丙泊酚對炎癥因子水平及炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)表達的影響

丙泊酚對炎癥因子水平及炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)表達的影響丙泊酚是一種快效、短效靜脈麻醉藥。由于其具有蘇醒迅速而完全,持續(xù)輸注后無蓄積等特點,因此目前普遍應(yīng)用于麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持,也常用于麻醉中、手術(shù)后與ICU病房的鎮(zhèn)靜。除了其常規(guī)的催眠、鎮(zhèn)靜等麻醉效能以外,在非麻醉效能方面,最受人們關(guān)注的就是丙泊酚的抗炎,保護效應(yīng)。我們在前期研究發(fā)現(xiàn)丙泊酚具有抗炎作用的基礎(chǔ)上設(shè)計了本課題。第一章丙泊酚對內(nèi)毒素致離體大鼠腸上皮細胞損傷及炎癥細胞因子的影響目的：對比丙泊酚與烏司他丁對LPS誘導(dǎo)離體大鼠腸上皮細胞炎癥細胞因子水平的影響以探討丙泊酚抗炎作用的強度。方法：復(fù)蘇IEC-6細胞,加DMEM高糖培養(yǎng)基(內(nèi)含2mML-glutamine)、15mMHEPES10%胎牛血清,1OOU/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素,傳代2次,觀察細胞形態(tài)與ACCA細胞庫提供細胞形態(tài)相同,可以用于細胞實驗。將細胞分為①內(nèi)毒素組(L組)、②內(nèi)毒素+丙泊酚組(L+P組)、③內(nèi)毒素+烏司他丁(L+U組)、④空白對照組(C組)、⑤丙泊酚對照組(P組)、⑥烏司他丁對照組(U組).將細胞隨機分組后分別給予相應(yīng)干預(yù)措施后采用MTT實驗評價各組細胞相對活力。應(yīng)用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)液炎癥細胞因子濃度。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差(X±s)表示,所有計量資料間比較滿足方差齊性,采用單因素方差分析(One-WayANOVA),多重比較采用LSD(Least-significantdifferencetest)法,方差不齊則采用Welch法,多重比較采用DunnettsT3檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果：L組細胞OD值顯著低于對照組(P<0.001)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.367)；而L+U組與L組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.260)；L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。各組細胞培養(yǎng)上清液中IL-1p、IL-6、TNF-α檢測結(jié)果如下：IL-1p檢測值統(tǒng)計結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.50),P組與U組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.834)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。IL-6檢測值統(tǒng)計結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.425),P組與U組比較差異無統(tǒng)計學意義(P--0.742)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。TNF-a檢測值統(tǒng)計結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.120),P組與U組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.681)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結(jié)論：在離體細胞實驗中,丙泊酚能夠抑制內(nèi)毒素刺激引起的IL-1p、IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放,具有明顯的抑制內(nèi)毒素刺激引起的炎癥反應(yīng)作用,且其抑制作用較明顯。第二章丙泊酚對內(nèi)毒素血癥大鼠單個核細胞AnnexinAl和p38磷酸化蛋白表達的影響目的：建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型,用以進行動物實驗,進一步觀察丙泊酚抗炎作用的在體效應(yīng),并且進而觀察丙泊酚對單個核細胞炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)表達的影響。方法：將36只SD大鼠隨機分為對照組(C組)、內(nèi)毒素組(L組)、丙泊酚組(P組)、內(nèi)毒素+丙泊酚組(L+P組)、烏司他丁組(U組)和內(nèi)毒素組+烏司他丁組(L+U組),每組6只。建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型后各組分別給予干預(yù)后收集大鼠血標本應(yīng)用ELISA法檢測IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細胞因子。將18只SD大鼠隨機分為對照組(C1組)、內(nèi)毒素組(L1組)、丙泊酚組(P1組)、內(nèi)毒素+丙泊酚組(L1+P1組)、脂肪乳組(I組)和內(nèi)毒素組+脂肪乳組(L+I組),每組3只。建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型后各組分別給予干預(yù)后收集大鼠血標本應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測單個核細胞AnnexinA1和p38磷酸化蛋白水平。結(jié)果：IL-1p檢測值統(tǒng)計結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.0.860),P組與U組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.930)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。IL-6檢測值統(tǒng)計結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.50),P組與U組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.797)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。TNF-a檢測值統(tǒng)計結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.75),P組與U組比較差異無統(tǒng)計學意義(P=0.915)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。Westernblot檢測,結(jié)果顯示AnnexinA1在LPS組表達量最低,而在對照組丙泊酚組表達量相當,而在LPS+丙泊酚組表達量顯著增加。提示在內(nèi)毒素刺激下,丙泊酚能促進炎癥調(diào)控蛋白AnnexinA1的表達。在內(nèi)毒素大鼠血癥中,我們發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以明顯增加AnnexinA1,作為p38MAPK的內(nèi)源性的抑制因子,AnnexinA1表達量增加可能導(dǎo)致p38MAPK活性降低以及抑制炎性因子IL-1p、TNF-a和IL-6的產(chǎn)生,盡管我們在此實驗中不能直接得出結(jié)論：丙泊酚對抑制p38MAPK的激活時通過AnnexinA1表達的上調(diào)實現(xiàn)的,但是在LPS+丙泊酚組,內(nèi)毒素血癥大鼠單核細胞中,丙泊酚誘導(dǎo)的AnnexinA1表達的上調(diào)一定在抑制p38MAPK的激活中起了關(guān)鍵的作用。結(jié)論：丙泊酚能夠抑制內(nèi)毒素血癥大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放。丙泊酚這種抑制炎癥反應(yīng)作用的可能機制是它能夠促進單個核細胞中AnnexinA1的表達,以及抑制p38的磷酸化,進而抑制炎癥因子IL-1、IL-6、以及TNF-α的釋放。第三章丙泊酚對抑制THP-1細胞中AnnexinA1后內(nèi)毒素刺激下p38磷酸化表達的影響目的：采用體外RNAi技術(shù),抑制AnnexinA1在THP-1細胞中的表達,觀察丙泊酚是否還能夠抑制p38的磷酸化,從而驗證丙泊酚抑制炎癥反應(yīng)的具體機制。方法：復(fù)蘇THP-1細胞,加IPMI1640細胞培養(yǎng)基,15mMHEPES10%胎牛血清,1OOU/ml青霉素,1OOμg/ml鏈霉素,傳代2次,觀察細胞形態(tài)與ACCA細胞庫提供細胞形態(tài)相同,可以用于細胞實驗。將AnnexinA1shRNA瞬時轉(zhuǎn)染進THP-1細胞：我們從GenePharmaRNAi公司定制合成了AnnexinA1的shRNA,序列為5’-CCCUGGAUGAAACACUUAATT-3’;5’-GCAGGAAUAUGUUCAAACUTT-3’;5’-GCCUUGCAUAAGGCCAUAATT-3’.采用電穿孔的方法,將shRNA以及陰性對照轉(zhuǎn)入THP-1細胞中。電穿孔條件為(1500V,20ms,2N)。放電后將細胞移入10%胎牛血清置細胞孵箱以37℃、5%C02條件培養(yǎng)24h。分別將細胞隨機分為①野生型AnnexinA1內(nèi)毒素組(L組)、②野生型AnnexinA1內(nèi)毒素+丙泊酚組(L+P組)、③轉(zhuǎn)染shRNA型AnnexinA1內(nèi)毒素組(L’組)、④轉(zhuǎn)染shRNA型AnnexinA1內(nèi)毒素+丙泊酚組(L’+P’組)。給予相應(yīng)干預(yù)后,應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測單個核細胞AnnexinA1和p38磷酸化蛋白水平。結(jié)果：通過RNA干擾技術(shù)抑制了THP-1細胞AnnexinA1表達以后,也就是給予丙泊酚干預(yù)后其促進THP-1細胞表達AnnexinA1作用被阻斷,此時在LPS刺激下的THP-1細胞p38磷酸化不再因丙泊酚的作用而受到抑制。結(jié)論：丙泊酚的抗炎作用是在其上調(diào)了AnnexinA1表達,進而抑制p38磷酸化而完成的。也就是說AnnexinA1是丙泊酚抗炎作用機制的重要分子信號。第四章丙泊酚對肝癌切除術(shù)患者炎癥細胞因子的影響目的：對比觀察丙泊酚與烏司他丁對圍手術(shù)期患者炎癥細胞因子的影響方法：選擇診斷為原發(fā)性肝癌擬于全身麻醉下行肝癌切除術(shù)患者24例,采用完全隨機數(shù)字法將24例患者隨機分為3組(n=8)：空白對照組(C組),丙泊酚組(P組),烏司他丁組(U組)。干預(yù)措施為C組以0.5ml/kg/h速度持續(xù)靜脈輸注生理鹽水至手術(shù)結(jié)束,P組以Marsh模型2.0mg/ml血漿靶濃度靶控輸注丙泊酚至手術(shù)結(jié)束,U組靜脈持續(xù)輸注烏司他丁10000U/kg。采集各時點血清樣本,ELISA法檢測細胞因子。結(jié)果：IL-10檢測結(jié)果分組與時間兩因素交互效應(yīng)不顯著(F--1.539,P=0.222)；時間因素主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學意義(F=9.455,P<0.01),術(shù)前與其它各時點均有顯著性差異(P<0.05)；分組因素主效應(yīng)有統(tǒng)計學意義(F=4.017,P=0.033),P組與C組有顯著性差異(P<0.05),U組與C組有顯著性差異(P<0.05),在術(shù)畢時點,IL-10水平P組與C組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.003)。IL-6檢測結(jié)果分組與時間兩因素交互效應(yīng)不顯著(F＝0.622,P=0.636)。時間因素主效應(yīng)差異有統(tǒng)計學意義(F=27.544,P<0.001),各時間點均有顯著性差異(P<0.05)；分組因素主效應(yīng)差異不顯著(F=0.166,P=0.848)。TNF