丙泊酚預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究

丙泊酚預(yù)處理對肝臟缺血再灌注損傷的作用及機(jī)制研究[研究目的]探索丙泊酚用于預(yù)防肝臟缺血再灌注損傷的可行性及其機(jī)制,探索一種新型有效副作用小的肝臟缺血再灌注損傷保護(hù)藥物。臨床肝臟手術(shù)常需要暫時(shí)阻斷肝臟供血,當(dāng)供血恢復(fù),大量自由基生成及脂質(zhì)過氧化等病理過程導(dǎo)致的肝臟I/R損傷是肝臟外科手術(shù)和肝臟移植術(shù)中面臨的一個(gè)亟待解決的問題。肝臟I/R損傷是導(dǎo)致肝移植失敗及多器官衰竭的主要原因之一,它是由于肝臟短暫缺血后恢復(fù)血流供應(yīng),大量有毒代謝產(chǎn)物及炎性介質(zhì)釋放導(dǎo)致嚴(yán)重的代謝紊亂,從而加重肝臟損傷及功能障礙的過程。肝臟I/R損傷是多種機(jī)制共同作用的結(jié)果,與ROS產(chǎn)生、炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡等機(jī)制密切相關(guān)。因此,合理選擇用藥,干預(yù)自由基產(chǎn)生、抑制炎癥反應(yīng)及細(xì)胞凋亡或可減輕肝臟I/R損傷。丙泊酚是臨床常用靜脈麻醉藥物,因其化學(xué)結(jié)構(gòu)與維生素E相似,被報(bào)道具有廣泛的抗氧化、抗炎及抗凋亡的效應(yīng)。大量文獻(xiàn)報(bào)道,丙泊酚預(yù)處理能通過多種分子機(jī)制,作用于多條信號通路而有效減輕1/R誘導(dǎo)的多器官損傷。然而,盡管有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道,丙泊酚在肝臟I/R損傷中的作用及其確切機(jī)制尚不明確,其保護(hù)效應(yīng)尚缺乏臨床試驗(yàn)佐證?；诖?本研究在前期文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上,結(jié)合體外實(shí)驗(yàn)、動物及臨床試驗(yàn),系統(tǒng)性的研究丙泊酚肝臟I/R損傷的保護(hù)效應(yīng),并初步探討其機(jī)制。[研究方法]1.丙泊酚預(yù)處理對缺氧/再灌注肝細(xì)胞的保護(hù)效應(yīng)及機(jī)制研究人體外培養(yǎng)肝細(xì)胞HL-7702分為對照組、I/R組(缺氧8h后恢復(fù)供氧培養(yǎng)建立I/R損傷模型)、丙泊酚組(細(xì)胞缺氧操作前30min加入不同濃度丙泊酚5、10、20、40μmol/L);觀測細(xì)胞恢復(fù)供氧后加入不同濃度丙泊酚及丙泊酚預(yù)處理后24h細(xì)胞變化情況:MTT法研究細(xì)胞增殖活性;Annexin-V/PI雙染流式細(xì)胞技術(shù)測定細(xì)胞凋亡,WesternBlot檢測凋亡相關(guān)蛋白Caspase-3及Bcl-2的表達(dá);JC-1熒光探針及細(xì)胞ATP含量測定評價(jià)細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)及功能的損傷;采用試劑盒及生化分析儀檢測細(xì)胞裂解產(chǎn)物氨基轉(zhuǎn)移酶評價(jià)肝細(xì)胞功能;測定細(xì)胞裂解產(chǎn)物SOD、MDA、CAT水平評價(jià)細(xì)胞抗氧化水平。2.丙泊酚對大鼠肝臟缺血/再灌注損傷的作用及機(jī)制研究Wistar大鼠平均分為對照組(n=10)、假手術(shù)(n=10,行剖腹手術(shù))、I/R組(n=10,腹腔手術(shù),肝臟血管夾閉90min后恢復(fù)供血,建立肝臟I/R損傷模型)、丙泊酚組(n=10,I/R建模前30分鐘給予50mg/kg丙泊酚腹腔內(nèi)注射)。其中對照組大鼠不做任何處理。假手術(shù)組大鼠注射戊巴比妥麻醉后,在無菌條件下進(jìn)行剖腹手術(shù),而后常規(guī)關(guān)閉腹腔。I/R組大鼠麻醉后,無菌條件下行剖腹術(shù),用無創(chuàng)動脈夾夾閉肝左葉與中葉血管,同時(shí)保留肝右葉與尾狀葉的血管、門靜脈及膽總管,造成約70%的血管阻塞,待缺血區(qū)肝葉顏色由鮮紅色變?yōu)榘导t色,表明肝臟缺血模型成功,持續(xù)夾閉約90min。而后取下無創(chuàng)動脈夾,恢復(fù)肝臟血流。6h后在無菌條件下進(jìn)行大鼠腹部縫合。丙泊酚組大鼠則按照50mg/kg腹腔內(nèi)注射丙泊酚,30分鐘后立即進(jìn)行無創(chuàng)動脈夾夾閉肝左葉與中葉血管,同時(shí)保留肝右葉與尾狀葉的血管、門靜脈及膽總管,其余操作同I/R組。24h后測定大鼠血清AST、ALT、ALB(白蛋白)及TBIL(總膽紅素)水平,評價(jià)大鼠肝臟功能;肝組織切片H&E染色及電鏡觀察肝臟組織損傷程度;取大鼠肝臟組織勻漿,測定MDA、SOD、CAT濃度評價(jià)大鼠抗氧化水平;檢測肝臟組織ATP含量,評價(jià)大鼠能量代謝水平;測定肝組織勻漿中炎癥因子TNF-α、IL-6、IL-10及TGF-β的濃度,研究大鼠肝臟炎癥反應(yīng);TUNEL染色、WesternBlot測定凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),檢測肝臟組織細(xì)胞凋亡情況。3.丙泊酚對肝移植患者缺血再灌注損傷的影響研究選取山東大學(xué)山東省立醫(yī)院肝膽外科2017年5月-2018年5月行肝臟移植術(shù)患者共42例,其中術(shù)中肝臟缺血前予以丙泊酚處理的患者18例(PPC),未進(jìn)行丙泊酚處理的患者24例。再灌注后3h取移植肝組織,H&E染色觀察肝臟病理;于術(shù)前及術(shù)后不同時(shí)間點(diǎn)檢測患者血清氨基轉(zhuǎn)移酶、總凝血酶原時(shí)間(PT)及總膽紅素(TBIL)水平,評價(jià)患者肝功能;檢測血清MDA及H202水平,評價(jià)患者氧化應(yīng)激水平。[結(jié)果]1.觀測丙泊酚預(yù)處理對細(xì)胞的影響,結(jié)果顯示細(xì)胞缺氧8h再恢復(fù)供氧培養(yǎng)24h后,其增殖活性顯著低于對照組(分別約降低17%),提示缺氧/再灌注能顯著抑制體外培養(yǎng)肝細(xì)胞的增殖活性。不同濃度(5、10、20、40(μmol/L)的丙泊酚預(yù)處理也顯著提高缺氧/再灌注誘導(dǎo)的HL-7702細(xì)胞增殖活性的降低(約提高10%-17%,p<0.05)。機(jī)制上發(fā)現(xiàn),丙泊酚通過抑制促凋亡蛋白Caspase-3的表達(dá)并促進(jìn)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá),一定程度減輕缺氧/再灌注誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡(細(xì)胞總凋亡率約降低3%,p>0.05)。丙泊酚預(yù)處理能顯著逆轉(zhuǎn)缺氧/再灌注誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體膜電位的下降(p<0.01),促進(jìn)ATP生成(與I/R組比較提高2-3.5倍,p<0.05),呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。短暫缺氧/再灌注能顯著提高HL-7702細(xì)胞ALT(1.8倍)及AST水平(1.47倍,p<0.01),而不同濃度丙泊酚預(yù)處理能有效降低缺氧/再灌注細(xì)胞裂解液AST及ALT濃度,具有明顯的劑量依賴性(p<0.05)。缺氧/再灌注能加重肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化的程度(MDA水平約升高2.7倍,p<0.001),下調(diào)抗氧化酶SOD(2.1倍)及CAT(2.3倍)的水平,而不同濃度丙泊酚預(yù)處理能有效逆轉(zhuǎn)缺氧/再灌注引起的細(xì)胞抗氧化水平的下降(p<0.05)。2.肝臟I/R處理能顯著誘導(dǎo)大鼠血清ALT及AST水平的升高(分別約升高5.1倍及2.6倍,p<0.001),手術(shù)前腹腔注射丙泊酚能顯著降低I/R誘導(dǎo)的血清ALT及AST水平的升高(與I/R組比較,分別約降低1.6倍及1.7倍,p<0.01),降低大鼠血清ALB水平(約降低30%,p<0.01)并促進(jìn)大鼠血清TBIL水平的升高(約升高1.67倍,p<0.01),而丙泊酚能有效逆轉(zhuǎn)肝臟I/R誘導(dǎo)的大鼠肝功能障礙(p<0.05)。H&E染色及電鏡顯示丙泊酚預(yù)處理可減輕由缺血再灌注導(dǎo)致的肝臟組織受損程度。I/R處理加重肝臟組織內(nèi)部的脂質(zhì)過氧化程度(MDA升高1.87倍,p<0.01),抑制SOD及CAT水平(分別約降低1.67及2.9倍,p<0.01),丙泊酚能有效逆轉(zhuǎn)肝臟I/R誘導(dǎo)的大鼠抗氧化水平的降低(與I/R組比較,MDA水平降低28%,SOD及CAT水平分別升高1.52及1.95倍,p<0.01)。I/R組大鼠肝臟組織中TNF-α及IL-6含量顯著高于對照組(分別約升高3.38及3.77倍,p<0.01),而IL-10及TGF-β的濃度顯著低于對照組(分別約降低3.14及2.43倍,p<0.01),丙泊酚預(yù)處理能有效逆轉(zhuǎn)上述炎癥因子的分泌(p<0.01)。丙泊酚預(yù)處理能通過促進(jìn)caspase-3蛋白表達(dá)同時(shí)抑制Bcl-2蛋白表達(dá)而減輕I/R誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡。3.丙泊酚預(yù)處理能顯著減輕I/R誘導(dǎo)的肝移植患者肝臟的損傷(與NPC組比較,PPC組患者肝臟病理評分約降低19.2%,p<0.01)。手術(shù)結(jié)束、術(shù)后6h、24h、2dPPC組患者血清ALT及AST水平顯著低于NPC組(p<0.05),術(shù)后24h內(nèi)PPC組患者PT顯著低于NPC組(p<0.05),術(shù)后6h、2d、3d、5dPPC組患者TBIL也顯著低于NPC組(p<0.05)。灌注后3h、術(shù)后1天,PPC組患者血清MDA水平顯著低于NPC組(p<0.01),灌注后3hPPC組患者血清H202水平也顯著低于NPC組(p<0.01)。[結(jié)論]1.丙泊酚預(yù)處理能通過抑制肝臟I/R誘導(dǎo)的細(xì)胞線粒體損傷,促進(jìn)能量代謝恢復(fù),上調(diào)細(xì)胞抗氧化水平,減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng),調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá),同時(shí)減輕肝臟炎癥反應(yīng),從而促進(jìn)肝細(xì)胞增殖,降低細(xì)胞凋亡,最終減輕肝臟損傷并促進(jìn)肝臟功能恢復(fù)