多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜基因特征及其對(duì)細(xì)菌致病力的影響

多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌生物被膜基因特征及其對(duì)細(xì)菌致病力的影響多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌是一種革蘭陰性桿菌,它是醫(yī)院感染的重要病原菌,常常會(huì)引起廣泛的院內(nèi)感染;其中最常見的是肺炎、下呼吸道感染、泌尿系統(tǒng)感染和腦膜炎。多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株的流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),其在院內(nèi)感染的感染率是逐年增加的。多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌在醫(yī)院環(huán)境中分布廣泛,并且可以長(zhǎng)期存活,這對(duì)于住院患者來(lái)說尤其是危重癥患者的威脅很大。多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌,還常常會(huì)引起院內(nèi)感染的大爆發(fā),尤其是在各家醫(yī)院的重癥監(jiān)護(hù)室;這已經(jīng)引起了臨床醫(yī)生的高度警惕和廣泛關(guān)注。迅速崛起的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌導(dǎo)致了臨床治療手段的匱乏。多重耐藥致病菌株對(duì)于目前臨床應(yīng)用的多種類型的抗菌藥物中,至少有三類或三類以上都是耐藥的。最初,多重耐藥致病菌株的感染僅僅局限于院內(nèi)感染,但是目前多重耐藥的病原菌常常長(zhǎng)期定植在易受攻擊的患者(包括存在基礎(chǔ)疾病的患者、免疫力低下的患者等)體內(nèi);更為嚴(yán)峻的是,這些多重耐藥致病菌株出現(xiàn)了社區(qū)流行;鮑曼不動(dòng)桿菌最近已被列入六大最危險(xiǎn)的機(jī)會(huì)致病菌之一。鮑曼不動(dòng)桿菌可以在多種不利的環(huán)境中長(zhǎng)期存活,包括不利的外環(huán)境和內(nèi)環(huán)境下宿主的免疫攻擊;這主要是由于細(xì)菌生物被膜的形成;這也是鮑曼不動(dòng)桿菌在人體組織慢性定植以及在醫(yī)療器械表面持續(xù)存在的重要條件。在傳統(tǒng)意義上,人們常常認(rèn)為細(xì)菌的生物被膜是一團(tuán)細(xì)菌的組合、堆疊,是細(xì)菌的菌落不可逆的粘附在醫(yī)療器械或者生物體的表面;近期,一些學(xué)者通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析以及基因轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究發(fā)現(xiàn),細(xì)菌生物被膜不單單只是浮游細(xì)菌的簡(jiǎn)單混合物,而是一種特殊的生長(zhǎng)時(shí)期或者狀態(tài);不同于浮游細(xì)菌狀態(tài),它們有著自己獨(dú)特的蛋白質(zhì)表型和基因表達(dá)。多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌形成生物被膜的能力已經(jīng)成為評(píng)估其致病力的主要因素之一。細(xì)菌的生物被膜,是由多個(gè)菌落聚合形成的動(dòng)態(tài)穩(wěn)定整體;是多個(gè)相互關(guān)聯(lián)的菌落包埋入大量細(xì)胞外基質(zhì)中(包括細(xì)胞外多糖、細(xì)胞外遺傳物質(zhì)、蛋白質(zhì)和脂類)所組成。細(xì)菌的慢性定植、難以清除、引起慢性感染和感染反復(fù)發(fā)生,都依賴于菌體生物被膜的生成和維持。細(xì)菌菌體在生物被膜的持續(xù)保護(hù)下,可以長(zhǎng)期生存,具有更強(qiáng)的耐藥性和致病力;這是目前臨床治療亟待解決的難題。我們認(rèn)為,細(xì)菌生物被膜的形成和形態(tài)的維持是通過特殊的通路以及信號(hào)因子、轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)節(jié)的。因此,通過本試驗(yàn)的研究,我們探討,細(xì)菌處于生物被膜狀態(tài)下,對(duì)細(xì)菌菌體致病力及耐藥性的變化和影響;應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究細(xì)菌菌體生物被膜的基因獨(dú)特表達(dá),探尋生物被膜生成和形態(tài)維持的基因表達(dá)變化。第一部分多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌感染趨勢(shì)研究目的:多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌常常引起廣泛的院內(nèi)感染。多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn),其在院內(nèi)的感染率是逐年增加的。我們研究多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌的感染趨勢(shì),提取菌株遺傳物質(zhì)進(jìn)行亞型分析,分析菌株亞型的感染趨勢(shì)特點(diǎn),制備不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株模型。方法:1多重耐藥菌株病原菌感染趨勢(shì)調(diào)查研究,調(diào)查我院2011-2015年間,多重耐藥菌株的感染學(xué)趨勢(shì)。2篩選我院2011-2015年間多重耐藥菌株中的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株進(jìn)行研究。篩選多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌,進(jìn)行重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)分型,分析多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌不同亞型的感染趨勢(shì)。3選取多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌優(yōu)勢(shì)菌株,制備優(yōu)勢(shì)菌株不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的樣本,包括快速生長(zhǎng)期和生物被膜固著期的菌株樣本,以進(jìn)行進(jìn)一步的研究。結(jié)果:1多重耐藥病原菌的感染趨勢(shì)調(diào)查發(fā)現(xiàn),檢出多重耐藥菌株以及其中多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌分別呈逐年遞增趨勢(shì),增長(zhǎng)速率分別為1.1067和1.2287。2選取2015年一年時(shí)間內(nèi),我院篩選的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌608例,提取全部已經(jīng)收集的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株遺傳物質(zhì),進(jìn)行重復(fù)序列聚合酶鏈反應(yīng)分型,總共分為7個(gè)亞型。其中,第5類亞型菌株數(shù)量最多,視為優(yōu)勢(shì)菌株,以其作為研究對(duì)象,進(jìn)行后續(xù)進(jìn)一步研究。3觀察優(yōu)勢(shì)多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌野生菌株生物被膜的生長(zhǎng)情況。結(jié)論:多重耐藥病原菌感染趨勢(shì)調(diào)查研究發(fā)現(xiàn),檢出的多重耐藥菌株以及其中多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌分別呈逐年遞增趨勢(shì)。多重耐藥菌株的感染越來(lái)越多,敏感的可以治療的抗菌藥物越來(lái)越少,成為臨床亟待解決的難題。第二部分多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌高通量測(cè)序分析生物被膜狀態(tài)的基因表達(dá)變化目的:生物被膜不只是細(xì)菌簡(jiǎn)單黏附的混合物,而是另一種特殊的生長(zhǎng)狀態(tài);與浮游狀態(tài)下細(xì)菌相比,它們有著自己獨(dú)特的蛋白質(zhì)表型和基因表達(dá)。我們比較研究同一菌株,在不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的基因表達(dá)分析對(duì)比,比較同一菌株在不同生長(zhǎng)狀態(tài)下基因表達(dá)差異,揭示多重耐藥菌株在生物被膜階段獨(dú)特的基因表達(dá),探討生物被膜生成和形態(tài)維持的相應(yīng)的基因表達(dá)變化。方法:1提取研究?jī)?yōu)勢(shì)鮑曼不動(dòng)桿菌菌株,快速生長(zhǎng)期及生物被膜固著期的遺傳物質(zhì),對(duì)其進(jìn)行質(zhì)和量的檢測(cè)。2分別對(duì)研究菌株的快速生長(zhǎng)期及生物被膜固著期兩個(gè)狀態(tài),進(jìn)行遺傳物質(zhì)高通量測(cè)序分析,研究基因表達(dá)。3將研究菌株兩種不同生長(zhǎng)狀態(tài)下(快速生長(zhǎng)期和生物被膜固著期)的檢測(cè)基因序列,與公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),進(jìn)行基因功能注釋。4研究同一菌株不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的基因序列表達(dá),進(jìn)行基因表達(dá)差異的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比對(duì)。結(jié)果:1對(duì)比不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的同一菌株,快速生長(zhǎng)期和生物被膜固著期的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌,研究菌株的基因表達(dá)差異。研究數(shù)據(jù)表明,篩選研究的多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株中,第5類亞型菌株數(shù)量最多,也就是AcinetobacterbaumanniiBJAB0868分布最多,視為優(yōu)勢(shì)菌株,作為研究對(duì)象進(jìn)行進(jìn)一步的研究。2分析多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌菌株不同生長(zhǎng)時(shí)期的基因表達(dá)發(fā)現(xiàn),兩個(gè)樣本共同表達(dá)最多的基因,主要為氨基酸的運(yùn)輸和代謝相關(guān)基因,能量的生成和轉(zhuǎn)換相關(guān)基因,無(wú)機(jī)離子的運(yùn)輸和代謝的相關(guān)基因,碳水化合物的運(yùn)輸和代謝的相關(guān)基因,酶的運(yùn)輸和代謝的相關(guān)基因,菌體細(xì)胞壁生成的相關(guān)基因等維持微生物體生命活動(dòng)所必須的、維持合成菌體細(xì)胞結(jié)構(gòu)所必須的、維持菌體生命活動(dòng)正常運(yùn)轉(zhuǎn)所必須的基因。3比較研究多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌優(yōu)勢(shì)菌株AcinetobacterbaumanniiBJAB0868不同生長(zhǎng)時(shí)期的兩個(gè)樣本,進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組高通量測(cè)序分析,比對(duì)兩個(gè)樣本基因序列的表達(dá)發(fā)現(xiàn),兩種狀態(tài)下菌株的基因表達(dá),確實(shí)存在顯著差異。相對(duì)于快速生長(zhǎng)期,生物被膜狀態(tài)的菌體有106個(gè)基因出現(xiàn)了表達(dá)上調(diào),92個(gè)基因出現(xiàn)了表達(dá)下調(diào)。在表達(dá)上調(diào)的106個(gè)基因中,有53個(gè)基因的表達(dá)在細(xì)菌生物被膜狀態(tài)是顯著升高的,但在浮游細(xì)菌快速生長(zhǎng)期狀態(tài)下,表達(dá)是極少的甚至是完全被抑制表達(dá)的。高通量測(cè)序基因表達(dá),比對(duì)公共數(shù)據(jù)庫(kù),進(jìn)行基因功能注釋,我們發(fā)現(xiàn),這53個(gè)表達(dá)顯著差異的基因,可能部分參與細(xì)菌生物被膜生成和形態(tài)維持。結(jié)論:我們將多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌優(yōu)勢(shì)菌株AcinetobacterbaumanniiBJAB0868不同生長(zhǎng)狀態(tài)下的兩個(gè)樣本,進(jìn)行了高通量測(cè)序基因表達(dá)的比對(duì)分析,比較基因的表達(dá)差異。通過系統(tǒng)的基因表達(dá)的比較和統(tǒng)計(jì)學(xué)分析比對(duì),發(fā)現(xiàn)二者之間存在著基因表達(dá)的差異。細(xì)菌生物被膜確實(shí)是細(xì)菌的另外一種獨(dú)特的存在形式,具有其自身獨(dú)特的基因表達(dá)特點(diǎn)。表達(dá)差異的基因,部分基因與細(xì)菌生物被膜的生成和形態(tài)維持相關(guān)。通過與公共數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì),進(jìn)行表達(dá)差異基因的功能注釋分析,我們發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異的基因,還可能參與導(dǎo)致了細(xì)菌致病力和耐藥力的增加的調(diào)節(jié)。第三部分多重耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌基因敲除研究菌株生物被膜狀態(tài)對(duì)其致病力影響目的:生物被膜狀態(tài)下的細(xì)菌,有著自己獨(dú)特的基因表達(dá),部分表達(dá)顯著差異的基因,在浮游細(xì)菌狀態(tài)下基因的表達(dá)是被抑制的。選取其中表達(dá)差異的目標(biāo)基因TetRfamilytransctiptionalregulator,在本試驗(yàn)前期研究中發(fā)現(xiàn),在細(xì)菌生物被膜狀態(tài)下,該目標(biāo)基因表達(dá)是明顯升高的;而在細(xì)菌快速生長(zhǎng)期浮游狀態(tài)下,該基因的表達(dá)卻是被抑制的。我們認(rèn)為它可能參與了生物被膜的生成和形態(tài)維持過程。選取該基因作為目標(biāo)基因,進(jìn)行基因敲除,構(gòu)建突變菌株,研究在該基因缺失的情況下,是否對(duì)細(xì)菌生物被膜的生成和形態(tài)維持,造成顯著影響。進(jìn)而,進(jìn)一步探討細(xì)菌在生物被膜生成能力缺失或不健全的情況下,與野生菌株相對(duì)比,造成大鼠肺部急性感染及慢性感染的致病力如何變化,分析生物被膜生成對(duì)細(xì)菌致病力的影響。方法:1將AcinetobacterbaumanniiBJAB0868菌株,不同時(shí)期表達(dá)顯著差異基因TetRfamilytransctiptionalregulator,進(jìn)行基因表達(dá)的測(cè)定,再次驗(yàn)證其是否存在表達(dá)差異。2對(duì)研究對(duì)象,多重耐藥的鮑曼不動(dòng)桿菌AcinetobacterbaumanniiBJAB0868,進(jìn)行目標(biāo)基因TetRfamilytransctiptionalregulator的敲除。在研究菌株的基因組上擴(kuò)增目標(biāo)基因的上、下游同源重組手臂。通過融合PCR技術(shù)連接獲得基因敲除用的打靶片段。將其克隆入自殺載體pUC19,獲得pUC19/TetR質(zhì)粒。提取質(zhì)粒,采用反向PCR技術(shù)從pUC19/TetR質(zhì)粒上,刪除目標(biāo)基因序列,擴(kuò)增序列經(jīng)酶切,連接獲得pUC19-ΔTetR目標(biāo)基因質(zhì)粒。在此質(zhì)粒的上下游打靶手臂連接位點(diǎn)處插入來(lái)自于pKD4質(zhì)粒的kan抗性基因,獲得pUC19-ΔTetR::Kan質(zhì)粒。將打靶片段(上游同源手臂-抗性基因-下游同源手臂)從pUC19-ΔTetR::Kan質(zhì)粒上切下,亞克隆入pCVD442自殺質(zhì)粒,獲得打靶質(zhì)粒pCVD442-ΔTetR::Kan。通過電轉(zhuǎn)化,將打靶質(zhì)粒pCVD442-ΔTetR::Kan轉(zhuǎn)入大腸桿菌E.coliβ21552,獲得供體菌β21552/pCVD442-ΔTetR::Kan。打靶片段(融合PCR產(chǎn)物)經(jīng)供體菌β21552/pCVD442-ΔTetR::Kan與受體菌AcinetobacterbaumanniiBJAB0868進(jìn)行接合試驗(yàn),在無(wú)菌LB平板上篩選獲得抗性的BJAB0868菌株克隆,稱為BJAB0868/pCVD442-ΔTetR。在LB平板上,劃線接種BJAB0868/pCVD442-ΔTetR,培養(yǎng)至單個(gè)菌落形成,通過PCR技術(shù)篩選獲得TetR基因被刪除的克隆,局部序列經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證成功,命名為BJAB0868/ΔTetR。3LB平板篩選轉(zhuǎn)化突變的克隆,經(jīng)過PCR試驗(yàn)及基因測(cè)序證實(shí),此突變菌株可以穩(wěn)定遺傳相關(guān)基因。4突變菌株BJAB0868/ΔTetR,研究和評(píng)估其生成生物被膜的能力和對(duì)各類抗菌藥物的耐藥性。5動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究野生菌株及突變菌株對(duì)大鼠急性肺部感染及慢性肺部感染的致病力影響,進(jìn)而評(píng)估細(xì)菌在生物被膜生成能力缺失或不健全的情況下,造成大鼠急性感染及慢性感染的致病力如何變化。結(jié)果:1對(duì)目標(biāo)基因TetRfamilytransctiptionalregulator,再次進(jìn)行基因表達(dá)濃度的測(cè)定,發(fā)現(xiàn)在生物被膜狀態(tài)下該基因的表達(dá)是顯著升高的,與浮游菌狀態(tài)相比,存在顯著差異。2目標(biāo)基因敲除,構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的突變菌株BJAB0868/ΔTetR。研究發(fā)現(xiàn)突變菌株,生成生物被膜能力明顯降低。電鏡觀察發(fā)現(xiàn),突變菌株生成的生物被膜不完整,厚度變薄,面積也明顯變小。3突變菌株BJAB0868/ΔTetR的耐藥性并沒有明顯變化,在敲除目標(biāo)基因后,突變菌株耐各類抗菌藥物的能力并沒有受到顯著影響。4動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究野生菌株及突變菌株的致病力引起大鼠急性肺部感染及慢性肺部感染的比較研究,肺部灌洗液細(xì)菌定量培養(yǎng)表明,感染突變菌株BJAB0868/ΔTetR組定量培養(yǎng)菌株數(shù)量明顯低于感染野生菌株組。大鼠肺部感染病理切片研究顯示,感染突變菌株BJAB0868/ΔTetR組肺部炎癥明顯輕于感染野生菌株組。結(jié)論:目標(biāo)基因TetRfamilytransctiptionalregulator,在細(xì)菌生物被膜狀態(tài)下,表達(dá)顯著升高,它確實(shí)參與了生物被膜的生成和形態(tài)維持過程。我們將目標(biāo)基因敲除,構(gòu)建