露在連續(xù)光強(qiáng)梯度(PAR3,26,46,65,102,146,195,259,337,418和497umolm-2s-1下，每步20s，測(cè)定相對(duì)電子傳遞速率ETR。2.3光合放氧速率測(cè)定樣品預(yù)處理：取0.06g新鮮(FW)樣品于20℃循環(huán)水浴中溫浴15min。氧電極Oxygraph(Hansatech)測(cè)定其光合放氧速率，反響介質(zhì)為20℃消毒海水，光照強(qiáng)度選擇預(yù)實(shí)驗(yàn)測(cè)定的滸苔葉狀體飽和光強(qiáng)600umolm-2s-1光合速率表示為每單位鮮重藻體的放氧速率以凈光合放氧速率與呼吸耗氧速率之比獲得P/R的值。2.4呼吸耗氧速率測(cè)定樣品預(yù)處理：取0.06g新鮮樣品于20℃恒溫水浴中溫浴15min,暗適應(yīng)20Min。呼吸耗氧速率通過氧電極Oxygraph測(cè)定，反響介質(zhì)為20℃消毒海水。呼吸速率表示為每單位鮮重藻體的耗氧速率。3.結(jié)果與討論3.1分子鑒定結(jié)果取自23個(gè)不同站位滸苔樣品的ITS序列以及5.8SrDNA序列的PCR片段總長(zhǎng)度為540bp，其中ITS1長(zhǎng)度為189bp，5.8SrDNA全序列長(zhǎng)度為160bp，ITS2長(zhǎng)度為181bp。從序列比對(duì)的結(jié)果內(nèi)差異〔圖6〕。將該序列與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載的石莼屬以及滸苔屬的ITS以及5.8SrDNA的序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與來(lái)自日本的一種滸苔屬滸苔〔Enteromorphaprolifera〕的ITS以及5.8SrDNA序列的相似性最高，僅在第5個(gè)堿基處缺失一個(gè)堿基A。系統(tǒng)進(jìn)化樹

為構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載了l4個(gè)滸苔屬及4個(gè)石莼屬的ITS和5.8SrDNA的全序列，并以狹帶藻的ITS和5．8SrDNA全序列作為外群。采用Mega4.0中的鄰接(NJ)法及Phylip3.65軟件中的最大簡(jiǎn)約法構(gòu)建了ITS及5.8SrDNA的系統(tǒng)進(jìn)化樹，兩棵進(jìn)化樹具有類似的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)，僅有Ulvapertusa的分枝不同，說(shuō)明了系統(tǒng)進(jìn)化樹的可靠性。文中給出的是NJ法構(gòu)建的ITS序列的系統(tǒng)樹，從該系統(tǒng)進(jìn)化樹可以看出，本次綠潮滸苔與滸苔屬滸苔(Enteromorphaprolifera)聚類在一起?；贜J法構(gòu)建的ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹3.2滸苔的光合作用研究結(jié)果

右圖為滸苔樣品提取色素的吸收光譜，葉綠素a的最大吸收波長(zhǎng)在436和663nm,葉綠素b的最大吸收波長(zhǎng)為463和645nm。如圖8所示，奧帆A賽區(qū)南部水表(a)和團(tuán)島灣泥表(b)滸苔提取的色素樣品具有相似的波形。由此可見，奧帆A賽區(qū)南部表層和團(tuán)島灣泥表滸苔具有相近的色素組成與比例。然而在色素含量方面卻截然不同：奧帆A賽區(qū)南部水表漂浮滸苔的色素含量明顯高于團(tuán)島灣泥表沉降滸苔。經(jīng)計(jì)算,水表藻體葉綠素a和葉綠素b含量都明顯比泥表藻體高,然而葉綠素a與葉綠素b的含量比卻非常接近1.色素吸收光譜2.葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)

從滸苔藻體的光響應(yīng)曲線(圖9)可以看出,奧帆A賽區(qū)南部表層藻體的光響應(yīng)曲線培養(yǎng)前后保持了比較穩(wěn)定的狀態(tài),除了光飽和點(diǎn)和ETR值培養(yǎng)前和培養(yǎng)后相比略有下降外,在培養(yǎng)前和培養(yǎng)后保持了比較穩(wěn)定的水平；而由圖9(a)可見團(tuán)島灣泥表藻體的光響應(yīng)在培養(yǎng)前就表現(xiàn)得比較微弱,在培養(yǎng)后那么完全失去了光響應(yīng)(圖9(b))。從圖10(a)可以看出,奧帆A賽區(qū)南部水表藻體的參數(shù)值Fv/Fm約為0.6，比團(tuán)島灣泥表的藻體高出了7倍多,奧帆A賽區(qū)南部水表藻體的參數(shù)Y(Ⅱ)更是比團(tuán)島灣泥表的藻體高出了15倍有余。而從參數(shù)Y(NPQ)和Y(NO)的值來(lái)看,團(tuán)島灣泥表的藻體都比奧帆A賽區(qū)南部水表藻體高出了1倍。培養(yǎng)24h后可以看出,對(duì)于奧帆A賽區(qū)南部水表的藻體來(lái)說(shuō),參數(shù)Fv/Fm出現(xiàn)了明顯的下降,從0.6左右下降到了0.5左右；參數(shù)Y(Ⅱ)稍有下降,而參數(shù)Y(NPQ)和Y(NO)都略有上升。對(duì)于團(tuán)島灣泥表的藻體,在培養(yǎng)24h后參數(shù)Fv/Fm,Y(Ⅱ)和Y(NPQ)降至0；與此同時(shí)Y(NO)上升到1(圖10(b))。3.光和放氧和呼吸從圖11(a)和11(c)來(lái)看，A賽區(qū)南部水表滸苔藻體的放氧速率、呼吸速率和P/R都顯著高于團(tuán)島灣泥表藻體，其中放氧速率高出約達(dá)26.6倍，呼吸高出約3.5倍，P/R高出約5倍；從圖11的比較中可以看出,在培養(yǎng)24h后團(tuán)島灣泥表藻體的放氧速率和P/R表現(xiàn)為負(fù)值，呼吸速率明顯升高；而A賽區(qū)南部水表滸苔藻體的放氧速率和P/R僅稍有降低，呼吸速率有略微升高。4結(jié)果分析4.1分子生物學(xué)鑒定結(jié)果分析

目前對(duì)于藻種的鑒定已經(jīng)越來(lái)越多的借助于分子生物學(xué)的方法。真核生物核糖體編碼基因中18SrDNA，5.8SrDNA和28SrDNA組成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位，彼此被轉(zhuǎn)錄單元內(nèi)間隔區(qū)ITS分開。ITS不屬于編碼區(qū)域，進(jìn)化速率比編碼區(qū)域快，即使是親緣關(guān)系十分接近的物種，在該區(qū)域也存在核酸差異，而且隨親緣關(guān)系的疏遠(yuǎn)差異會(huì)迅速擴(kuò)大。近年來(lái)，ITS序列在綠潮藻類及石莼屬藻種鑒定方面起了重要作用。本次黃海綠潮，從不同站位采到的滸苔樣品，形態(tài)觀察差異較大，不管是藻體的顏色、主枝的形態(tài)和厚度、以及絲狀體的形態(tài)和細(xì)胞的大小等均有明顯差異，難以確定是否屬于同一種滸苔。通過分子生物學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)所有這些滸苔樣品都具有完全一樣的ITS序列，從而確定造本錢次黃海滸苔綠潮的滸苔均同為一個(gè)種，聚類分析說(shuō)明是滸苔屬滸苔(Enteromorphaprolifera)4.2滸苔的光合作用研究結(jié)果分析這些結(jié)果說(shuō)明,雖然漂浮藻體光合活性較強(qiáng),但潛在光合活性明顯低于正常值,而泥表藻體的光合活性極弱,提示截至2023年7月中旬該海域的漂浮滸苔藻體已受到了較嚴(yán)重的環(huán)境脅迫,說(shuō)明青島海域自然環(huán)境已不適于滸苔的生長(zhǎng),該海域滸苔生物量