丙泊酚對(duì)炎癥因子水平及炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響

丙泊酚對(duì)炎癥因子水平及炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響丙泊酚是一種快效、短效靜脈麻醉藥。由于其具有蘇醒迅速而完全,持續(xù)輸注后無(wú)蓄積等特點(diǎn),因此目前普遍應(yīng)用于麻醉誘導(dǎo)、麻醉維持,也常用于麻醉中、手術(shù)后與ICU病房的鎮(zhèn)靜。除了其常規(guī)的催眠、鎮(zhèn)靜等麻醉效能以外,在非麻醉效能方面,最受人們關(guān)注的就是丙泊酚的抗炎,保護(hù)效應(yīng)。我們?cè)谇捌谘芯堪l(fā)現(xiàn)丙泊酚具有抗炎作用的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)了本課題。第一章丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素致離體大鼠腸上皮細(xì)胞損傷及炎癥細(xì)胞因子的影響目的：對(duì)比丙泊酚與烏司他丁對(duì)LPS誘導(dǎo)離體大鼠腸上皮細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子水平的影響以探討丙泊酚抗炎作用的強(qiáng)度。方法：復(fù)蘇IEC-6細(xì)胞,加DMEM高糖培養(yǎng)基(內(nèi)含2mML-glutamine)、15mMHEPES10%胎牛血清,1OOU/ml青霉素,100μg/ml鏈霉素,傳代2次,觀察細(xì)胞形態(tài)與ACCA細(xì)胞庫(kù)提供細(xì)胞形態(tài)相同,可以用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將細(xì)胞分為①內(nèi)毒素組(L組)、②內(nèi)毒素+丙泊酚組(L+P組)、③內(nèi)毒素+烏司他丁(L+U組)、④空白對(duì)照組(C組)、⑤丙泊酚對(duì)照組(P組)、⑥烏司他丁對(duì)照組(U組).將細(xì)胞隨機(jī)分組后分別給予相應(yīng)干預(yù)措施后采用MTT實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)各組細(xì)胞相對(duì)活力。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液炎癥細(xì)胞因子濃度。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,所有計(jì)量資料間比較滿足方差齊性,采用單因素方差分析(One-WayANOVA),多重比較采用LSD(Least-significantdifferencetest)法,方差不齊則采用Welch法,多重比較采用DunnettsT3檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果：L組細(xì)胞OD值顯著低于對(duì)照組(P<0.001)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.367)；而L+U組與L組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.260)；L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1p、IL-6、TNF-α檢測(cè)結(jié)果如下：IL-1p檢測(cè)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.50),P組與U組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.834)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。IL-6檢測(cè)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.425),P組與U組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P--0.742)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。TNF-a檢測(cè)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.120),P組與U組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.681)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論：在離體細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中,丙泊酚能夠抑制內(nèi)毒素刺激引起的IL-1p、IL-6、TNF-α等炎癥因子釋放,具有明顯的抑制內(nèi)毒素刺激引起的炎癥反應(yīng)作用,且其抑制作用較明顯。第二章丙泊酚對(duì)內(nèi)毒素血癥大鼠單個(gè)核細(xì)胞AnnexinAl和p38磷酸化蛋白表達(dá)的影響目的：建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型,用以進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),進(jìn)一步觀察丙泊酚抗炎作用的在體效應(yīng),并且進(jìn)而觀察丙泊酚對(duì)單個(gè)核細(xì)胞炎癥相關(guān)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。方法：將36只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C組)、內(nèi)毒素組(L組)、丙泊酚組(P組)、內(nèi)毒素+丙泊酚組(L+P組)、烏司他丁組(U組)和內(nèi)毒素組+烏司他丁組(L+U組),每組6只。建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型后各組分別給予干預(yù)后收集大鼠血標(biāo)本應(yīng)用ELISA法檢測(cè)IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥細(xì)胞因子。將18只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組(C1組)、內(nèi)毒素組(L1組)、丙泊酚組(P1組)、內(nèi)毒素+丙泊酚組(L1+P1組)、脂肪乳組(I組)和內(nèi)毒素組+脂肪乳組(L+I組),每組3只。建立內(nèi)毒素血癥大鼠模型后各組分別給予干預(yù)后收集大鼠血標(biāo)本應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞AnnexinA1和p38磷酸化蛋白水平。結(jié)果：IL-1p檢測(cè)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.0.860),P組與U組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.930)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。IL-6檢測(cè)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.50),P組與U組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.797)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。TNF-a檢測(cè)值統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示L組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),P組、U組與C組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.75),P組與U組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.915)；L+P組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+U組與L組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001),L+P組與L+U組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。Westernblot檢測(cè),結(jié)果顯示AnnexinA1在LPS組表達(dá)量最低,而在對(duì)照組丙泊酚組表達(dá)量相當(dāng),而在LPS+丙泊酚組表達(dá)量顯著增加。提示在內(nèi)毒素刺激下,丙泊酚能促進(jìn)炎癥調(diào)控蛋白AnnexinA1的表達(dá)。在內(nèi)毒素大鼠血癥中,我們發(fā)現(xiàn)丙泊酚可以明顯增加AnnexinA1,作為p38MAPK的內(nèi)源性的抑制因子,AnnexinA1表達(dá)量增加可能導(dǎo)致p38MAPK活性降低以及抑制炎性因子IL-1p、TNF-a和IL-6的產(chǎn)生,盡管我們?cè)诖藢?shí)驗(yàn)中不能直接得出結(jié)論：丙泊酚對(duì)抑制p38MAPK的激活時(shí)通過(guò)AnnexinA1表達(dá)的上調(diào)實(shí)現(xiàn)的,但是在LPS+丙泊酚組,內(nèi)毒素血癥大鼠單核細(xì)胞中,丙泊酚誘導(dǎo)的AnnexinA1表達(dá)的上調(diào)一定在抑制p38MAPK的激活中起了關(guān)鍵的作用。結(jié)論：丙泊酚能夠抑制內(nèi)毒素血癥大鼠IL-1β、IL-6、TNF-α等炎癥因子的釋放。丙泊酚這種抑制炎癥反應(yīng)作用的可能機(jī)制是它能夠促進(jìn)單個(gè)核細(xì)胞中AnnexinA1的表達(dá),以及抑制p38的磷酸化,進(jìn)而抑制炎癥因子IL-1、IL-6、以及TNF-α的釋放。第三章丙泊酚對(duì)抑制THP-1細(xì)胞中AnnexinA1后內(nèi)毒素刺激下p38磷酸化表達(dá)的影響目的：采用體外RNAi技術(shù),抑制AnnexinA1在THP-1細(xì)胞中的表達(dá),觀察丙泊酚是否還能夠抑制p38的磷酸化,從而驗(yàn)證丙泊酚抑制炎癥反應(yīng)的具體機(jī)制。方法：復(fù)蘇THP-1細(xì)胞,加IPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基,15mMHEPES10%胎牛血清,1OOU/ml青霉素,1OOμg/ml鏈霉素,傳代2次,觀察細(xì)胞形態(tài)與ACCA細(xì)胞庫(kù)提供細(xì)胞形態(tài)相同,可以用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。將AnnexinA1shRNA瞬時(shí)轉(zhuǎn)染進(jìn)THP-1細(xì)胞：我們從GenePharmaRNAi公司定制合成了AnnexinA1的shRNA,序列為5’-CCCUGGAUGAAACACUUAATT-3’;5’-GCAGGAAUAUGUUCAAACUTT-3’;5’-GCCUUGCAUAAGGCCAUAATT-3’.采用電穿孔的方法,將shRNA以及陰性對(duì)照轉(zhuǎn)入THP-1細(xì)胞中。電穿孔條件為(1500V,20ms,2N)。放電后將細(xì)胞移入10%胎牛血清置細(xì)胞孵箱以37℃、5%C02條件培養(yǎng)24h。分別將細(xì)胞隨機(jī)分為①野生型AnnexinA1內(nèi)毒素組(L組)、②野生型AnnexinA1內(nèi)毒素+丙泊酚組(L+P組)、③轉(zhuǎn)染shRNA型AnnexinA1內(nèi)毒素組(L’組)、④轉(zhuǎn)染shRNA型AnnexinA1內(nèi)毒素+丙泊酚組(L’+P’組)。給予相應(yīng)干預(yù)后,應(yīng)用Westernblot技術(shù)檢測(cè)單個(gè)核細(xì)胞AnnexinA1和p38磷酸化蛋白水平。結(jié)果：通過(guò)RNA干擾技術(shù)抑制了THP-1細(xì)胞AnnexinA1表達(dá)以后,也就是給予丙泊酚干預(yù)后其促進(jìn)THP-1細(xì)胞表達(dá)AnnexinA1作用被阻斷,此時(shí)在LPS刺激下的THP-1細(xì)胞p38磷酸化不再因丙泊酚的作用而受到抑制。結(jié)論：丙泊酚的抗炎作用是在其上調(diào)了AnnexinA1表達(dá),進(jìn)而抑制p38磷酸化而完成的。也就是說(shuō)AnnexinA1是丙泊酚抗炎作用機(jī)制的重要分子信號(hào)。第四章丙泊酚對(duì)肝癌切除術(shù)患者炎癥細(xì)胞因子的影響目的：對(duì)比觀察丙泊酚與烏司他丁對(duì)圍手術(shù)期患者炎癥細(xì)胞因子的影響方法：選擇診斷為原發(fā)性肝癌擬于全身麻醉下行肝癌切除術(shù)患者24例,采用完全隨機(jī)數(shù)字法將24例患者隨機(jī)分為3組(n=8)：空白對(duì)照組(C組),丙泊酚組(P組),烏司他丁組(U組)。干預(yù)措施為C組以0.5ml/kg/h速度持續(xù)靜脈輸注生理鹽水至手術(shù)結(jié)束,P組以Marsh模型2.0mg/ml血漿靶濃度靶控輸注丙泊酚至手術(shù)結(jié)束,U組靜脈持續(xù)輸注烏司他丁10000U/kg。采集各時(shí)點(diǎn)血清樣本,ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子。結(jié)果：IL-10檢測(cè)結(jié)果分組與時(shí)間兩因素交互效應(yīng)不顯著(F--1.539,P=0.222)；時(shí)間因素主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=9.455,P<0.01),術(shù)前與其它各時(shí)點(diǎn)均有顯著性差異(P<0.05)；分組因素主效應(yīng)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=4.017,P=0.033),P組與C組有顯著性差異(P<0.05),U組與C組有顯著性差異(P<0.05),在術(shù)畢時(shí)點(diǎn),IL-10水平P組與C組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.003)。IL-6檢測(cè)結(jié)果分組與時(shí)間兩因素交互效應(yīng)不顯著(F＝0.622,P=0.636)。時(shí)間因素主效應(yīng)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=27.544,P<0.001),各時(shí)間點(diǎn)均有顯著性差異(P<0.05)；分組因素主效應(yīng)差異不顯著(F=0.166,P=0.848)。TNF