應化化工分析技師培訓材料

PAGEPAGE33氣相色譜培訓教材（技師）第一節(jié)概述以氣體為流動相的色譜法稱為氣相色譜法(gaschromatography；GC)。1.氣相色譜法的分類就其操作形式而言，氣相色譜法屬于柱色譜法。按固定相的物態(tài)，分為氣-固色譜法(GSC)及氣-液色譜法(GLC)兩類。按柱的粗細和填充情況，分為填充柱色譜法及毛細管柱色譜法兩種。填充柱是將固定相填充在金屬或玻璃管中(常用內(nèi)徑4mm)。毛細管柱(內(nèi)徑0.1～0.5mm)可分為開管毛細管柱、填充毛細管柱等。按分離機制，可分為吸附及分配色譜法兩類。氣-液色譜法屬于分配色譜法。在氣-固色譜法中，固定相常用吸附劑，因此多屬于吸附色譜法。當固體固定相為分子篩時，分離是靠分子大小差異及吸附兩種作用。2.氣相色譜法的一般流程在圖2-1所示GC流程中，載氣由高壓氣瓶供給，經(jīng)壓力調(diào)節(jié)器降壓，經(jīng)凈化器脫水及凈化，由穩(wěn)壓閥調(diào)至適宜的流量而進入色譜柱，經(jīng)檢測器流出色譜儀。待流量、溫度及基線穩(wěn)定后，即可進樣。液態(tài)樣品用微量注射器取樣，由進樣器注入，氣態(tài)樣品可用六通閥或注射器進樣，樣品被載氣帶入色譜柱。樣品中各組分在固定相與載氣間分配，由于各組分在兩相中的分配系數(shù)不等，它們將按分配系數(shù)大小的順序依次被載氣帶出色譜柱。分配系數(shù)小的組分先流出；分配系數(shù)大的后流出。流出色譜柱的組分被載氣帶入檢測器，檢測器將各組分的濃度(或質(zhì)量)的變化，轉(zhuǎn)變?yōu)殡妷?或電流)的變化，電壓(或電流)隨時間的變化由記錄器記錄。色譜柱及檢測器是氣相色譜儀的兩個主要組成部分。現(xiàn)代氣相色譜儀都應用計算機和相應的色譜軟件，具有處理數(shù)據(jù)及控制實驗條件等功能。3.氣相色譜法的特點氣相色譜法具有分離效能高、選擇性好、靈敏度高、樣品用量少、分析速度快（幾秒至幾十分鐘)及應用廣等優(yōu)點。受樣品蒸氣壓限制是其弱點，對于揮發(fā)性較差的液體、固體，需采用制備衍生物或裂解等方法，增加揮發(fā)性。據(jù)統(tǒng)計，能用氣相色譜法直接分析的有機物約占全部有機物的20%。4.氣相色譜法的應用氣相色譜法是從1952年才迅速發(fā)展起來的一種分離分析方法。最早是用于分離分析石油產(chǎn)品，目前已廣泛用于石油化學、化工、有機合成、醫(yī)藥、生物化學、食品分析和環(huán)境監(jiān)測等領(lǐng)域。在藥物分析中，氣相色譜法已成為有關(guān)物質(zhì)檢查、原料藥和制劑的含量測定、中草藥成分分析、藥物的純化、制備的一種重要手段。第二節(jié)基本理論氣相色譜理論可分為熱力學和動力學理論兩方面。熱力學理論是從相平衡觀點來研究分離過程，以塔片理論為代表。動力學理論是從動力學觀點來研究各種動力學因素對柱效的影響，以VanDeemter方程式為代表。在敘述這兩個理論前先介紹有關(guān)基本概念。一、基本概念l.色譜峰(流出峰)由電信號強度對時間作圖所繪制的曲線稱為色譜流出曲線。流出曲線(圖2-2)上的突起部分稱為色譜峰。正常色譜峰為對稱形正態(tài)分布曲線，曲線有最高點，以此點的橫坐標為中心，曲線對稱地向兩側(cè)快速、單調(diào)下降。不正常色譜峰有兩種：拖尾峰及前延峰。前沿陡峭，后沿拖尾的不對稱色譜峰稱為拖尾峰(tailingpeak)，前沿平緩，后沿陡峭的不對稱色譜峰稱為前延峰(leadingpeak)。正常色譜峰與不正常色譜峰可用對稱因子fs(symmetryfactor)或叫拖尾因子來衡量(圖20-3)。對稱因子在0.95～1.05之間為對稱峰，小于0.95為前延峰，大于1.05為拖尾峰。fs=W0.05h/2A=(A+B)/2A(2.1)一個組分的色譜峰可用三項參數(shù)即峰高或峰面積(用于定量)、峰位(用保留值表示、用于定性)及峰寬(用于衡量柱效)說明。2.基線在操作條件下，沒有組分流出時的流出曲線稱為基線。穩(wěn)定的基線應是一條平行于橫軸的直線。基線反映儀器(主要是檢測器)的噪音隨時間的變化。3.保留值(滯留值)是色譜定性參數(shù)。(1)保留時間(tR)：從進樣開始到某個組分的色譜峰頂點的時間間隔稱為該組分的保留時間(retentiontime)，即從進樣到柱后某組分出現(xiàn)濃度極大時的時間間隔。圖2-2中tR1及tR2分別為組分l及組分2的保留時間。(2)死時間(t0)：分配系數(shù)為零的組分的保留時間稱為死時間(deadtime)。通常把空氣或甲烷視為此種組分，用來測定死時間。(3)調(diào)整保留時間()：某組分由于溶解(或被吸附)于固定相，比不溶解(或不被吸附)的組分在柱中多停留的時間稱為調(diào)整保留時間(adjustedretentiontime)，又稱為校正保留時間。調(diào)整保留時間與保留時間和死時間有如下關(guān)系：(2.2)在實驗條件(溫度、固定相等)一定時，調(diào)整保留時間僅決定于組分的性質(zhì)，因此調(diào)整保留時間是定性的基本參數(shù)。(4)保留體積(VR)：從進樣開始到某個組分在柱后出現(xiàn)濃度極大時，所需通過色譜柱的載氣體積稱為該組分的保留體積(retentionvolume)。對于正常峰，該組分的l/2量被帶出色譜柱時所消耗的載氣體積為保留體積。保留體積與保留時間和載氣流速(Fc，ml/min)有如下關(guān)系：（2.3）載氣流速大，保留時間短，但兩者的乘積不變，因此VR與載氣流速無關(guān)。（5）死體積(V0)：由進樣器至檢測器的流路中未被固定相占有的空間稱為死體積。死體積是進樣器至色譜柱間導管的容積、色譜柱中固定相顆粒間間隙、柱出口導管及檢測器內(nèi)腔容積的總和。死體積與死時間和載氣流速有如下關(guān)系：（2.4）死體積大，色譜峰擴張(展寬)，柱效降低。死時間相當于載氣充滿死體積所需的時間。(6)調(diào)整保留體積()：由保留體積扣除死體積后的體積稱為調(diào)整保留體積。(2.5)與載氣流速無關(guān)，是常用的色譜定性參數(shù)之一。(7)半峰寬(peakwidthathalfheight；W1/2或Y1/2)：峰高一半處的峰寬稱為半峰寬，又稱為半腰寬及半寬度等。W1/2=2.355σ(2.8)(8)峰寬(peakwidth，W)：通過色譜峰兩側(cè)的拐點作切線，在基線上的截距稱為峰寬，或稱基線寬度，也可用Y表示。W=4σ或W=l.699W1/2(2.9)（9）相對保留值（relativeretentionvalume）在相同條件下，組分2與組分1的調(diào)整保留值之比，用r21表示。(7-4)采用相對保留值可以消除某些操作條件對保留值的影響，只要柱溫、固定相和流動相的性質(zhì)保持不變，即使柱長、柱徑、填充情況及流動相速有所變化，由于相對保留值在較短的時間間隔內(nèi)進行測定，實驗條件對保留值的影響在分子分母中都存在，其比值仍基本保持不變，所以它是色譜定性分析的重要參數(shù)。三、塔板理論塔板(塔片)理論是把色譜柱看作一個分餾塔，在每個塔板的間隔內(nèi)，樣品混合物在氣液兩相中達到分配平衡。經(jīng)過多次的分配平衡后，分配系數(shù)小的組分(揮發(fā)性大的組分)先到達塔頂(先流出色譜柱)。由于色譜柱的塔板相當多，因此分配系數(shù)的微小差別，即可獲得很好的分離效果。(一)基本假設(shè)組分被載氣帶入色譜柱后在兩相中分配，由于流動相移動較快，組分不能在柱內(nèi)各點瞬間達到分配平衡。但塔板理論假定：l.在柱內(nèi)一小段高度H內(nèi)，組分可以很快在兩相中達到分配平衡。且稱為理論塔板高度(heightequivalenttoatheoreticalplate)，用HETP或H表示。2.載氣通過色譜柱不是連續(xù)前進，而是間歇式的，每次進氣為一個塔板體積。3.樣品和新鮮載氣都加在第0號塔板上，且樣品的縱向擴散可以忽略。4.分配系數(shù)在各塔板上是常數(shù)。塔板理論的假設(shè)實際上是把組分在兩相間的連續(xù)轉(zhuǎn)移過程，分解為間歇的在單個塔板中的分配平衡過程。也就是用分離過程的分解動作來說明色譜過程。(二)理論塔板高度和理論塔板數(shù)理論塔板高度(H)和理論塔板數(shù)(n)都是柱效指標。由于σ的大小是柱效高低的反映，因此將理論塔板高度定義為每單位柱長(L)的方差。即：(2·l1)理論塔板數(shù)為：n=L/H(2·l3)在實驗中，理論塔板數(shù)由峰寬和保留時間計算：n=16(tR/W)2(2·l2)或者n=(tR/σ)2或n=5.54(tR/W1/2)2(2.13)由上式可以說明，σ或W1/2越小，色譜柱的塔板高度越小，柱效越高。若用代替計算塔板數(shù)，稱為有效理論塔板數(shù)(nef)，求得塔板高度為有效理論塔板高度(Hef)。例在柱長2m、5%阿皮松柱、柱溫100℃、記錄紙速為2.0cm/min的實驗條件下，測定苯的保留時間為1.5min，半峰寬為0.20cm。求理論塔板高度。上，載氣攜帶組分通過色譜柱時，由于載氣的線速度較快，組分在固定相與載氣間不可能達到分配平衡。第三節(jié)色譜柱色譜柱由固定相與柱管組成。色譜柱可按柱管的粗細、固定相的填充方法及分離機制分類。按柱粗細可分為一般填充柱及毛細管柱兩類。填充色譜柱多用內(nèi)徑4～6mm的不銹鋼管制成螺旋形管柱，常用柱長2～4m。填充液體固定相(氣-液色譜)或固體固定相(氣-固色譜)。毛細管色譜柱柱管為毛細管，常用內(nèi)徑0.1～0.5mm的玻璃或彈性石英毛細管，柱長幾十米至百米。按填充方式可分為開管毛細管柱及填充毛細管柱等。按分離機制可分為分配柱及吸附柱等，它們的區(qū)別主要在于固定相。分配柱一般是將固定液(高沸點液體)涂漬在載體上，構(gòu)成液體固定相，利用組分的分配系數(shù)差別而實現(xiàn)分離。將固定液的官能團通過化學鍵結(jié)合在載體表面，稱為化學鍵合相(chemicallybondedphase)，不流失是其優(yōu)點。吸附柱將吸附劑裝入色譜柱而構(gòu)成，利用組分的吸附系數(shù)的差別而實現(xiàn)分離。除吸附劑外，固體固定相還包括分子篩與高分子多孔小球等。一、固定液固定液一般是一些高沸點的液體，在操作溫度下為液態(tài)，在室溫時為固態(tài)或液態(tài)。(一)對固定液的要求在操作溫度下呈液態(tài)且蒸氣壓低，因為蒸氣壓低的固定液流失慢、柱壽命長、檢測器本底低；固定液對樣品中各組分有足夠的溶解能力，分配系數(shù)較大；選擇性能高，兩個沸點或性質(zhì)相近的組分的分配系數(shù)比不等于一；穩(wěn)定性好，固定液與樣品組分或載體不產(chǎn)生化學反應，高溫下不分解；粘度小，凝固點低。(二)固定液的分類有數(shù)百種固定液，合理分類有利于選擇?；瘜W分類與極性分類是常用的分類方法。1.化學分類法(l)烴類：包括烷烴與芳烴。常用的有沙魚烷(角鯊烷、異卅烷、C30H62)，是標準非極性固定液。(2)硅氧烷類：是目前應用最廣的通用型固定液。其優(yōu)點是溫度粘度系數(shù)小、蒸氣壓低，流失少，對大多數(shù)有機物都有很好的溶解能力等。包括從弱極性到極性多種固定液。這類固定液的基本化學結(jié)構(gòu)為：硅氧烷類固定液按化學結(jié)構(gòu)分類如下：1）甲基硅氧烷：R為甲基，按分子量不同可分為甲基硅油(n<400)及甲基硅橡膠(n>400)。甲基硅油有甲基硅油I(最高使用溫度230℃)等，甲基硅橡膠有SE-30(350℃)及OV-l(3502)苯基硅氧烷：R為苯基。n<400為甲基苯基硅油；n>400為甲基苯基硅橡膠。根據(jù)含苯基與甲基的比例不同分為：低苯基硅氧烷，如SE-52(5%，300℃)；中苯基硅氧烷，如OV-17（50%，350℃）；高苯基硅氧烷，如OV-25(75%，300℃)。苯基含量高時，結(jié)構(gòu)中的甲基也相應變?yōu)楸交?。這類固定液因引入苯基而極性比甲基硅氧烷強，3)氟烷基硅氧烷：R為三氟丙基(-CH2CH2CF3)，是一類中等極性固定液。這類固定液在強堿作用下易解聚，故只能與酸洗載體配伍。4)氰基硅氧烷：R為氰乙基（-CH2CH2CN），是一類強極性固定液，氰乙基含量越高，極性越強。(3)醇類：是一類氫鍵型固定液，可分為非聚合醇與聚合醇兩類。聚乙二醇如PEG-20M(平均分子量20000，250℃(4)酯類：是中強極性固定液，分為非聚合酯與聚酯兩類。聚酯類多是二元酸及二元醇所生成的線型聚合物，如丁二酸二乙二醇聚酯(poiydiethyleneglycolsuccinatePDEGS或DEGS)。在酸性或堿性條件下或200℃(三)固定液的選擇對于組分已知的樣品，如果難分離物質(zhì)對初步確定，那么選擇固定液的指標就是使難分離物質(zhì)對達到定量分離。l.按相似性原則選擇按被分離組分的極性或官能團與固定液相似的原則來選擇，這是因為相似相溶的緣故。這樣，組分在固定液中的溶解度大，分配系數(shù)大，保留時間長，分開的可能性就大。(1)按極性相似選擇：①非極性化合物應首先選擇非極性固定液，這時組分與固定液分子間的作用力主要是色散力，組分基本上以沸點順序出柱，低沸點的先出柱。若樣品中有極性組分，相同沸點的極性組分先出柱。②中等極性化合物可首選中等極性固定液。分子間作用力為色散力和誘導力?；旧先园捶悬c順序出柱。但對沸點相同的極性與非極性組分，誘導力起主導作用，極性成分后出柱。③強極性化合物，首選極性固定液。分子間主要作用力為定向力。組分按極性順序出柱，極性強的組分后出柱。(2)按化學官能團相似選擇：當固定液與組分的化學官能團相似時，相互作用力最強，選擇性最高。例如，被分離化合物為酯可選酯和聚酯固定液?；衔餅榇伎蛇x醇類或聚乙二醇等。2.按主要差別選擇若組分的沸點差別是主要矛盾，可選非極性固定液；若極性差別為主要矛盾，則選極性固定液?，F(xiàn)舉例說明：苯與環(huán)己烷沸點相差0.6℃(苯80.1℃，環(huán)己烷80.7℃)。而苯為弱極性化合物，環(huán)己烷為非極性化合物，二者極性差別雖然不大，但相對而言比沸點差別大，極性差別是主要矛盾。用非極性固定液很難將苯與環(huán)己烷分開。若改用中等極性的固定液，如用鄰苯二甲酸二壬酯，則苯的保留時間是環(huán)己烷的1.5倍。若再改用聚乙二醇400，3.按麥氏相常數(shù)選擇由于麥氏常數(shù)比較全面地描述了固定液的分離特征，因此根據(jù)麥氏常數(shù)可較快地選擇適合于分離對象的固定液。例如，要分離正丁基乙基醚和正丙醇，且正丙醇是雜質(zhì)，應讓它先出峰，因此所選擇的固定液應與正丁基乙基醚的作用力強，與正丙醇的作用力弱。值越大的固定液對質(zhì)子受體的作用力越強；值越小的固定液對質(zhì)子給體的作用力越小。醚是質(zhì)子受體，醇是質(zhì)子給體，因此只有選擇具有高值的固定液，才能使正丙醇先于正丁基乙基醚之前流出。從表2-2查得QF-l的=355/233=1.52，此值較大，可選作固定液。查得OV-210的=358/238=1.50，此值略小于QF-1，但OV-2l0的最高使用溫度為275℃，而QF-l只有250℃。若采用較高柱溫，OV-210更合適。二、載體一般載體(擔體)是化學惰性的多孔性微粒。特殊載體如玻璃微珠，是比表面積大的化學惰性物質(zhì)，但并非多孔。固定液分布在載體表面，形成一均勻薄層，構(gòu)成氣-液色譜的固定相。1.對一般載體的要求①比表面積大，孔穴結(jié)構(gòu)好；②表面沒有吸附性能(或很弱)；③不與被分離物質(zhì)或固定液起化學反應；④熱穩(wěn)定性好，粒度均勻，有一定的機械強度等。2.載體的分類載體可分為兩大類：硅藻土型載體與非硅藻土型載體。硅藻土型載體是天然硅藻土經(jīng)鍛燒等處理而獲得的具有一定粒度的多孔性固體微粒。非硅藻土型載體種類不一，多用于特殊用途，如氟載體、玻璃微珠及素瓷等。3.載體的鈍化鈍化是除去或減弱載體表面的吸附性能。以硅藻土型載體為例，表面存在著硅醇基及少量的金屬氧化物，常具有吸附性能。當被分析組分是能形成氫鍵的化合物或酸堿時，則與載體的吸附中心作用，破壞了組分在氣-液二相中的分配關(guān)系，而產(chǎn)生拖尾現(xiàn)象，故需將這些活性中心除去，使載體表面結(jié)構(gòu)鈍化。鈍化的方法有酸洗、堿洗、硅烷化及釉化等。酸洗能除去載體表面的鐵、鋁等金屬氧化物。酸洗載體用于分析酸類和酯類化合物。堿洗能除去表面的Al2O3等酸性作用點，堿洗載體適用于分析胺類等堿性化合物。硅烷化是將載體與硅烷化試劑反應，除去載體表面的硅醇基，消除形成氫鍵的能力。硅烷化載體主要用于分析具有形成氫鍵能力較強的化合物，如醇、酸及胺類等。三、氣-固色譜填充柱氣-固色譜填充柱的固定相可為吸附劑、分子篩、高分子多孔微球及化學鍵合相等。吸附劑常用石墨化炭黑、硅膠及氧化鋁等。分子篩常用4A、5A、及l(fā)3X。4、5及l(fā)3表示平均孔徑(?)，A及X表示類型。分子篩是一種特殊吸附劑，具有吸附及分子篩兩種作用。若不考慮吸附作用，分子篩是一種“反篩子”，分離機制與凝膠色譜類似。吸附劑與分子篩多用于永久性氣體及低分子量化合物的分離分析，在藥物分析上遠不如高分子多孔微球用途廣。因此以下主要介紹高分子多孔微球。高分子多孔微球(GDX)是一種人工合成的新型固定相，還可以作為載體。它由苯乙烯(STY)或乙基乙烯苯(EST)與二乙烯苯(DVB)交聯(lián)共聚而成，聚合物為非極性。若STY與含有極性基團的化合物聚合，則形成極性聚合物。高分子多孔微球的分離機理一般認為具有吸附、分配及分子篩三種作用。該固定相有如下優(yōu)點：①改變制備條件及原料可以合成各種比表面及孔徑的聚合物。因而可根據(jù)樣品的性質(zhì)進行選擇，使分離效果最佳。②無有害的吸附活性中心，極性組分也能獲得正態(tài)峰。③無流失現(xiàn)象，柱壽命長。④具有強疏水性能，特別適于分析混合物中的微量水分。⑤粒度均勻，機械強度高，具有耐腐蝕性能。⑥熱穩(wěn)定性好，最高使用溫度為200～300℃。⑦柱超負荷后恢復快，還適用于制備色譜?；瘜W鍵合相是新型氣相色譜固定相，具有分配與吸附兩種作用，傳質(zhì)快、柱效高、分離效果好、不流失、柱壽命長，但價格較貴。有關(guān)化學鍵合相的內(nèi)容見第3章。四、毛細管色譜柱色譜動力學理論認為，可以把氣-液填充柱看作一束涂了固定液的長毛細管。由于這束毛細管是彎曲與多徑的，而引起渦流擴散，使柱效降低。其次，填充柱的傳質(zhì)阻抗大，也使柱效降低。1957年Golay根據(jù)這個觀點，把固定液直接涂在毛細管管壁上，而發(fā)明了Golay柱，標志著毛細管氣相色譜法的誕生。從80年代起，特別是近幾年來，毛細管柱制備技術(shù)不斷發(fā)展，新型高效毛細管柱不斷出現(xiàn)，為氣相色譜法開辟了新途徑。(一)毛細管色譜柱的分類按制備方法的不同，毛細管色譜柱可分為：1.開管型毛細管柱最早的開管型毛細管柱是內(nèi)徑為0.1～0.3mm的熔融石英管。但目前應用的主要是涂壁毛細管柱(wallcoatedopentubularcolumn；WCOT)和載體涂層毛細管柱(supportcoatedopentubularcolumn；SCOT)。(l)涂壁毛細管柱：將固定液直接涂在玻璃或金屬毛細管內(nèi)壁上而制成。后者常為不銹鋼毛細管，其表面為非極性，很適合于非極性或弱極性固定液涂層。涂極性固定液時，常加入表面活性劑，使固定液牢固地涂在管壁上。具有極性表面的玻璃毛細管可涂上極性或弱極性固定液。常采用硅烷化法處理玻璃管內(nèi)壁，除去硅醇基，降低吸附性，改善色譜峰形。有時用氯化氫氣體等處理管壁，使其變得粗糙，使涂層更牢固。這種柱涂漬的固定液很少，涂層厚度通常為0.3～1.5μm，固定液易流失，柱壽命短。(2)載體涂層毛細管柱：在毛細管內(nèi)壁粘上一層載體，然后再將固定液涂在載體上，就構(gòu)成了載體涂層毛細管柱。載體(多為硅藻土)先粘在厚壁玻璃管內(nèi)壁上，再在600～700℃下拉制成毛細管，使載體均勻地分布在管壁上。SCOT克服了WCOT的上述缺點，是目前應用最廣泛的毛細管色譜柱。近年來出現(xiàn)的交聯(lián)彈性石英毛細管柱是將固定液交聯(lián)聚合在毛細管內(nèi)，減少了固定液流失，柱壽命長，是當前最佳的SCOT2.填充型毛細管柱它是將載體、吸附劑等松散地裝入玻璃管中，然后拉制成毛細管。一般柱內(nèi)徑≤l.0mm，填料粒度與內(nèi)徑的比值為0.2～0.3。這類柱可用作吸附柱，分離氣體組分和低分子量的烴類，也可涂上固定液，用作分配柱。與普通填充柱相比，它具有分析速度快，柱效高(理論塔板數(shù)為3000～4000m-l)等優(yōu)點。把涂有固定液的細顆粒填料(30～50μm)裝入內(nèi)徑小于lmm的毛細管，稱為微型填充柱，其柱效高，分析速度快，但柱制備困難。就其性質(zhì)屬于填充柱范圍。(二)開管毛細管柱與一般填充柱的比較開管型毛細管柱尤其是SCOT柱仍然是目前使用最多的毛細管柱。與一般填充柱相比其具有如下特點：1.柱滲透性好開管毛細管柱的柱阻很小，這有兩方面優(yōu)點：①可以增加柱長(最長可達300m)，增加一根色譜柱的塔板數(shù)。②可以用高載氣流速進行快速分析。2.柱效高一根毛細管柱的理論塔板數(shù)最高可達l06，最低也有幾萬。柱效高的原因主要有3個：一是無渦流擴散，二是傳質(zhì)阻抗小，三是柱長比填充柱長。開管毛細管柱一般長為25～50m，即使理論塔板數(shù)只有1000m-1，一根柱的塔板數(shù)尚有(2.5～5)×l04.而一根普通填充柱柱長為2～6m，塔板數(shù)只有～103，相差懸殊。3.易實現(xiàn)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用由于毛細管柱的載氣流量小，較易維持質(zhì)譜儀離子源的高真空。4.柱容量小由于其固定液量只有填充柱的幾十分之一至幾百分之一，因此最大允許進樣量很小，進樣器需有分流裝置。5.定量重復性較差這主要是由于進樣量甚微，很難實現(xiàn)定量和重現(xiàn)。因此，通常多用毛細管色譜柱進行分離和定性，較少用于定量分析。圖2-1l為毛細管色譜柱分析氨基酸的實例。色譜條件如下：色譜柱：SE-30SCOT柱，柱長30m，柱溫：120～240℃，(2℃/min)；進樣量0.1μl。第四節(jié)檢測器檢測器(detector)是將流出色譜柱的載氣中被分離組分的濃度(或量)的變化轉(zhuǎn)換為電信號(電壓或電流)變化的裝置。色譜柱與檢測器構(gòu)成分離-分析儀器——氣相色譜儀的兩個主要部分，前者“司分離”，后者“司分析”。氣相色譜儀的檢測器已有三十余種之多，常用檢測器可分為濃度型檢測器和質(zhì)量型檢測器兩大類。下面介紹三種最基本的檢測器，熱導檢測器、氫焰離子化檢測器和電子捕獲檢測器。一、熱導檢測器熱導檢測器(thermalconductivitydetector；TCD)是利用被檢測組分與載氣的熱導率的差別來檢測組分的濃度變化{熱導率是衡量物質(zhì)導熱性能的指標，用“λ”表示。當物質(zhì)的橫截面積為1m2，厚lm，兩側(cè)溫差為1開爾文(K)時，每秒傳導過此物質(zhì)的熱量稱為熱導率。按國際單位制規(guī)定：熱導率的單位為瓦/米·開}。具有構(gòu)造簡單、測定范圍廣、穩(wěn)定性好、線性范圍寬、樣品不被破壞等優(yōu)點。TCD是一種通用型檢測器。但靈敏度低。(一)檢測原理在一塊不銹鋼塊上鉆上孔道，裝入熱敏元件(熱絲)，就構(gòu)成熱導池。熱敏元件用鎢絲或錸鎢絲等制成，它們的電阻隨溫度的升高而增大，并且具有較大的溫度系數(shù)，故稱為“熱敏”元件。鎢絲的電阻溫度系數(shù)為6.5×10-3歐/(歐·度)。將兩個材質(zhì)、電阻相同的熱敏元件，裝入一個雙腔的池體中，構(gòu)成雙臂熱導池(圖2-12a)。一臂聯(lián)接在色譜柱之前，只通載氣，稱為參考臂；另一臂聯(lián)接在色譜柱之后，稱為測量臂。兩臂的電阻分別為R1與R2。將R1、R2與兩個阻值相等的固定電阻R3、R4組成橋式電路(圖2-l2b)。當載氣以恒定的速度通入熱導池，并以恒定的電壓給熱導池通電時，熱絲溫度升高。所產(chǎn)生的熱量主要經(jīng)載氣由熱傳導方式傳給溫度低于熱絲的池體，其余部分由載氣的“強制”對流所帶走，熱輻射散失的熱量很小，可忽略不計。當熱量的產(chǎn)生與散失建立熱動平衡后，熱絲的溫度恒定。若測量臂無樣氣通過，即只通載氣時，兩個熱絲的溫度相等，R1=R2。根據(jù)惠斯敦電橋原理，當R1/R2=R3/R4時，A、B兩點間的電位差VAB=0。因此，此時檢流計G中無電流通過(IG=0)，檢流計指針停在零點。當樣品由進樣器注入色譜柱，分離后，某組分被載氣帶入測量臂時，若組分與載氣的熱導率不等，則測量臂的熱動平衡被破壞，熱絲的溫度將改變。若組分的熱導率小于載氣的熱導率，則熱傳導散熱減少，熱絲的溫度升高，電阻R1增大。R1>R2；R1/R2≠R3/R4；VAB≠0；IG≠0，檢流計指針偏轉(zhuǎn)。當組分完全通過測量臂后，指針又恢復至零點。若用記錄器(電子毫伏計)代替檢流計，則可記錄mV-t曲線，即色譜流出曲線。由于VAB的大小決定于組分與載氣的熱導率之差，以及組分在載氣中之濃度，因此在載氣與組分一定時，峰高(VAB)與組分在載氣中的濃度成正比。早期生產(chǎn)的氣相色譜儀多用雙臂熱導池，靈敏度較低。目前都采用四臂熱導池。將電橋上兩個固定電阻(R3、R4)也換成熱敏元件則構(gòu)成四臂熱導池，其靈敏度在同樣條件下是雙臂熱導池的二倍。(二)載氣的選擇在熱導池體溫度與載氣流速等實驗條件恒定時，檢測器的靈敏度決定于載氣與組分熱.導率之差，兩者相差越大，電阻R1改變越大，檢測器越靈敏。若λ組分=λ載氣，則不產(chǎn)生信號。現(xiàn)將幾種物質(zhì)的熱導率列于表2-3。由表2-3可看出，若用氮氣為載氣，樣品為空氣，因為λN2=λ空氣，則樣品不出峰。氮氣的熱導率比較小，與多數(shù)有機物的熱導率〔一般小于3×l0-2W/(m·K)〕相差較小，因此用氮氣為載氣時，靈敏度低，且有時出倒峰。例如，一個混合物中含有甲烷及丙烷，若用氮表2-3幾種氣體與有機液體蒸氣在373K（100℃）的熱導率[W/（m?K）]化合物λ×102化合物λ×102氫氣22.36乙烯3.10氦氣17.42丙烷2.64空氣3.14苯1.84氮氣3.14乙醇2.22甲烷4.56丙酮1.76氣為載氣，當甲烷進入檢測器時，因λ甲烷>λN2，散熱多，熱絲溫度降低，電阻減小，當丙烷進入檢測器后，因λ丙烷<λN2，散熱少，熱絲溫度升高，電阻增大。因此，后者若為正峰，則前者為倒峰。若選用氫氣為載氣，可獲得較高的檢測靈敏度，而且不出倒峰，但不安全。氦氣較理想，但價格較貴。二、氫焰離子化檢測器氫焰離子化檢測器(hydrogenflameionizationdetector；FID)利用有機物在氫焰的作用下，化學電離而形成離子流，借測定離子流強度進行檢測。FID具有靈敏度高、響應快、線性范圍寬等優(yōu)點，是目前最常用的檢測器之一。但這種檢測器是專屬型檢測器，一般只能測定含碳有機物，而且檢測時樣品被破壞。有機化合物進入氫火焰，在燃燒過程中直接或間接產(chǎn)生離子。檢測器(圖2-13)的收集極(陽極)與極化環(huán)(陰極)間具有電位差，使離子在收集極與極化環(huán)間作定向流動形成離子流。離子流強度與進入檢測器中組分的量及分子中的含碳量有關(guān)，因此在組分一定時，測定電流(離子流)強度可以對組分進行定量。在沒有有機物通過檢測器時，氫氣燃燒，在電場作用下，也能產(chǎn)生極微弱的離子流。一般只有10-12～10-11A，此電流稱為檢測器的本底。在有微量有機物引入檢測器后，電流急劇增加，可達到10-7A，電流大小與有機物引入的量成正比。在兩極間接上一高電阻(108～1011Ω)，并使高電阻的兩端(A、B兩點)與微電流放大器的輸入端并聯(lián)。當電流產(chǎn)生微小的變化時，則在高電阻上產(chǎn)生很大的電壓變化，再經(jīng)放大器放大，然后由記錄器(電子電位差計)記錄電壓隨時間的變化，而得色譜流出曲線。有機化合物在氫火焰中的離子化機制有幾種說法，其中化學電離理論能較好地解釋烴類的離子化機制，有一定參考價值。該理論認為有機物在氫火焰中先形成自由基，而后與氧產(chǎn)生正離子，再與水反應生成泋離子。由這些離子形成的離子流產(chǎn)生電信號。。四、檢測器的性能指標對檢測器性能的要求主要有四方面：①靈敏度高；②穩(wěn)定性好，噪聲低；③線性范圍寬；④死體積小，響應快。(一)噪聲和漂移無樣品通過檢測器時，由儀器本身和工作條件等的偶然因素引起的基線起伏稱為噪聲(noise；N)。噪聲的大小用噪聲帶(峰-峰值)的寬度來衡量(圖2-15)。例如，不進樣時，記錄某檢測器的基線帶寬為0.02mV，即噪聲為0.02mV。基線隨時間朝某一方向的緩慢變化稱為漂移(drift；d)。通常用一小時內(nèi)基線水平的變化來衡量。(二)靈敏度靈敏度(sensitivity)又稱響應值或應答值。是用來評價檢測器質(zhì)量或比較不同類型檢測器時的重要指標。l.濃度型檢測器的靈敏度(Sc)1ml載氣中攜帶1mg的某組分通過檢測器所產(chǎn)生的mV數(shù)。Sc的單位為mV·ml/mg。計算公式：(2.19)A為色譜峰面積(cm2)，C1為記錄器的靈敏度(mV/cm)，C2為記錄紙速的倒數(shù)(min/cm)，C3為柱出口載氣流速(ml/min)，W為進樣量(某組分純品，mg)。2.質(zhì)量型檢測器的靈敏度(Sm)每秒有l(wèi)g某組分通過檢測器時所產(chǎn)生的mV數(shù)或A(安培)數(shù)。Sm的單位為mV·s/g或A·s/g。計算公式：(2.20)A、C1與C2的含義同前，W的單位常用克表示。(三)檢測限檢測限(detectability；D)或稱敏感度(M)。靈敏度不能全面地表明一個檢測器的優(yōu)劣，因為它沒有反映檢測器的噪聲水平。信號可以被放大器任意放大，使靈敏度增高，但噪聲也同時放大，弱信號仍然難以辨認。因此評價檢測器不能只看靈敏度，還要考慮噪聲的大小。檢測限從這兩方面來說明檢測器性能。某組分的峰高恰為噪聲的二倍時，單位時間內(nèi)載氣引人檢測器中該組分的質(zhì)量或單位體積載氣中所含該組分的量稱為檢測限。由于低于此限組分峰將被噪聲所淹沒，而檢測不出來(圖2-l5)。質(zhì)量型檢測器：Dm=2N/Sm(2.20)濃度型檢測器：Dc=2N/Sc(2.21)Dc與Dm的單位分別為g/s及g/ml(或mg/ml)。檢測限越小，檢測器的性能越好。第五節(jié)分離條件的選擇固定相、柱溫及載氣的選擇是氣相色譜分離條件選擇的三個主要方面，用于提高相鄰兩組分的分離度(resolution)。一、分離方程式分離參數(shù)之一是分離度(R)，又稱分辨率，用于衡量分離效果。其定義式如下：(2.22)式中tR1、tR2分別為組分1、2的保留時間；W1、W2分別為組分1、2色譜峰的峰寬。因此相鄰二色譜峰峰尖距離對峰寬均值的倍數(shù)為分離度(圖2-16)。設(shè)色譜峰為正常峰，且W1≈W2=4σ。若R=l，峰尖距(ΔtR)為4σ，此種分離狀態(tài)稱為4σ分離，峰基略有重疊，裸露峰面積≥95.4%(tR±2σ)。若R=1.5，峰尖距為6σ，稱為6σ分離，兩峰完全分開，裸露面積≥99.7%(tR±3σ)。在作定量分析時，為了能獲得較好的精密度與準確度，應使R≥l.5(《中國藥典》1995版規(guī)定)。分離度與柱效、分配系數(shù)比(α)及容量因子(k)間關(guān)系如下：(2.23)abc此式稱為分離方程式。式中a為柱效項，b為柱選擇性項，c為柱容量項，n為理論塔片數(shù)，k2為色譜圖上相鄰二個組分中第二組分的容量因子，α為分配系數(shù)比，即α=K2/K1=k2/k1。n、k和α對分離度的影響如圖2-l7所示，n影響峰的寬度，k影響峰位，α影響峰間距。由式2.23可以看出，若α=1(即K1=K2)，則選擇性項為零，R為零，組分1和2不能分離。這也說明分配系數(shù)不等是分離的前提。α雖受流動相性質(zhì)和柱溫的影響，但主要受固定相性質(zhì)的影響，因此只有選擇適當?shù)墓潭ㄏ?，使不同組分與固定相的作用力存在差別，才能實現(xiàn)分離。一般說來，在α>1的前提下，k和n越大則分離度越大。k與固定相用量、流動相流速和柱溫有關(guān)，在前兩者確定的情況下，主要受柱溫的影響。n主要受色譜柱的性能(固定相的粒度分布、固定相涂層厚度、柱填充均勻程度及柱長等)和載氣流速的影響，這已在VanDeemter方程中討論。二、實驗條件的選擇1.色譜柱的選擇主要是選擇固定相和柱長。固定相選擇需注意兩個方面：極性及最高使用溫度。按相似性原則和主要差別選擇固定相(詳見第三節(jié))。柱溫不能超過最高使用溫度，在分析高沸點化合物時，需選擇高溫固定相。氣-液色譜法還要注意載體的選擇。高沸點樣品用比表面小的載體、低固定液配比(1%～3%)，以防保留時間過長，峰擴張嚴重。此外，低配比時可使用較低柱溫。低沸點樣品宜用高配比(5%～25%)，從而增大k值，以達到良好分離。難分離樣品可用毛細管柱。柱長加長能增加塔板數(shù)n，使分離度提高。但柱長過長，峰變寬，柱阻也增加，并不利于分離。在不改變塔板高度(H)的條件下，分離度與柱長有如下關(guān)系：(R1/R2)2=L1/L2(2.24)2.柱溫的選擇對分離度影響很大，經(jīng)常是條件選擇的關(guān)鍵。選擇的基本原則是：在使最難分離的組分有符合要求的分離度的前提下，盡可能采用較低柱溫，但以保留時間適宜及不拖尾為度。低柱溫可增大分配系數(shù)，增加選擇性，降低Dg，減少固定液流失，延長柱壽命及降低檢測本底。但柱溫降低，液相傳質(zhì)阻抗增加，而使峰擴張，太低則拖尾，故以不拖尾為度。可根據(jù)樣品沸點來選擇柱溫。分離高沸點樣品(300～400℃)，柱溫可比沸點低100～150℃。分離沸點<300℃的樣品，柱溫可以在比平均沸點低50℃至平均沸點的溫度范圍內(nèi)。對于寬沸程樣品(混合物中高沸點組分與低沸點組分的沸點之差稱為沸程)，選擇一個恒定柱溫常不能兼顧兩頭，需采取程序升溫方法。圖2-l8是程序升溫與恒定柱溫色譜對比圖。可以看出程序升溫改善了復雜成分樣品的分離效果，使各成分都能在較佳的溫度下分離。程序升溫還能縮短分析周期，改善峰形，提高檢測靈敏度。3.載氣的選擇載氣的選擇從三方面考慮：對峰擴張、柱壓降及對檢測器的靈敏度影響，簡要歸納如下：載氣采用低線速時，宜用氮氣為載氣(Dg小)；高線速時宜用氫氣(粘度小)。色譜柱較長時，在柱內(nèi)產(chǎn)生較大的壓力降，此時采用粘度低的氫氣較合適。H2最佳線速度為10～12cm/s；N2為7～10cm/s。通常載氣流速(Fc)可在20～80m1/min內(nèi)，通過實驗確定最佳流速，以獲得高柱效。但為縮短分析時間，載氣流速常高于最佳流速。4.其它條件的選擇(1)氣化室溫度：氣化室溫度取決于樣品的揮發(fā)性、沸點及進樣量?？傻扔跇悠返姆悬c或稍高于沸點，以保證迅速完全氣化。但一般不要超過沸點50℃以上，以防樣品分解。對于穩(wěn)定性差的樣品可用高靈敏度檢測器，降低進樣量，(2)檢測室溫度：為了使色譜柱的流出物不在檢測器中冷凝而污染檢測器，檢測室溫度需高于柱溫。一般可高于柱溫30～50℃左右，或等于氣化室溫度。但若檢測室溫度太高，(3)進樣量：進樣量的大小直接影響譜帶的初始寬度，進樣量越大，譜帶初始寬度越寬，經(jīng)分離后的色譜峰寬也越寬，不利于分離。因此，在檢測器靈敏度足夠的前提下，盡量減少進樣量。通常以塔片數(shù)減少l0%作為最大允許進樣量。柱超載時峰變寬，柱效降低，峰不正常。一般來說，柱越長，管徑越粗，固定液配比越高，組分的k越大，則最大允許進樣量越大。對于填充柱，氣體樣品以0.1～1ml為宜，液體樣品進樣量應小于4μl(TCD)或小于1μl(FID)。毛細管柱需用分流器分流進樣，分流后的進樣量為填充柱的1/10～1/100。第六節(jié)定性與定量分析方法一、定性分析方法色譜定性分析是鑒定樣品中各組分是何種化合物。用氣相色譜法通常只能鑒定范圍已知的未知物，對范圍未知的混合物單純用氣相色譜法定性則很困難。常需與化學分析或其它儀器分析方法配合。1.利用保留值定性(1)已知物對照法：根據(jù)同一種物質(zhì)在同一根色譜柱上和相同的操作條件下保留值相同的原理進行定性。將適量的已知對照物質(zhì)加入樣品中，混勻，進樣。對比加入前后的色譜圖，若加入后某色譜峰相對增高，則該色譜組分與對照物質(zhì)可能為同一物質(zhì)。由于所用的色譜柱不一定適合于對照物質(zhì)與待定性組分的分離，即使為兩種物質(zhì)，也可能產(chǎn)生色譜峰疊加現(xiàn)象。為此，需再選一根與上述色譜柱極性差別較大的色譜柱，再進行實驗。若在兩根柱上該色譜峰都產(chǎn)生疊加現(xiàn)象，一般可認定二者是同一物質(zhì)。已知物對照法，對于已知組分的復方藥物和工廠的定型產(chǎn)品分析尤為實用。(2)利用相對保留值定性：測定各組分的相對保留值ris，與色譜手冊數(shù)據(jù)對比進行定性。相對保留值是待定性組分(i)與參考物質(zhì)(s)的調(diào)整保留值之比，即：(2·25)由于分配系數(shù)只決定于組分的性質(zhì)、柱溫與固定液的性質(zhì)，因而ris與固定液的用量、柱長、載氣流速及柱填充情況等無關(guān)。故氣相色譜手冊及文獻都登載相對保留值。利用此法時，先查手冊，根據(jù)手冊規(guī)定的實驗條件及參考物質(zhì)進行實驗。相對保留值定性法適用于沒有待定性組分的純物質(zhì)的情況，也可與己知物對照法相結(jié)合，先用此法縮小范圍，再用己知物進行對照。2.利用兩譜聯(lián)用定性氣相色譜的分離效率很高，但僅用色譜數(shù)據(jù)定性卻很困難。而紅外吸收光譜、質(zhì)譜及核磁共振譜等是鑒定未知物的有力工具，但卻要求所分析的樣品成分盡可能單一。因此，把氣相色譜儀作為分離手段，把質(zhì)譜儀、紅外分光光度計等充當檢測器，兩者取長補短，這種方法稱為色譜-光譜聯(lián)用，簡稱兩譜聯(lián)用。聯(lián)用方式有兩種，一種是聯(lián)合制成一件完整的儀器稱為聯(lián)用儀(在線聯(lián)用)。另外一種是收集某氣相色譜分離后的各純組分，而后用光譜儀器測定它們的光譜，進行定性，稱為兩譜聯(lián)用法，這屬于非在線聯(lián)用。目前比較成熟的在線聯(lián)用儀有：(l)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)：由于質(zhì)譜的靈敏度高(需樣量僅10-11～10-8g)、掃描時間快(0～1000質(zhì)量數(shù)，掃描時間可短于1s)，并能準確測定未知物的分子量，給出許多結(jié)構(gòu)信息。因此，氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用是目前最成功的聯(lián)用儀器。它在獲得色譜圖的同時，可得到對應于每個色譜峰的質(zhì)譜圖。根據(jù)質(zhì)譜對每個色譜組分進行定性。(2)氣相色譜-紅外光譜聯(lián)用：傅里葉變換紅外分光光度計(FTIR)掃描速度快(全波數(shù)掃描0.l至幾秒)，靈敏度高(信號可累加)，而且紅外吸收光譜的特征性強，因此氣相色譜-傅里葉變換紅外聯(lián)用儀(GC-FTIR)也是一種很好的聯(lián)用儀器，能對組分進行定性鑒定。但其靈敏度與圖譜自動檢索還不如GC-MS二、定量分析方法氣相色譜定量分析具有快速、靈敏、簡便、準確度高、精密度好等特點。定量分析的依據(jù)是在實驗條件恒定時峰面積與組分的量成正比，即。因此，必須準確測量峰面積和比例常數(shù)(稱為校正因子)。在各種操作條件(色譜柱、溫度、流速等)不變時，在一定進樣范圍內(nèi)，色譜峰的半峰寬與進樣量無關(guān)。因此正常峰也可用峰高代替峰面積求含量。(一)峰面積的計算峰面積測量的準確度直接影響定量結(jié)果，不同峰形的色譜峰必須采用不同的測量方法，才能得到較準確的結(jié)果。1.峰高乘半峰寬法根據(jù)流出曲線方程式已推導出正常色譜峰面積計算式，即：(2.26)用讀數(shù)顯微鏡測量半峰寬，其測量誤差可控制在1%以下。2.峰高乘平均峰寬法對于不對稱峰，用平均峰寬代替半峰寬，計算結(jié)果較準確。平均峰寬即峰高0.15倍處的峰寬(W0.15)和0.85倍處的峰寬(W0.85)的平均值。(2.27)3.自動求積法目前的氣相色譜儀都帶有數(shù)據(jù)處理機或色譜工作站，能自動打印或顯示出峰面積，一般為μV·s及峰高。這類儀器測量的準確度高(RSD為0.2%～1%)，線性范圍寬(>106)，操作簡便，而且可根據(jù)峰形確定切割方式與基線處理方法。(二)定量校正因子色譜定量分析的依據(jù)是被測組分量與檢測器的響應信號(峰面積或峰高)成正比。但是同一種物質(zhì)在不同類型檢測器上往往有不同的響應靈敏度；同樣，不同物質(zhì)在同一檢測器上的響應靈敏度也往往不同，即相同量的不同物質(zhì)產(chǎn)生不同值的峰面積或峰高。這樣，各組分峰面積或峰高的相對百分數(shù)并不等于樣品中各組分的百分含量。因此引入定量校正因子，校正后的峰面積或峰高可以定量地代表物質(zhì)的量。l.定量校正因子的定義定量校正因子分為絕對定量校正因子和相對定量校正因子。由上述峰面積與物質(zhì)量之間的關(guān)系可知：(2.28)稱為絕對定量校正因子，即單位峰面積所代表的物質(zhì)量。這是以峰面積表示的定量校正因子，也可以用峰高來表示定量校正因子。絕對定量校正因子的值隨色譜實驗條件而改變，因而很少使用。在實際工作中一般采用相對校正因子。其定義為某物質(zhì)i與所選定的基準物質(zhì)s的絕對定量校正因子之比，即：(2.29)上式中W以重量表示，因此fw又稱為相對重量校正因子，通常稱為校正因子(f)。本書均使用重量校正因子。如果物質(zhì)量用摩爾表示，則稱為相對摩爾校正因子，即(2.30)fwi和fmi都是無因次量，二者間的關(guān)系如下：(2.31)2.定量校正因子的測定氣相色譜的定量校正因子常可以從手冊和文獻查到，但是有些物質(zhì)的校正因子查不到，或者所用檢測器類型或載氣與文獻的不同，這時就需要自己測定。測定時，準確稱取待測校正因子的物質(zhì)i(純品)和所選定的基準物質(zhì)s，混合均勻后進樣，測得兩色譜峰面積Ai和As，用式(2.29)求得物質(zhì)i的相對重量校正因子。顯然，選擇不同的基準物質(zhì)測得的校正因子數(shù)值不同，氣相色譜手冊中數(shù)據(jù)常以苯或正庚烷為基準物質(zhì)。也可以根據(jù)需要選擇其他基準物質(zhì)，如采用歸一化法定量時，選擇樣品中某一組分為基準物質(zhì)。測定校正因子的條件(檢測器類型)應與定量分析的條件相同。還應該注意的是，使用熱導檢測器時，以氫氣或氦氣作載氣測得的校正因子相差不超過3%，可以通用，但以氮氣作載氣測得的校正因子與前二者相差很大，不能通用。而氫焰檢測器的校正因子與載氣性質(zhì)無關(guān)。(三)定量方法氣相色譜定量方法分為歸一化法、外標法、內(nèi)標法、內(nèi)標對比法及疊加法等。l.歸一化法(normalizationmethod)由于組分的量與其峰面積成正比，如果樣品中所有組分都能產(chǎn)生信號，得到相應的色譜峰，那么可以用如下歸一化公式計算各組分的含量。(2.32)若樣品中各組分的校正因子相近，可將校正因子消去，直接用峰面積歸一化進行計算。中國藥典用不加校正因子的面積歸一化法測定藥物中各雜質(zhì)及雜質(zhì)的總量限度。(2.33)例用5%甲基硅橡膠(SE-30)柱，柱溫l00℃，分